CN103805552B - 一株生物合成稀少糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
一株生物合成稀少糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一株生物合成稀少糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法和应用，公开了一株谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10。实验证明，该菌株可以多种羟基醛和葡萄糖为底物，发酵合成稀少酮糖和脱氧酮糖，如可以甲醛和葡萄糖为底物合成D-赤藓酮糖，以羟基乙醛和葡萄糖为底物合成L-木酮糖，以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，以L-甘油醛和葡萄糖为底物合成L-果糖，以D-赤藓糖和葡萄糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚糖和3R,4R,5R,6R-庚糖。因此，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10可应用于全细胞发酵生产稀少酮糖及脱氧酮糖领域中，生产的稀少酮糖及脱氧酮糖将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及利用基因工程技术和微生物学方法制备的一株谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法，以及将其用于发酵生产稀少酮糖和脱氧酮糖中的应用。
背景技术
稀少糖（RareSugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义）。尽管稀少糖在自然界中含量极少，但其具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，它们可以作为添加剂改善食品的理化性质，提高食品的生理功能和保健功能。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要的生理活性作用，还可用于修饰药物或活性物质从而优化其功能活性。
近年来，科学家致力于研究的稀少糖主要有D-阿洛糖（D-Allose）、D-阿洛酮糖（D-阿洛酮糖）、D-塔格糖（D-Tagatose）等。阿洛酮糖（果糖C-3差向异构体）和塔格糖（果糖C-4的差向异构体）是两种重要的稀少糖。研究人员分别证实了D-阿洛酮糖、D-塔格糖是零或低热量、食用安全的填充型甜味剂，它们对胰岛素没有依赖性，可改善糖尿病患者的饮食，适合于糖尿病患者食用，是低热量功能性的理想蔗糖替代品（MatsuoT,SuzukiH,HashiguchiM,etal.D-psicoseisararesugarthatprovidesnoenergytogrowingrats.J.NutrSciVitaminol(Tokyo).2002.48(1):77-80.）。美国食品与药品管理局（FDA）在2003年就将D-塔格糖列为安全食品（GRAS）添加剂。阿洛酮糖的安全性及其在食品中的应用已被日本厚生省批准，2011年3月完成了阿洛酮糖的商标注册，并正式申请了特定保健食品。
国际市场对这类新型稀少糖的应用越来越关注，市场需求量不断增大。然而，稀少糖在自然界中含量低、且难以化学合成，传统的化学合成法已不能满足大规模的生产需要。因此，从来源于自然界中的丰富原料通过生物转化的方法合成稀少糖，实现规模化生产是稀少糖广泛应用的基础。日本的研究学者Izumori于2002年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring方法，该方法中利用酮糖差相异构酶(Ketoseepimerase)、醛糖异构酶(Aldoseisomerases)和多元醇脱氢酶(Polydehydrogenase)进行所有单糖及糖醇之间的相互转化（IzumoriK.Bioproductionstrategiesforrarehexoses.Naturwissenschaften,2002,89:120-124.）。利用天然植物成分或食品工业的加工副产物淀粉、乳糖为原料经过现有成熟工艺获得木糖、果糖、半乳糖，再通过各种酶的作用获得稀少糖（GranstrmT.B,TakataG,TokudaM,etal.Izumoring:anovelandcompletestrategyforbioproductionofraresugars.JBiosci.Bioeng.2004.97(2):89-94.）。目前，生物转化法合成D-阿洛酮糖主要是通过酮糖3位差向异构酶完成，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。该酮糖3位差向异构酶酶系根据其作用最适底物分为：D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose3-epimerase，DTEase）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose3-epimerase，DPEase），它们的催化效率为20-32％。此外，来源于根癌农杆菌（A.tumefaciens）的DPE（D-阿洛酮糖3-差向异构酶）和菊苣假单胞菌（P.cichorii）的DTE（D-塔格糖3-差向异构酶）还可以将D-山梨糖转化为D-塔格糖（KimHJ,HyunEK,KimYS,LeeYJ,OhDK(2006a)CharacterizationofanAgrobacteriumtumefaciensD-psicose3-epimerasethatconvertsD-fructosetoD-psicose.ApplEnvironMicrobiol72:981–985）。L-果糖作为新型甜味剂，在食品行业中同样受到广泛关注，L-果糖可以通过化学手性合成的方法由L-山梨糖转化获得，但是其合成步骤繁琐且立体选择性较低，此外，L-果糖还可以通过生物转化的方法获得，即由L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（RhaD）和酸性磷酸酶（AP）经体外催化获得（DirkFranke,TimothyMachajewski,Che-ChangHsu,Chi-HueyWong.One-PotSynthesisofL-FructoseUsingCoupledMultienzymeSystemsBasedonRhamnulose-1-phosphateAldolase.J.Org.Chem.2003.68.6828-6831）。
