KR102582416B1 - 신남알데히드 대량 생산을 위한 재조합 대장균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에서, (i) 카르복시산 환원효소 (carboxylic acid reductase)를 인코딩하는 유전자; 및 (ii) 포스포판테테이닐 전이효소 (phosphopantetheinyl transferase)를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 대장균을 이용하는 경우, 환경친화적이면서도 우수한 효율로 신남알데히드 및 페닐알라닌을 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

신남알데히드 대량 생산을 위한 재조합 대장균 {Engineering of Escherichia coli for enhanced production of cinnamaldehyde}
본 발명은 신남알데히드 대량 생산을 위한 재조합 대장균에 관한 것으로, 더 상세하게는 PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에, (i) 카르복시산 환원효소 (carboxylic acid reductase)를 인코딩하는 유전자 및 (ii) 포스포판테테이닐 전이효소 (phosphopantetheinyl transferase)를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균에 관한 것이다.
선충 감염은 농업 및 원예 분야에서 매우 심각한 문제 중의 하나로 인식되고 있다. 이 식물 기생 생물인 선충은 식물의 뿌리를 통해 감염됨으로써, 식물 내부의 영양분을 먹으며 성장한다. 이로 인해 매년 40% 이상의 심각한 경제적 손실이 야기되고 있다. 이러한 점을 해결하기 위해 다양한 화학 농약이 개발되고 사용되고 있으나, 환경 오염 및 잔류 문제 등으로 인해 점차적으로 사용에 제한이 되고 있다.
신남알데하이드는 노란색의 휘발성 및 점성을 가지고 있는 액체로, B형 간염 치료제, 항암제, 항진균제 등의 다양한 약물의 전구체로 사용이 될 수 있는 활성을 가지고 있다. 그 중에서도 매우 높은 선충 퇴치 활성을 가지고 있는데, 이러한 점을 이용하여 많은 살선충제에는 신남알데하이드가 포함되어 있다. 기존 신남알데하이드를 생산하는 방법으로는 계피 나무로부터 직접적으로 추출하거나, 화학적인 방법으로 합성하는 두 가지의 방법이 존재하고 사용되고 있다. 하지만 이러한 방법들은 환경친화적이지 못하거나, 발암 물질을 사용해야하는 단점들이 존재하고 있다. (대한민국 등록특허 10-1515781; Kim MY et al., ACS Catal. (2017)7:6256-6267; Kunjapur AM et al., J. Am. Chem. Soc. (2014)136(33)11644-11654).
한편, 신남알데하이드를 생물학적 방법으로 합성할 수 있는 방법이 개시된 바는 있으나 (Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16; 대한민국 등록특허 10-1797713; 미국 등록특허 10301654), 이들 방법에 의하는 경우 신남알데하이드 생산성 (75 mg/L)이 매우 낮고, 전구체인 페닐알라닌의 생산성을 증가시키기 위해 두 개의 아미노산 (L-Trp, L-Tyr) 생성 저해 균주로 개량되었을 뿐만 아니라, 신남알데히드 생산을 위한 두 개의 플라스미드 시스템 사용으로 인해 항생제 및 발현 유도제 (inducer)를 사용하여야 하기 때문에 산업화를 하기에는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 산업적 이용가능성이 매우 높은 대장균을 이용하여 신남알데히드를 대량 생산할 수 있는 방법을 모색하던 중, PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에 유전자를 도입 및 결손시키는 일련의 과정을 통해 신남알데히드 생산량을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 10-1515781; 대한민국 등록특허 10-1797713; 미국 등록특허 10301654
Kim MY et al., ACS Catal. (2017)7:6256-6267; Kunjapur AM et al., J. Am. Chem. Soc. (2014)136(33)11644-11654; Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16
본 발명의 목적은 신남알데히드 생산성이 향상된 신규한 재조합 대장균 및 이를 이용하여 신남알데히드를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 페닐알라닌 생산성이 향상된 신규한 재조합 대장균 및 이를 이용하여 페닐알라닌을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에,
(i) 카르복시산 환원효소 (carboxylic acid reductase)를 인코딩하는 유전자; 및/또는 (ii) 포스포판테테이닐 전이효소 (phosphopantetheinyl transferase)를 인코딩하는 유전자 도입되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 신남알데히드의 생산방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 대장균을 배양하여 신남알데히드를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 신남알데히드를 회수하는 단계.
