CN104498540A - 一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法 - Google Patents

一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，其特征是利用重组菌株全细胞作为生物催化剂催化4-羟基肉桂酸制备4-羟基肉桂醛，包括以下步骤：（1）构建重组菌株 E.coli M15/pQE31-4CL1-CCR；（2）制备重组菌株全细胞；（3）利用上述重组菌株全细胞催化生产4-羟基肉桂醛，得到的产品经高效液相色谱串联质谱法检测。本发明首次提出了用生物转化的方法合成4-羟基肉桂醛的途径，具有反应条件温和，酶活性高，节约成本，操作简便等优点，提供了一种新的合成4-羟基肉桂醛的方法，同时也为植物次生代谢产物的生产提供了一种新思路。

Description

一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法
技术领域
本发明涉及生物转化方法制备植物次生代谢产物。
背景技术
4-羟基肉桂醛是木质素生物合成及降解过程中重要的中间代谢产物，包括香豆醛、咖啡醛、松柏醛和芥子醛。4-羟基肉桂醛是农业化学、植物科学以及生物能源领域的研究热点之一。这类芳香族聚合物阻止了木质纤维素类生物质转化为液态燃料，因此是生物燃料生产、反刍动物对纤维素的消化利用和制浆造纸等工农业生产中经济利用木质纤维素的最大障碍之一。4-羟基肉桂醛不仅是木质素单体生物合成的关键中间体，也是木质素人工合成及天然合成过程中的重要代谢产物。有趣的是，缺乏肉桂醛脱氢酶的植物比正常植物催化4-羟基肉桂醛还原为单体的能力提高了50%。4-羟基肉桂醛同时也是多种植物次生代谢物生物合成的假设中间体，其中包括一些重要的植物代谢调控物以及许多生物医学研究的热点。另外，4-羟基肉桂醛是4-羟基肉桂醇及其衍生物的重要合成前体，包括木质化的潜在单体替代物。
4-羟基肉桂醛的研究对于探究与其相关的生物合成和加工过程十分必要，是调控木质化过程和开发可用于液态生物燃料发电的木质纤维素类生物质至关重要的一步。尽管松柏醛和芥子醛可以在市面上买到，香豆醛和咖啡醛目前尚未作为商品供应。目前合成4-羟基肉桂醛的方法包括利用4-乙酰基苯甲醛的维蒂希反应、肉桂酸氯化物和混合酸酐的还原反应、以及苯丙烯醇的氧化反应等化学方法合成。但利用化学合成法生产制备4-羟基肉桂醛存在操作步骤繁琐、产率低、副产物多和难于纯化等问题。
生物转化是利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化的过程，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化。细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，弥补了酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，同时又省去了繁杂的酶的分离纯化过程。大肠杆菌是生产植物次生代谢产物的良好系统，包括通过苯丙烷途径生产植物化学物质。但是，尚没有利用重组双功能酶菌株催化生产4-羟基肉桂醛的报道。构建重组菌株的基因来自741毛白杨，该双功能酶基因编码4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR），催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛。
发明内容
本发明针对现有4-羟基肉桂醛制备工艺上的不足，目的在于提供一种4-羟基肉桂醛的方法。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化。这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，特征是在于以重组菌株全细胞为生物催化剂，并在该全细胞体系中添加底物4-羟基肉桂酸，实现细胞内催化反应制备4-羟基肉桂醛；
所用的底物4-羟基肉桂酸选用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，浓度为1mM；
（1）   重组菌的构建
提取基因组的毛白杨为741毛白杨。
为了获得4CL1-CCR的完整序列，我们以4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的全长cDNA质粒载体作为PCR扩增反应模板。利用引物2和引物3的重叠区域进行多重PCR实验，以及含有SphⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物1和含有KpnⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物4进行PCR反应扩增双功能酶基因片段：
引物1：5’-ggcatgcatgaatccacaagaagaattc-3’，
引物2：5’-gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag-3’，
引物3：5’-atgccggttgatgcttcatcactttcag-3’，
引物4：5’-gggtaccttattgaatcttcacagactcttc-3’，
利用PCR产物与PMD18-T载体相连，获得重组PMD18-T4CL1-CCR。PCR扩增的保真度通过DNA测序分析。扩增产物利用SphⅠ和KpnⅠ进行酶切，然后插入空载体pQE31的同一位点上，构建重组质粒pQE31-4CL1-CCR（见图1），转入大肠杆菌构建重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1-CCR。该重组菌株具有催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛的能力。
所述双功能酶的核苷酸序列为序列表中所示。
（2）重组菌株全细胞的制备
LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂粉15，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；