C-C键的不对称合成被认为是有机合成领域最具挑战性的课题之一，在体内C-C键的不对称合成主要通过连接酶来完成，醛缩酶是连接酶的一种，其催化的羟醛缩合反应是C-C键不对称合成的有效工具之一（BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403）。目前，已经报道的醛缩酶包括四种：磷酸二羟丙酮/二羟丙酮依赖的醛缩酶、乙醛依赖型的醛缩酶、丙酮酸依赖的醛缩酶、甘氨酸依赖的醛缩酶（BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403）。其中，磷酸二羟基丙酮（DHAP）依赖型醛缩酶应用最广，该类醛缩酶催化供体DHAP与受体醛发生缩合反应，所得产物具有两个新的立体中心，基于此DHAP依赖型醛缩酶成功合成了多种稀有单糖及其衍生物（BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403）。L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（RhaD）催化DHAP和甘油醛获得（3R,4S）构型的产物，被报道用于体外合成D-山梨糖、D-阿洛酮糖及L-果糖（LiZ,CaiL,QiQ,WangP.EnzymaticsynthesisofD-sorboseandD-psicosewithaldolaseRhaD:Effectofacceptorgurationonenzymestereoselectivity.Bioorg.Med.Chem.Lett.2011).21.7081–7084）。
目前，与D-山梨糖、D-阿洛酮糖及L-果糖生产相关的国外专利主要通过异构酶体外转化或者通过含有异构酶的静息细胞转化来实现，该方法操作复杂、催化效率低（MarutaKazuhiko,YamamotoKozo,NishimotoTomoyuki,ChaenHiroto,NakadaTetsuya.Ketose3-epimerase,itspreparationanduses.US8008058,2011.08.30）。与体外生物转化相比，通过全细胞发酵的方式生产稀少糖具有显著优势。但是，通过构建重组菌株合成D-山梨糖、D-阿洛酮糖及L-果糖的专利，国内外尚未有相关报道。随着生物柴油产业的发展，产生了大量副产物甘油，甘油可以通过化学催化或者生物催化一步氧化生成D-甘油醛或者L-甘油醛，这使得甘油醛的价格越来越低廉（GervásioPaulodaSilva,MatthiasMack,JonasContiero.Glycerol:Apromisingandabundantcarbonsourceforindustrialmicrobiology.BiotechnologyAdvances.2009.27.30-39）。因此，通过基因工程和代谢工程的方法和思路构建微生物重组菌株，再以葡萄糖和甘油醛为底物发酵生产稀少糖是本发明的一个中心思路。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于发酵生产稀少酮糖和脱氧酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的工程菌株。
本发明所提供的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株的名称为SY10，该菌株已于2014年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8747。
本发明另一目的在于提供一种构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10的方法。
构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747的方法，包括以下步骤：
1）敲除谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032中的磷酸丙糖异构酶基因，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY6；
2）向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
所述步骤1）中构建无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6的具体方法包括以下步骤：
1.1构建磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip，其物理图谱如图2A所示，具体方法为：分别PCR扩增谷氨酸棒杆菌ATCC13032tpi基因上游区域tpi’（964bp，序列表中序列1）和tpi基因下游区域tpi’’（861bp，序列表中序列2），tpi’和tpi’’有42bp的同源区域（即tpi’自5’端第923-964位碱基，tpi’’自5’端第1-42位碱基），再以上述两个基因扩增产物为模板PCR扩增由tpi基因上游区域tpi’和tpi基因下游区域tpi’’组成的融合基因tpi’-tpi’’（1653bp，序列表中序列3），然后将融合基因tpi’-tpi’’连接入载体pK18mobsacB中，得到磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体，命名为pK18tip，其核苷酸序列如序列表中序列4所示；
1.2向谷氨酸棒杆菌ATCC13032中导入磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6。
所述步骤2）中构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY10的具体方法包括以下步骤：
2.1构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，其物理图谱如图2B所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因（825bp，序列表中序列5）和去磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列6）、来源于pVWEx2的tac启动子（307bp，序列表中序列7，作用是在基因YqaB前再添加一个启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成且的融合基因RhaD-tac-YqaB（1727bp，序列表中序列8），然后将融合基因RhaD-tac-YqaB连接入载体pVWEx2中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pVRTY，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；
2.2向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中导入携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY10。
本发明还一目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747在合成稀少酮糖和脱氧酮糖中的应用。
该应用为用谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10合成稀少酮糖的方法，即在发酵培养基中添加受体醛，受体醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10携带的醛缩酶和去磷酸化酶的作用下合成相应的稀少酮糖和脱氧酮糖。
具体的，SY10可以甲醛和葡萄糖为底物合成D-赤藓酮糖，可以羟基乙醛和葡萄糖为底物合成L-木酮糖，可以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，可以L-甘油醛和葡萄糖为底物合成L-果糖，或可以D-赤藓糖和葡萄糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚糖和3R,4R,5R,6R-庚糖。