본 발명은 또한, PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에서,
(i) crr (glucose-specific enzyme IIA components of PTS), tyrR (DNA-binding transcriptional dual regulator) 및 pykA (pyruvate kinase)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실; 및/또는
(ii) aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase) 및/또는 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)의 피드백 저항성이 향상되도록 변이되어 있는, 페닐알라닌 생산성이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 페닐알라닌의 생산방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 대장균을 배양하여 페닐알라닌를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 페닐알라닌을 회수하는 단계.
본 발명에 따른 재조합 대장균을 이용하는 경우, 환경친화적이면서도 우수한 효율로 신남알데히드 및 페닐알라닌을 생산할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 대장균 균주 개량에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 개량된 대장균 균주에서 생산된 페닐알라닌의 농도를 정량하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 효소 활성 비교를 위해 CAR, PPTase를 발현하는 대장균 균주에 트랜스 신남산 (trans-cinnamic acid)를 공급하여 전환되는 신남알데하이드 (cinnamaldehyde)의 농도를 정량하여 나타낸 것이다. CA, trans-cinnamic acid; CAD, cinnamaldehyde; CAL, cinnamyl alcohol.
도 4는 대장균 균주의 추가 개량(H-02mR: H-02 derivative, △dkgB △yahK △yeaE △yjgB △yqhC △yqhD △dkgA △gldA △ybbO △yqhA)을 통한 부산물 생성 저해를 정량하여 나타낸 것이다.
도 5은 최종적으로 선정된 효소를 도입하여 개량된 세포(H-02mR strain harboring pHB-Tac-CA and pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt)의 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (mg/L); red circle)를 나타낸 것이다
도 6은 자동 유도 (auto-inducible) 발현 시스템을 이용하여 대장균의 유전자 내부에 삽입함으로써 형질 전환된 균주(H-07OmR: H-02mR derivative, (gidB-atpI)::(PBBa_J23100-SmPAL-rrnB), aslAB::(PosmB-MmCAR-NiNpt))를 이용하여 세포 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (mg/L); red circle)를 나타낸 것이다.
도 7은 NADPH 대량 생산을 위해 형질 전환된 균주(H-08OmR: H-07OmR derivative, △PpntAB::PM1-46, △PyfjB::PM1-37)를 이용하여 세포 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle), 포도당 (glucose; black diamond), 젖산 (lactate; red diamond), 아세트산 (acetate; green diamond)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (mg/L); red circle)를 나타낸 것이다.
도 8은 아세트산 (acetate) 생성 저해를 위해 형질 전환된 균주(H-09OmR: H-08OmR derivative, △poxB △(pta-ackA))를 이용하여 세포 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle), 포도당 (glucose; black diamond), 젖산 (lactate; red diamond), 아세트산 (acetate; green diamond)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (g/L); red circle)를 나타낸 것이다.
도 9는 coenzyme A 대량 생산을 위해 형질 전환된 균주(H-10SmR: H-09OmR derivative, △PcoaA::PBBa_J23100)를 이용하여 세포 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (g/L); red circle)를 나타낸 것이다.