将含有双功能酶基因的重组菌株pQE31-4CL1- CCR的大肠杆菌M15接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L，于28°C、200rpm诱导培养8h。
（3）   重组菌株全细胞催化生产4-羟基肉桂醛
50mL反应体系组成：50mL含重组菌株全细胞的LB液体培养基，终浓度为1mM的底物4-羟基肉桂酸；反应混合物于37°C、200rpm避光振荡反应2-32h,反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析。
产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析。反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1× 150 mm， 3.5 μm; Agilent，Santa Clara， CA，USA），流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，检测波长为325 nm。质谱为配备ESI源的离子阱质谱（LCQ DECA XP MAX）。
产物产率的计算：产率（%）=C P/C S×100%
式中C P为反应后4-羟基肉桂醛的浓度，C S为反应前底物的浓度。
香豆醛、咖啡醛、松柏醛的产率分别为34%，11%，19%。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
（1）   采用重组DNA技术所构建的4Cl1-CCR酶分子，保留了4Cl1酶分子和CCR酶分子各自的酶活性，因此只需要一个重组双功能酶4Cl1-CCR菌株就可以催化酚酸类（香豆酸、咖啡酸、阿魏酸）生成相应的4-羟基肉桂醛（香豆醛、咖啡醛、松柏醛），解除了细胞膜对中间产物（羟基肉桂酸CoA衍生物）进出细胞的阻碍。
（2）   本发明制作方法简单，与纯酶反应体系相比，该全细胞催化体系不需要额外添加辅酶A、ATP以及NADPH，大大减化了反应系统的复杂性，节约了成本，同时不涉及到酶繁杂分离纯化的过程，简化了设备的投资。
（3）   重组大肠杆菌所需要的营养低，易培养，易操作，制备工艺简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步骤。
（4）   与化学合成法相比，简化了4-羟基肉桂醛的生产工艺，直接将底物投入到重组大肠杆菌全细胞培养液中，大大减少了副产物的生成。
附图说明
图1为重组表达载体图谱。
图2为本发明实施例1中利用重组菌株全细胞催化生产香豆醛的高效液相色谱图以及质谱图。A：反应初始时刻，底物香豆酸（S1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；B：反应一段时间后，底物香豆酸（S1），产物香豆醛（P1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；C：香豆酸（S1）的二级质谱图；D：香豆醛（P1）的二级质谱图。
图3为本发明实施例2中利用重组菌株全细胞催化生产咖啡醛的高效液相色谱图以及质谱图。A：反应初始时刻，底物咖啡酸（S1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；B：反应一段时间后，底物咖啡酸（S1），产物咖啡醛（P1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；C：咖啡酸（S1）的二级质谱图；D：咖啡醛（P1）的二级质谱图。
图4为本发明实施例3中利用重组菌株全细胞催化生产松柏醛的高效液相色谱图以及质谱图。A：反应初始时刻，底物阿魏酸（S1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；B：反应一段时间后，底物阿魏酸（S1），产物松柏醛（P1）和内标芥子醛（IS）的高效液相色谱图；C：阿魏酸（S1）的二级质谱图；D：松柏醛（P1）的二级质谱图。
具体实施方式
下述下面结合实施例，进一步阐述对本发明：
实施例1
（1）   挑取重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1- CCR单菌落接种于5mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；以体积比为2：100的比例，将所得的菌液转接于50mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；所述LB液体培养基的配方为：以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用；
（2）   将浓度为1mM的底物香豆酸直接投入50mL上述液体培养物中，于37°C、200rpm避光振荡反应4h；
（3）   反应完成后，于4°C、50×100rpm离心弃菌体，收集反应液；反应混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析。产物利用高效液相色谱和质谱联用法进行检测，如图2所示，香豆酸、香豆醛和内标芥子醛的出峰时间分别为27.16min、37.32min和47.53min。
实施例2
（1）   挑取重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1- CCR单菌落接种于5mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；以体积比为2：100的比例，将所得的菌液转接于50mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；所述LB液体培养基的配方为：以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用；
（2）   将浓度为1mM的底物咖啡酸直接投入50mL上述液体培养物中，于37°C、200rpm避光振荡反应8h；
（3）   反应完成后，于4°C、50×100rpm离心弃菌体，收集反应液；反应混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析。产物利用高效液相色谱和质谱联用法进行检测，如图3所示，咖啡酸、咖啡醛和内标芥子醛的出峰时间分别为12.41min、23.42min和47.53min。
实施例3