采取以上技术方案，本发明提供了一株谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10及其构建方法和应用。实验证明，该菌株可以多种羟基醛和葡萄糖为底物，发酵合成稀少酮糖和脱氧酮糖，即在发酵培养基中添加受体醛，受体醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10携带的醛缩酶和去磷酸化酶的作用下可合成相应的稀少酮糖和脱氧酮糖，如可以甲醛和葡萄糖为底物合成D-赤藓酮糖，以羟基乙醛和葡萄糖为底物合成L-木酮糖，以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，以L-甘油醛和葡萄糖为底物合成L-果糖，以D-赤藓糖和葡萄糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖。因此，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10可应用于全细胞发酵生产稀少酮糖及脱氧酮糖领域中，生产的稀少酮糖及脱氧酮糖将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10和用其合成稀少酮糖的技术路线
图2A为磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip的物理图谱
图2B为携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY的物理图谱
图3为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10以D-甘油醛为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖的高效液相色谱分析结果
图4为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10以L-甘油醛为底物合成L-果糖的高效液相色谱分析结果
图5为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10以甲醛为底物合成D-赤藓酮糖的高效液相色谱分析结果
图6为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10以羟基乙醛为底物合成L-木酮糖的高效液相色谱分析结果
图7为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10以赤藓糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖的高效液相色谱分析结果
具体实施方式
本发明具体提供一株用于生产稀少酮糖和脱氧酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10及其构建方法。还具体提供用该谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10合成稀少酮糖的方法。
本发明的技术路线如图1所示，包括以下三个步骤：（1）谷氨酸棒杆菌通过糖酵解途径代谢葡萄糖生成磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛，因此，敲除磷酸丙糖异构酶基因（tpi）可避免将磷酸二羟丙酮（DHAP）转化为G3P（3磷酸甘油醛），从而使胞内磷酸二羟丙酮（DHAP）得到积累；（2）在谷氨酸棒杆菌磷酸丙糖异构酶基因（tpi）缺失型菌株中引入外源醛缩酶如L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶、D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶或D-塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因（这些醛缩酶基因选择其中的一个即可，通过改变醛缩酶基因的种类进而合成不同的稀少酮糖。同时对于同一种醛缩酶，通过改变底物的种类也可以得到不同的稀少酮糖。）和去磷酸化酶如果糖-1-磷酸酶基因，组装成具有醛缩途径（即携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因）的重组谷氨酸棒杆菌；（3）在发酵培养基中添加受体醛，受体醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌工程菌株携带的醛缩酶和去磷酸化酶的作用下合成相应的稀少酮糖和脱氧酮糖。
具体来讲，本发明谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10的构建方法，可包括以下步骤：
1）敲除谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032中的磷酸丙糖异构酶基因，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY6；
构建无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6的包括以下过程：
1.1构建磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip，其物理图谱如图2A所示，具体方法为：分别PCR扩增谷氨酸棒杆菌ATCC13032tpi基因上游区域tpi’（964bp，序列表中序列1）和tpi基因下游区域tpi’’（861bp，序列表中序列2），tpi’和tpi’’有42bp的同源区域（即tpi’自5’端第923-964位碱基，tpi’’自5’端第1-42位碱基），再以上述两个基因扩增产物为模板PCR扩增由tpi基因上游区域tpi’和tpi基因下游区域tpi’’组成的融合基因tpi’-tpi’’（1653bp，序列表中序列3），然后将融合基因tpi’-tpi’’连接入载体pK18mobsacB中，得到磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体，命名为pK18tip，其核苷酸序列如序列表中序列4所示；
1.2向谷氨酸棒杆菌ATCC13032中导入磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6。
2）向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY10包括以下过程：
2.1构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，其物理图谱如图2B所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（RhaD，是一种醛缩酶，它可以以不同的底物合成相应的稀少酮糖，例如以D-甘油醛合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，以L-甘油醛为底物合成L-果糖）基因（825bp，序列表中序列5）和去磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列6）、来源于pVWEx2的tac启动子（307bp，序列表中序列7，作用是在基因YqaB前添加tac启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因RhaD-tac-YqaB（1727bp，序列表中序列8），然后将融合基因RhaD-tac-YqaB连接入载体pVWEx2中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pVRTY，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；