도 10은 ATP 대량 확보를 위해 형질 전환된 균주(H-11MPmR: H-10SmR derivative, △lacZ::(PR-metK sRNA, PR-proB sRNA))를 이용하여 세포 고농도 배양을 진행한 후, 시간대 별로 측정한 광학 밀도 (OD (at 600 nm); grey circle)와 이에 따른 신남알데하이드의 농도 (Production titer (g/L); red circle)를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 대장균에 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자 및 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자가 도입하는 경우, 대장균의 신남알데히드를 생산하는 능력이 현저히 개선될 수 있음을 확인하였고, 대장균에 내재적으로 존재하는 일부 유전자의 발현을 강화시키고 일부 유전자의 발현을 억제하는 경우 대장균의 신남알데히드를 생산하는 능력이 추가로 향상될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에, (i) 카르복시산 환원효소 (carboxylic acid reductase)를 인코딩하는 유전자; 및/또는 (ii) 포스포판테테이닐 전이효소 (phosphopantetheinyl transferase)를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 카르복시산 환원효소는 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자는 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래의 car 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 포스포판테테이닐 전이효소는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 sfp 유전자 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래의 npt 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은 (i) crr (glucose-specific enzyme IIA components of PTS), tyrR (DNA-binding transcriptional dual regulator) 및 pykA (pyruvate kinase)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실; 및/또는 (ii) aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase) 및/또는 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)의 피드백 저항성이 억제되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase)는 aroG8/15로 교체되어 피드백 저항성이 억제되고, pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)는 pheA fbr/dm 로 교체되어 피드백 저항성이 억제되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase)는 aroG8/15로 교체 및/또는 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)는 pheA fbr/dm 로 교체되어 있고,
상기 교체된 aroG8/15 및/또는 pheA fbr/dm 의 프로모터는 강력한 상시 발현 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 galP (D-galactose transporter) 및/또는 glk (glucokinase) 유전자의 프로모터가 강력한 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 dkgB(2,5-diketo-D-gluconate reductase B), yahK(oxidoreductase), yeaE(oxidoreductase), yjgB(alcohol dehydrogenase), yqhC(DNA-binding transcriptional regulator), yqhD(alcohol dehydrogenase), dkgA(2,5-diketo-D-gluconate reductase A), gldA(glycerol dehydrogenase), ybbO(oxidoreductase), yqhA(inner membrane protein) 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia lyase)를 인코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 강력한 상시 발현 프로모터 하에 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소는 스트렙토미세스 마리티무스(Streptomyces maritimus) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 스트렙토미세스 마리티무스(Streptomyces maritimus) 유래의 pal 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 대장균에 내재적으로 존재하는 gidB (methyltransferase)와 atpI (ATP synthase) 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은 마이코박테리움 마리눔 유래의 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자 및 노카디아 이오웬시스 유래의 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 상기 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자 및 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자는 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 aslA (putative anaerobic sulfatase maturation enzyme AslB)와 aslB (putative anaerobic sulfatase maturation enzyme AslB) 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 pntAB (pyridine nucleotide transhydrogenase α & β및/또는 yfjB (NAD kinase) 유전자의 프로모터가 강력한 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 pta-ackA (phosphate acetyltransferase & acetate kinase A) 및/또는 poxB (pyruvate dehydrogenase) 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 coaA (pantothenate kinase) 유전자의 프로모터가 강력한 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 metK (methionine adenosyltransferase) 및/또는 proB (γkinase) 유전자가 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, metK 및/또는 proB 유전자의 기능이 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 강력한 상시 발현 프로모터는 BBa_J23100, BBa_J23106, M1-46, M1-37 및 bacteriophage λ PR로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 신남알데히드의 생산방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 대장균을 배양하여 신남알데히드를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 신남알데히드를 회수하는 단계.