（1）   挑取重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1- CCR单菌落接种于5mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；以体积比为2：100的比例，将所得的菌液转接于50mL LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；所述LB液体培养基的配方为：以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用；
（2）   将浓度为1mM的底物阿魏酸直接投入50mL上述液体培养物中，于37°C、200rpm避光振荡反应32h；
（3）   反应完成后，于4°C、50×100rpm离心弃菌体，收集反应液；反应混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析。产物利用高效液相色谱和质谱联用法进行检测，如图4所示，阿魏酸、松柏醛和内标芥子醛的出峰时间分别为34.28min、44.69min和47.53min。
序列1
        1 ggcatgcatg aatccacaag aagaattcat ctttcgctca aaattaccag acatctacat
       61 cccgaaaaac cttcccctgc attcatacgt tcttgaaaac ttgtctaacc attcatcaaa
      121 accttgcctg ataaatggcg cgaatggaga tgtctacacc tatgctgacg ttgagctcac
      181 agcaagaaga gttgcttctg gtctgaacaa gattggtatt caacaaggtg acgtgatcat
      241 gctcttccta ccaagttcac ctgaattcgt gcttgctttc ctaggcgctt cacacagagg
      301 tgccattatc actgctgcca atcctttctc cacccctgca gagctagcaa aacatgccaa
      361 ggcctcgaga gcaaagcttc tgataacaca ggcttgttac tacgagaagg ttaaagattt
      421 tgcccgagaa agtgatgtta aggtcatgtg cgtggactct gccccggatg gatgcttgca
      481 cttttcagag ctaacacagg cagacgaaaa tgaagcgcct caggtcgaca ttagtcccga
      541 tgatgtcgta gcattgcctt attcatcagg gactacaggg ttgccaaaag gggtcatgtt
      601 aacgcacaaa gggctaataa ccagtgttgc tcaacaggta gatggagaca atcctaacct
      661 gtattttcac agtgaagatg tgattctgtg tgtgctgcct atgttccata tctatgctct
      721 gaattcaata atgctctgcg ggctgagagt cggtgccccg attttgataa tgccaaagtt
      781 tgagattggt tctttactgg gattgattga gaagtacaag gtatctatag caccggttgt
      841 tccacctgtg atgatgtcaa ttgctaagtc acctgatctt gacaagcatg acttgtcttc
      901 tttgaggatg ataaaatctg gaggggctcc attgggcaag gaacttgaag atactgtcag
      961 agctaagttt cctcaggcta gacttggtca gggatatgga atgaccgagg caggacctgt
     1021 tctagcaatg tgcttggcat ttgccaagga accattcgac ataaaaccag gtgcatgtgg
     1081 gactgtagtc aggaatgcag agatgaagat tgttgaccca gaaacagggg cctctctacc
     1141 gaggaaccag cctggtgaga tctgcatccg gggtgatcag atcatgaaag gatatcttaa
     1201 tgaccctgag gcaacctcaa gaacaataga caaagaagga tggctgcaca caggcgatat
     1261 cggctacatt gatgatgatg atgagctttt catcgttgac agattgaagg aattgatcaa
     1321 gtataaaggg tttcaggttg ctcctgctga actcgaagct ttgttaatag cccatccaga
     1381 gatatccgat gctgctgtag taggattgaa agatgaggat gcgggagaag ttcctgttgc
     1441 atttgtagtg aaatcagaaa agtctcaggc caccgaagat gaaattaagc agtatatttc
     1501 aaaacaggtg atattctaca agagaataaa acgagttttc ttcattgaag ctattcccaa
     1561 ggcaccatct ggcaagatcc tgaggaagaa tctgaaagaa aagttggcag gcataggtgg
     1621 tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct atgccggttg atgcttcatc
     1681 actttcaggc caaggccaaa ctatctgtgt caccggggct ggtggtttca ttgcttcttg
     1741 gatggttaaa cttcttttag ataaaggtta cactgttaga ggaactgcga ggaacccagc