2.2向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中导入携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
本发明的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10可用于合成不同的稀少酮糖和脱氧酮糖，即在发酵培养基中添加受体醛，受体醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10携带的醛缩酶和去磷酸化酶的作用下合成相应的稀少酮糖和脱氧酮糖。
具体来讲，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10，可以甲醛和葡萄糖为底物合成D-赤藓酮糖，以羟基乙醛和葡萄糖为底物合成L-木酮糖，以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，以L-甘油醛和葡萄糖为底物合成L-果糖，或以D-赤藓糖和葡萄糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖。
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor）。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由大连宝生物公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10
谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10的构建，包括以下步骤：
一、敲除谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032中的磷酸丙糖异构酶基因，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY6。
1、构建磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip
1.1根据Genbank谷氨酸棒杆菌ATCC13032tpi基因（Genbank号：1019554）的上游区域tpi’（964bp，序列表中序列1）和tpi基因下游区域tpi’’（861bp，序列表中序列2）的核苷酸序列设计引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6，其中引物5和引物6中带有XbaI和HindIII酶切位点，引物7和引物8为PCR验证引物。引物序列如下：
引物1：5’-CACGCGAAACCTCCAAGGACGA-3’
引物2：5’-CTTTAAGCAACGCTCGCAGCGATAAGTGGCTTACGTGCCATG-3’；
引物3：5’-CATGGCACGTAAGCCACTTATCGCTGCGAGCGTTGCTTAAAGTACAG-3’
引物4：5’-CAGCCCTACTTCGATCTCGTCC-3’；
引物5：5’-GATGGTCTAGACGGCGCATTCGTTTCTGACGGCTT-3’
引物6：5’-ACTCAAGCTTCTGCCACAAAATGGTGATGCGACG-3’。
引物7：5’-TTTAAAGACAGCGACAAATTCGAT-3’
引物8:5’-GTAGCCATCTTCAGTTCCAGT-3’
1.2以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，通过引物1和引物2PCR扩增tpi基因上游区域tpi’（964bp，序列表中序列1），通过引物3和引物4PCR扩增tpi基因下游区域tpi’’（861bp，序列表中序列2），引物2和引物3有42bp的同源区域（即tpi’自5’端第923-964位碱基，tpi’’自5’端第1-42位碱基），可用于基因片段tpi’和tpi’’的融合。
1.3以基因片段tpi’和tpi’’的PCR扩增产物为模板，通过引物5和引物6PCR扩增由tpi基因上游区域tpi’和tpi基因下游区域tpi’’组成的融合基因tpi’-tpi’’（1653bp，序列表中序列3）。
1.4用限制性内切酶XbaI和HindIII同时酶切融合基因tpi’-tpi’’和载体pK18mobsacB（A,TauchA,JagerW,KalinowskiJ,ThierbachG,PuhlerA.1994.Smallmobilizablemulti-purposecloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19:selectionofdefineddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamicum.Gene145:69-73），运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pK18mobsacB和融合基因tpi’-tpi’’进行连接，得到磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体，命名为pK18tip，其物理图谱如图2A所示，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。
2、获得无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6
向谷氨酸棒杆菌ATCC13032中导入磷酸丙糖异构酶基因（tpi）敲除载体pK18tip，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6，具体过程如下：
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032电转感受态细胞（100ul），将基因敲除载体pK18tpi（10ug）电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC13032电转感受态细胞中，46℃热激6min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有卡那抗生素（25ug/mL）的固体培养基BHIS（脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L）中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，用引物7和引物8进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得387bpDNA片段（此DNA片段为载体pK18-tip中sacB基因的部分片段）的为阳性克隆。