한편, 본 발명에서는 PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에서, 일부 유전자를 결실시키거나 일부 유전자를 치환, 또는 발현을 강화시킴으로써, 페닐알라닌 생산성이 향상될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에서,
(i) crr (glucose-specific enzyme IIA components of PTS), tyrR (DNA-binding transcriptional dual regulator), pykA (pyruvate kinase)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실; 및/또는 (ii) aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase) 및/또는 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)의 피드백 저항성이 억제되어 있는, 페닐알라닌 생산성이 향상된 재조합 대장균에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase)는 aroG8/15로 교체되어 피드백 저항성이 억제되고, 상는 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)는 pheA fbr/dm 로 교체되어 피드백 저항성이 억제되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 교체된 aroG8/15 및/또는 pheA fbr/dm 의 프로모터는 강력한 상시 발현 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 강력한 상시 발현 프로모터는 BBa_J23100, BBa_J23106, M1-46, M1-37 및 bacteriophage λ로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 페닐알라닌 생산성이 향상된 재조합 대장균은 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 galP (D-galactose transporter) 및/또는 glk (glucokinase) 유전자의 프로모터가 강력한 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 페닐알라닌의 생산방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 대장균을 배양하여 페닐알라닌를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 페닐알라닌을 회수하는 단계.
본 발명에서 유전자가 도입되어 있다는 것은, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질이 숙주 미생물에 없는 경우 이를 인위적으로 숙주 미생물에서 발현하도록 하여 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능을 갖도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "결실"이란 해당유전자의 일부 또는 전체염기를 변이, 치환 또는 삭제시키는 방법을 통해 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 활성 또는 기능을 나타내지 못하도록 하는 것으로, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능이 내재적 활성 또는 기능에 비하여 약화되도록 변형됨을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서, 일부 유전자는 그 유전자의 발현을 조절하는 내재적 프로모터가 강력한 상시 발현 프로모터로 교체되어, 상기 유전자의 과발현 등을 유도함으로써, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능이 내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성 또는 기능"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소, 펩타이드, 단백질 등이 보유하는 활성 또는 기능을 의미한다.
본 발명에서 "내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형"되었다는 것은, 활성 또는 기능을 나타내는 유전자가 도입되거나 또는 당해 유전자의 카피수 증가(예를 들어, 유전자가 도입된 플라스미드를 이용한 발현), 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실 또는 발현조절 서열의 변형, 예를 들어 개량된 프로모터의 사용 등과 같이, 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성 또는 기능이 증가된 상태를 의미한다.
본 발명에서 "내재적 활성 또는 기능에 비하여 약화되도록 변형"되었다는 것은, 활성 또는 기능을 나타내는 유전자의 결실이나 유전자의 불활성화(예를 들어, 돌연변이 유전자로의 치환), 유전자 발현의 약화(예를 들어, 약한 프로모터로의 치환, siRNA, gRNA, sRNA 등의 도입, 시작 코돈을 ATG에서 GTG 등으로의 치환), 유전자에 의해 발현된 펩타이드의 기능 억제(예를 들어, 비경쟁적 억제자 또는 경쟁적 억제자 첨가) 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 기능에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 기능이 감소된 상태를 의미한다.
본 발명에서, 유전자 또는 프로모터의 "교체"란 종래 유전자 또는 프로모터를 제거하고 이와 상이한 유전자 (예컨대, 변이 유전자 등) 또는 강도가 상이한 프로모터를 새로이 도입하는 것을 의미하는 것으로, 상기 종래 유전자 또는 프로모터를 제거한다는 것은 해당 유전자 또는 프로모터를 결실시키는 것뿐만 아니라 그 기능을 억제시키거나 감소시키는 것도 포괄하는 개념이다.
본 발명에서 "과발현"이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 본 발명의 효과를 위해 추가적으로 변형될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원(Ori)을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 바람직하게는 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것이 바람직하다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능 하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및/또는 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및/또는 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
아울러, 본 발명에서 도입된 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에서는 특정 유전자 명을 기재하였으나, 본 발명이 해당 유전자에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명할 것이다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균 균주 W3110에 기초하여 실험을 진행한 바, 해당 대장균에 내재적으로 존재하는 유전자 명을 기재하였으나, 당업자는 PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 다른 대장균에도 본 발명의 기술적 특징이 그대로 적용되어 재현될 수 있음을 이해할 것이고, 해당 대장균에서 본 발명에서 특정한 유전자에 상응하는 내재적 유전자를 결실 또는 교체하거나 발현을 강화시킴으로써 본 발명을 용이하게 재현할 수 있을 것이다.