     1801 tgatcccaag aattctcatt tgagggagct tgaaggagct caagaaagat taactttatg
     1861 caaagctgat cttcttgatt atgagtctct taaagaggct attcaagggt gtgatggtgt
     1921 tttccacact gcttctcccg tcacagatga tccggaagaa atggtggagc cagcagtgaa
     1981 cgggaccaaa aatgtgatca ttgcggcggc tgaggccaaa gtccgacgag tggtgttcac
     2041 gtcctcaatt ggtgctgtgt acatggatcc caataagggc ccagatgttg tcattgatga
     2101 atcttgctgg agtgatcttg aattctgcaa gaacaccaag aattggtatt gctatggaaa
     2161 ggcggtggca gaacaagctg cgtgggatat ggctaaggag aaaggggtgg acctagtggt
     2221 ggttaaccca gtgctggtgc tcggaccatt gttgcagccc actgtcaatg ctagcatcgt
     2281 tcacatcctc aagtacctca ccggctcagc caagacatat gctaactctg ttcaagctta
     2341 tgtgcatgtt agggatgtgg cactagccca cattttagtc tttgagacgc cttccgcctc
     2401 cggccgttac ctttgctctg agagcgttct ccaccgtgga gaggtggtgg aaatccttgc
     2461 aaagttcttc cccgagtacc ccatccctac caagtgctca gatgagaaga acccaagaaa
     2521 acaaccttac aagttctcaa accagaagct aagggatctg ggcttcgagt tcacaccagt
     2581 gaagcagtgt ctgtatgaaa ctgttaagag cttgcaggaa aggggccacc ttccaatccc
     2641 aaaacaagct gcagaagagt ctgtgaagat tcaataa
 
 
 

Claims (1)

1.一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，其特征是在于
以重组菌株全细胞为生物催化剂，并在该全细胞体系中添加底物4-羟基肉桂酸，实现细胞内催化反应制备4-羟基肉桂醛；
所用的底物4-羟基肉桂酸选用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，浓度为1mM；
重组菌的构建
提取基因组的毛白杨为741毛白杨；
为了获得4CL1-CCR的完整序列，我们以4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的全长cDNA质粒载体作为PCR扩增反应模板；利用引物2和引物3的重叠区域进行多重PCR实验，以及含有SphⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物1和含有KpnⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物4进行PCR反应扩增双功能酶基因片段：
引物1：5’-ggcatgcatgaatccacaagaagaattc-3’，
引物2：5’-gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag-3’，
引物3：5’-atgccggttgatgcttcatcactttcag-3’，
引物4：5’-gggtaccttattgaatcttcacagactcttc-3’，
循环利用PCR产物与PMD18-T载体相连，获得重组PMD18-T4CL1-CCR；PCR扩增的保真度通过DNA测序分析；扩增产物利用SphⅠ和KpnⅠ进行酶切，然后插入空载体pQE31的同一位点上，构建重组质粒pQE31-4CL1-CCR，转入大肠杆菌构建重组菌株E.coliM15/pQE31-4CL1-CCR；该重组菌株具有催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛的能力；
所述双功能酶的核苷酸序列为序列表中所示；
重组菌株全细胞的制备
LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂粉15，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；
将含有双功能酶基因的重组菌株pQE31-4CL1-CCR的大肠杆菌M15接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；
重组菌株全细胞催化生产4-羟基肉桂醛由50mL反应体系组成：50mL含重组菌株全细胞的LB液体培养基，终浓度为1mM的底物4-羟基肉桂酸；反应混合物于37°C、200rpm避光振荡反应2-32h,反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；
产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析；反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1× 150 mm， 3.5 μm; Agilent，Santa Clara， CA，USA），流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，检测波长为325 nm；质谱为配备ESI源的离子阱质谱（LCQ DECA XP MAX）。
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