2.3挑取阳性克隆，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是在于通过蔗糖致死性，筛选卡那缺失克隆。
2.4从LB蔗糖平板上挑取若干菌落，用引物5和引物6再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1653DNA片段（此DNA片段为tpi’-tpi’’基因片段）的为阳性克隆。
2.5保存经PCR验证正确的菌株，即无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY6。
二、向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
1、构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY
1.1根据Genbank中大肠杆菌MG1655（购自Invitrogen）的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因（Genbank号：948401，845bp，序列表中序列5）和去磷酸化酶（YqaB）基因（Genbank号：945776，581bp，序列表中序列6），设计引物9和引物10、引物13和引物14、引物15和引物16，根据Genbank中载体pVWEx2中tac启动子（307bp，序列表中序列7，作用是在基因YqaB前添加启动子）的序列，设计引物11和引物12，引物15和引物13含有RBS位点序列（AAAGGAGGACAACC），引物15和引物16带有XbaI和PstI酶切位点，引物序列如下：
引物9：5’-GGGTCGTGCATCCGACAACACC-3’
引物10：5’-GGCGAAGCGGCATTTACGTTTTACAGCGCCAGCGCACTGG-3’；
引物11：5’-CCAGTGCGCTGGCGCTGTAAAACGTAAATGCCGCTTCGCC-3’
引物12：5’-CGCTCGTACATGGTTGTCCTCCTTTTCATGGTCCTGTTTCCTGTG-3’；
引物13：5’-GGAAACAGGACCATGAAAAGGAGGACAACCATGTACGAGCGTTATGCAGGTTTA-3’
引物14：5’-GGCATCCAGCTTAATAATAGCGT-3’；
引物15：5’-GACAACTGCAGAAAGGAGGACAACCATGCAAAACATTACTCAGTCCTGG-3’
引物16：5’-CTAGCTCTAGAGCTTATCACAGCAAGCGAACATCCAC-3’。
1.2以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物9和引物10PCR扩增基因L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（RhaD）基因（845bp，序列表中序列5），通过引物13和引物14PCR扩增去磷酸化酶（YqaB）基因（581bp，序列表中序列6）。
1.3以载体pVWEx2（无Genbank号，但记载于文献WendischV(1997)PhysiologischeundNMR-spektroskopischeUntersuchungenzurinvivo-zentralerStoffwechselwegeimWildstammundinrekombinantenvonCorynebacteriumglutamicum.Dissertation,ForschungszentrumJülichGmbH,Germany中）为模板，通过引物11和引物12PCR扩增启动子tac启动子（307bp，序列表中序列7，作用是在基因YqaB前添加启动子）。
1.4引物10和引物11有40bp的同源区
（GGCGAAGCGGCATTTACGTTTTACAGCGCCAGCGCACTGG），引物12和引物13有41bp的同源区（GGAAACAGGACCATGAAAAGGAGGACAACCATGTACGAGCG），可用于进行融合PCR，并且在引物15和引物13含有RBS位点序列（AAAGGAGGACAACC），引物15和引物16带有XbaI和PstI酶切位点，以三个PCR产物（RhaD，tac，YqaB）为模板，用引物15和引物16PCR扩增得到由RhaD、tac、YqaB三个基因组成含有XbaI和PstI酶切位点的融合基因PstI-RhaD-tac-YqaB-XbaI（1739bp，序列表中序列9）。
1.5用限制性内切酶PstI和XbaI同时酶切融合基因PstI-RhaD-tac-YqaB-XbaI和载体pVWEx2（该载体记载于文献WendischV(1997)PhysiologischeundNMR-spektroskopischeUntersuchungenzurinvivo-zentralerStoffwechselwegeimWildstammundinrekombinantenvonCorynebacteriumglutamicum.Dissertation,ForschungszentrumJülichGmbH,Germany中），运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pVWEx2和融合基因PstI-RhaD-tac-YqaB-XbaI进行连接，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pVRTY，其物理图谱如图2B所示，其核苷酸序列如序列表中序列10所示，其中RhaD-tac–YqaB片段的核苷酸序列对应序列表中序列8（1727bp），在序列10中为19bp-1746bp对应的部分。
2、获得携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY10
向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中导入携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY10，过程如下：
2.1制备谷氨酸棒杆菌SY6电转感受态细胞（100ul），将携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY（10ug）电转化进入谷氨酸棒杆菌SY6电转感受态细胞中，46℃热激6min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有卡那抗生素（25ug/mL）的固体培养基BHIS（脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L）中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，用引物7和引物8进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得387bpDNA片段（此DNA片段为载体pK18-tip中sacB基因的部分片段）的为阳性克隆。
2.3挑取阳性克隆，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是消除卡那抗性。
2.4从LB蔗糖平板上挑取若干菌落，用引物5和引物6再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1653bpDNA片段（此DNA片段为tpi’-tpi’’基因片段）的为阳性克隆。