한편, 본 발명에서 도입한 유전자에 있어서도 특정 미생물 유래의 유전자 명을 기재하였으나, 본 발명의 보호범위가 해당 유전자 명에 한정되는 것은 아니고, 당업자가 해당 유전자와 동일한 기능을 가진 것이라고 인정할 수 있는 범위 내에서 유전자 명을 달리하는 다른 미생물 유래의 유전자를 본 발명의 기술적 특징에 따라 도입하는 경우, 해당 재조합 미생물도 본 발명의 보호범위에 속할 수 있음은 자명하다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 페닐알라닌 대량 생산 균주 개량
신남알데하이드 생합성을 위한 전구체인 페닐알라닌을 대량으로 생산하기 위한 균주 개량을 위하여 대장균 균주 W3110 (ATCC # 27325)를 모체로 하였다.
pECmuloxC 플라스미드 (Song and Lee, Biotechnol. J. (2013)8(7)776-784 참조)의 lox71-Cm-lox66 유전자를 주형으로 하여 표 1에 기재된 서열의 1F/1R (crr (Accession # P69783)), 2F/2R (tyrR (Accession # P07604)), 3F/3R (pykA (Accession # P21599))를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 준비하였다. PCR 반응은 10 μM forward and 10 μM reverse primers, 0.2 mM dNTP, 1 μL template, 1 μL DNA polymerase, 및 reaction buffer를 이용하여 57 ℃annealing temperature, 2 min extension time, 30 cycles로 진행하였다. 이하의 실시예에서, 중합효소 연쇄반응에 대해 별다른 기재가 없으면 이와 동일한 조건으로 PCR 반응을 진행하였다. λ와 cre recombinase를 발현하기 위하여 pCW611 플라스미드 (Song and Lee, Biotechnol. J. (2013)8(7)776-784 참조)가 형질전환된 균주 W3110의 염색체 DNA에서 각 유전자를 순차적으로 제거하여 YHP06으로 개량하였다. 본 발명에 따른 형질전환은 Sambrook and Russell, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001에 기초하여 진행하였다.
구체적으로는, 우선 30℃배양 조건에서 pCW611 플라스미드로부터 0.2% (w/v) arabinose를 이용하여 λ-Red recombinase를 발현시킨 후, 10% (v/v) PCR product를 형질전환하였다. 암피실린과 클로람페니콜 선별 배지로부터 염색체에 삽입된 균주를 1 mM IPTG를 이용하여 cre recombinase를 발현시킴으로써, 클로람페니콜 유전자를 제거한 이후, 37℃배양을 진행함으로써 pCW611 플라스미드를 제거하였다.
또한 되먹임 저해 (feedback inhibition)를 받는 효소를 되먹임 저항(feedback resistant) 효소로 개량하기 위하여 하기 표 1에 기재된 서열의 4F/4R (aroG (Accession # P0AB91)), 5F/5R (pheA (Accession # P0A9J8))를 이용하여 pECmuloxC 플라스미드의 lox71-Cm-lox66 유전자를 주형으로 하여 상기 기재된 반응과 같은 중합효소 연쇄반응을 통해 염색체 DNA의 aroG, pheA 유전자를 제거하였다.
이후 aroG8/15-pheA fbr/dm 유전자를 강력한 상시 발현 프로모터 BBa_J23100 (Anderson et al., J. Biol. Eng. (2010)4:1 참조)를 이용하여 발현하는 시스템을 구축하였다. pYHP 플라스미드 (Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16 참조) 유전자를 주형으로 표 1에 기재된 서열의 6F/6R을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행한 후, 제한 효소 PstI-BamHI으로 37℃에서 처리하였다. 이후 플라스미드 pKIKOrbsARCm (Addgene # 46765) (Sabri et al., Microb. Cell Fact. (2013)12:60 참조)을 같은 제한 효소로 처리한 후 상온에서 라이게이션 (반응 버퍼에서 1 μL T4 DNA ligase, 25 ℃) 함으로써 pKIKO-Fw를 준비하였다. 이후, λ-Red recombinase와 flippase를 발현하는 YHP06 균주의 염색체 DNA 내 rbsAR 위치에 삽입하여 H-01 균주를 구축하였다.
이를 위하여 우선 30℃배양 조건에서 pCW611 플라스미드로부터 0.2% (w/v) arabinose를 이용하여 λRed recombinase를 발현시킨 후, 10% (v/v) pKIKO-Fw 플라스미드를 형질전환하였다. 암피실린과 클로람페니콜 선별 배지로부터 염색체에 삽입된 균주를 37℃배양을 진행함으로써 pCW611 플라스미드를 제거하였다. 이후 pCP20 플라스미드 (The coli Genetic Stock Center, Yale University, USA)를 형질전환한 후, 30℃배양을 진행함으로써 클로람페니콜 유전자를 제거하고, 37℃배양을 진행함으로써 pCP20 플라스미드를 제거하였다 (Cherepanov and Wackernagel, Gene. (1995)158:9-14 참조). aroG8/15는 원래의 aroG 효소에 D146N과 A202T 돌연변이를 포함하는 것이며, pheAfbr/dm 는 원래의 pheA 효소에 E159A E232A 돌연변이를 포함하며 총 길이 386 중 1-300 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이를 포함한다.
이후 pECmuloxC 플라스미드의 lox71-Cm-lox66 유전자를 주형으로 표 1에 기재된 서열의 7F/7R (galP (Accession # P0AEP1)), 8F/8R (glk (Accession #P37747))를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 준비한 후, λ와 cre recombinase를 발현하는 H-01 염색체 DNA에서 각 유전자를 순차적으로 교체하여 염색체 DNA 내의 galP, glk 유전자에 대한 프로모터를 강력한 상시 발현 프로모터 BBa_J23106 (Anderson et al., J. Biol. Eng. (2010)4:1)으로 교체함으로써 H-02 균주로 개량하였다.
이후 pECmuloxC 플라스미드의 lox71-Cm-lox66 유전자를 주형으로 표 1에 기재된 서열의 9F/9R (ydiB (Accession # P0A6D5)), 10F/10R (aroK (Accession # P0A6D7))를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 준비한 후, λ와 cre recombinase를 발현하는 H-02 염색체 DNA에서 각 유전자를 순차적으로 교체하여 염색체 DNA 내의 ydiB, aroK 유전자에 대한 프로모터를 강력한 상시 발현 프로모터 BBa_J23106으로 교체함으로써 H-03 균주로 개량하였다.
완성된 대장균 균주 H-01, H-02, H-03의 페닐알라닌 생산성을 확인하기 위해 semi-defined PHE 배지 (5 g/L ammonium sulfate, 3 g/L potassium dihydrogen phosphate, 1.5 g/L sodium citrate, 1 g/L sodium chloride, 0.075 g/L thiamine-hydrochloride, 0.015 g/L calcium chloride dihydrate, 0.01125 g/L iron (II) sulfate heptahydrate, 20 g/L glucose, 3 g/L magnesium sulfate heptahydrate, 3 g/L yeast extract, 1.5 mL/L trace element solution (TES; 15 g/L zinc sulfate heptahydrate, 14.64 g/L manganese (II) sulfate hydrate, 12 g/L calcium carbonate, 3 g/L sodium molybdate dihydrate, 2.5 g/L copper (II) sulfate pentahydrate, 2.5 g/L nickel (II) sulfate hexahydrate, 2 g/L aluminium sulfate octadecahydrate, 0.75 g/L cobalt sulfate heptahydrate, 0.5 g/L boric acid, 10 mL/L hydrochloride, pH 6.8)를 이용하여 플라스크 배양을 진행하였다 (Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16). 플라스크 배양 조건으로는 37℃rpm 조건으로 진행하였으며, 48 시간 배양을 진행한 결과, 도 2에 나타난 것과 같이, H-02 균주를 사용하였을 경우 최대 3.6 g/L의 페닐알라닌 생산성을 보임을 확인하였다.