2.5保存经PCR验证正确的菌株，即携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
该谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株的名称为SY10，该菌株已于2014年01月20日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号（邮政编码100101）的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8747。
实施例2、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10在生产稀少酮糖中的应用
一、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10在D-阿洛糖和D-山梨糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的培养及诱导
选用CGXII培养基（配方：(NH4)2SO4(5g/L),urea(5g/L),KH2PO4(1g/L),K2HPO4(1g/L),MgSO4·7H2O(0.25g/L),CaCl2(10mg/L),FeSO4·7H2O(10mg/L),MnSO4·H2O(0.1mg/L),ZnSO4·7H2O(1mg/L),CuSO4·5H2O(0.2mg/L),NiCl2·6H2O(20μg/L),生物素(0.4mg/L),MOPS(42g/L)(pH7.4))，培养基中添加葡萄糖（10g/L）和四环素（12.5mg/L），在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mM，降低摇床转速为120rmp，诱导约12h。
2、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的收集和浓缩
将诱导得到的谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10菌液（100mL），4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用CGXII培养基洗涤菌液两次，最终用CGXII培养基浓缩菌液至10mL。
3、D-阿洛糖和D-山梨糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和1％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的D-甘油醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：HitachiGL-C611，流动相：NaOH（0.1mM），流速：1mL/min，柱温：60℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-阿洛酮糖和D-山梨糖纯品为标准品，上样量为20μl。
结果如图3（（a）表示D-山梨糖标品；（b）表示D-阿洛酮糖标品；（c）表示发酵液）所示，可以看出，经过48小时反应，发酵液中D-阿洛糖的浓度为6.6g/L，D-山梨糖的浓度为5.04g/L，D-甘油醛转化率为58.2％，表明谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10可以以D-甘油醛为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖。
二、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10在L-果糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的培养及诱导
与步骤一相同。
2、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、L-果糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和终浓度为10g/L的L-甘油醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。以Sigma公司生产的L-果糖纯品为标准品。
结果如图4（（a）表示L-果糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过48小时反应，发酵液中L-果糖的浓度为13.4g/L，L-甘油醛转化率为67％，表明谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10可以以L-甘油醛为底物合成单一产物L-果糖，而且合成能力高于以D-甘油醛为底物。
三、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10在D-赤藓酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的培养及诱导
与步骤一相同。
2、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、D-赤藓酮糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和终浓度为3g/L的甲醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。以Sigma公司生产的D-赤藓酮糖纯品为标准品。
结果如图5（（a）表示D-赤藓酮糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过48小时反应，发酵液中D-赤藓酮糖的浓度为10.4g/L，甲醛转化率为87％，表明谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10可以以甲醛为底物合成单一产物D-赤藓酮糖。
四、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10在L-木酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的培养及诱导
与步骤一相同。
2、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、L-木酮糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和终浓度为6g/L的羟基乙醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。以Sigma公司生产的L-木酮糖纯品为标准品。
结果如图6（（a）表示L-木酮糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过48小时反应，发酵液中L-木酮糖的浓度为13.0g/L，羟基乙醛转化率为93％，表明谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10可以以羟基乙醛为底物合成单一产物L-木酮糖。。