<실시예 2> 재조합 유전자 발현을 위한 균주 및 플라스미드 제작
마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) (ATCC BAA-535D-5TM) 유전체 DNA 또는 노카디아 이오웬시스 (Nocardia iowensis) (GenBank # AY495697.1) 합성유전체 DNA를 주형으로 하여, 각각 표 1에 기재된 서열의 11F/11R (mmcar (Accession # RFZ05356)) 또는 12F/12R (nicar (Accession # AAR91681))을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 car 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 10 μM forward and 10 μM reverse primers, 0.2 mM dNTP, 1 μL template, 1 μL DNA polymerase, 및 반응 버퍼를 이용하여, 57 ℃temperature, 8 min extension time, 30 cycles로 진행하였다.
증폭산물을 제한효소 XbaI-HindIII로 37℃에서 처리한 후 동일한 효소로 처리한 pBBR1Tac 플라스미드에 라이게이션 함으로써, pBBR1Tac-NiCAR 또는 pBBR1Tac-MmCAR 플라스미드를 구축하였다.
이후, 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis) (ATCC 23857D-5TM) 또는 노카디아 이오웬시스 (Nocardia iowensis) 유전체 DNA를 주형으로 표 1에 기재된 서열의 13F/13R (bssfp (Accession # ACG68433)) 또는 14F/14R (ninpt (Accession # ABI83656))을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭하였다. PCR 반응은 10 μM forward and 10 μM reverse primers, 0.2 mM dNTP, 1 μL template, 1 μL DNA polymerase 및 반응 버퍼를 이용하여, 57 ℃temperature, 2 min extension time, 30 cycles로 진행하였다.
증폭산물을 제한효소 HindIII로 37℃에서 처리한 후 앞서 구축한 pBBR1Tac-NiCAR 또는 pBBR1Tac-MmCAR 플라스미드를 동일한 제한 효소로 처리 및 라이게이션을 진행함으로써 최종적으로 pBBR1Tac-NiCAR-BsSfp, pBBR1Tac-NiCAR-NiNpt, pBBR1Tac-MmCAR-BsSfp, pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt를 구축하였다.
라이게이션이 완료된 pBBR1Tac-NiCAR-NiNpt, pBBR1Tac-NiCAR-BsSfp, pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt, 또는 pBBR1Tac-MmCAR-BsSfp 플라스미드는 대장균 균주 XL1-Blue (Agilent # 200249)를 거쳐 H-02에 형질전환 시켰다.
<실시예 3> 효소의 활성 분석
우선, MmCAR, NiCAR, BsSfp, NiNpt의 활성 분석을 위하여 앞서 구축한 플라스미드 pBBR1Tac-NiCAR-NiNpt, pBBR1Tac-NiCAR-BsSfp, pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt, 또는 pBBR1Tac-MmCAR-BsSfp가 형질전환 된 대장균 균주 H-02를 2% 포도당과 35 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 LB (Luria-Bertani) 배지에 접종하였다. 이를 37℃rpm 조건으로 12시간 동안 배양한 후, 각각 1/100 부피만큼을 0.5 mM의 IPTG (isopropyl-β와 500 mg/L 트랜스-신남산 (trans-cinnamic acid)을 포함하는 신선한 LB 배지에 옮겼다.