五、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10在3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的培养及诱导
与步骤一相同。
2、谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和终浓度为12g/L的赤藓糖进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。以本实验室合成的3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖纯品为标准品。
结果如图7（（a）表示3R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过48小时反应，发酵液中3R,4S,5R,6R-庚酮糖的浓度为11.62g/L，3R,4R,5R,6R-庚酮糖的浓度为5.81g/L，赤藓糖转化率为83％，表明谷氨酸棒杆菌工程菌株SY10可以以D-赤藓糖为底物合成两种7碳产物R,4S,5R,6R-庚酮糖和3R,4R,5R,6R-庚酮糖。。
使用本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10可以发酵生产C4,C5,C6,C7稀少酮糖，此外，谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10还可以多种醛为底物合成对应的脱氧酮糖。因此，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY10可应用于全细胞发酵生产稀少酮糖及脱氧酮糖领域中，具有广阔的应用前景和竞争力。
Claims (10)
1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10，保藏编号为CGMCCNo.8747。
2.一种构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747的方法，包括以下步骤：
1)敲除谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032中的磷酸丙糖异构酶基因，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY6；
2)向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到具有醛缩途径的携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY10。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中构建无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6的具体方法包括以下步骤：
1.1构建磷酸丙糖异构酶基因(tpi)敲除载体pK18tip，具体方法为：分别PCR扩增谷氨酸棒杆菌ATCC13032的tpi基因上游区域tpi’和tpi基因下游区域tpi”，tpi’基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，tpi”基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，tpi’和tpi”有42bp的同源区域，即tpi’自5’端第923-964位碱基，tpi”自5’端第1-42位碱基，再以上述两个基因扩增产物为模板PCR扩增由tpi基因上游区域tpi’和tpi基因下游区域tpi”组成的融合基因tpi’-tpi”，tpi’-tpi”基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，然后将融合基因tpi’-tpi”连接入载体pK18mobsacB中，得到磷酸丙糖异构酶基因(tpi)敲除载体，命名为pK18tip，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
1.2向谷氨酸棒杆菌ATCC13032中导入磷酸丙糖异构酶基因(tpi)敲除载体pK18tip，得到无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中构建具有醛缩途径的携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌SY10的具体方法包括以下步骤：
2.1构建携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶(YqaB)基因、来源于pVWEx2的tac启动子，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，去磷酸化酶(YqaB)基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成且的融合基因RhaD-tac-YqaB，RhaD-tac-YqaB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，然后将融合基因RhaD-tac-YqaB连接入载体pVWEx2中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pVRTY，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；
2.2向无磷酸丙糖异构酶活性的重组谷氨酸棒杆菌SY6中导入具有醛缩途径的携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pVRTY，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌SY10。
5.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747在合成稀少酮糖和脱氧酮糖中的应用，即在发酵培养基中添加受体醛，受体醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮(DHAP)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10携带的醛缩酶和去磷酸化酶的作用下合成相应的稀少酮糖和脱氧酮糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747可以甲醛和葡萄糖为底物合成D-赤藓酮糖。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747可以羟基乙醛和葡萄糖为底物合成L-木酮糖。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747可以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747可以L-甘油醛和葡萄糖为底物合成L-果糖。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株SY10CGMCCNo.8747可以D-赤藓糖和葡萄糖为底物合成3R,4S,5R,6R-庚糖和3R,4R,5R,6R-庚糖。
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