상기 반응을 30℃200 rpm에서 12시간 동안 진행하면서 3시간 마다 CAR 효소에 의해 생성된 신남알데하이드 (cinnamaldehyde)를 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse-phase high-performance liquid chromatography, reverse-phase HPLC)를 통해 분석하였다 (Microb. Cell Fact. (2016)15:16). 구체적으로, Zorbax Eclipse AAA 컬럼 (150 X 4.6 mm; 3.5 μm; Agilent, CA, USA)에서, 이동상 A (mobile phase A)는 0.1% 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid), 이동상 B (mobile phase B)는 아세토나이트릴 (acetonitrile)을 사용하였다. 아세토나이트릴 (acetonitrile)의 비율은 처음 1분 간은 10%, 이후 18분 간 70%로 점차적으로 변경하였으며, 이후 5분 간 10%로 점차적으로 변경하였고, 이후 3분 간 10%를 유지하였다. 컬럼의 온도는 40℃유속은 1 mL/min으로 고정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 것과 같이, NiCAR 및 BsSfp에 비하여, MmCAR와 NiNpt 조합의 활성이 우수한 것으로 나타났다.
<실시예 4> 부산물 저해 균주 개량
생성되는 신남알데하이드의 대부분이 신남 알코올 (cinnamyl alcohol)로 전환되는 것을 억제하기 위해, 개량된 균주 H-02를 모체 균주로 하여 추가 개량을 진행하였다. pECmuloxC 플라스미드의 lox71-Cm-lox66 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 15F/15R (dkgB (Accession # VWQ00989)), 16F/16R (yahK (Accession # VWQ01157)), 17F/17R (yeaE (Accession # QHF78366)), 18F/18R (yjgB (Accession # CDU40425)), 19F/19R (yqhC-yqkD-dkgA (Accession # ADK47403, ADK47404, ADK47405)), 20F/20R (gldA (Accession # VWQ00154)), 21F/21R (ybbO (Accession # BCL04514)), 22F/22R (yqhA (Accession # BCL02055)) 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 각각의 유전자를 준비한 후, λ와 cre recombinase를 발현하기 위해 pCW611 플라스미드가 형질전환 된 H-02 균주의 염색체 DNA에서 알데하이드를 알코올로 전환하는 여러 효소 중, dkgB, yahK, yeaE, yjgB, yqhC, yqhD, dkgA, gldA, ybbO, yqhA 총 10개 유전자를 제거함으로써 H-02mR 균주로 개량하였다 (실험방법은 상기 실시예 1과 같음). 또한 알코올 생성 반응 억제를 확인하기 위하여 pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt 플라스미드가 형질전환된 H-02 또는 H-02mR 균주를 0.5 mM IPTG와 500 mg/L trans-cinnamic acid를 포함하는 LB 배지에서 12시간 동안 배양하였다 (실험 방법은 상기 실시예 3과 같음). 이후 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석 결과, 도 4에 나타난 것과 같이, H-02 균주를 사용하였을 때 생성되던 cinnamyl alcohol이 H-02mR 균주에서는 거의 억제가 됨으로써, 신남알데하이드가 축적되는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 신남알데하이드 생산 시스템 구축
신남알데하이드 생산 시스템을 구축하기 위해 먼저, 코돈 최적화되어 합성한 스트렙토마이세스 마리티무스 (Streptomyces maritimus) pal 유전자 (Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16)를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 23F/23R을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 후(증폭 조건은 상기 실시예 1 참조), 제한효소 SacI-KpnI으로 37℃에서 처리하였다. 이후 동일한 효소로 처리한 pTac15k (Accession # MH488908) 플라스미드에 라이게이션 함으로써 (실험 방법은 상기 실시예 1과 같음) pHB-Tac-CA를 구축하였다 (Bang et al., Proc. Biochem. (2018)68:30-36). 이후 pHB-Tac-CA와 함께 앞서 구축한 pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt 플라스미드를 대장균 균주 H-02mR에 형질전환시켰다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위한 세포 고농도 배양을 진행하였다 (Bang et al., Proc. Biochem. (2018)68:30-36). 앞서 실시예 1에서 언급한 semi-defined PHE 배지를 기반으로, 35 μg/mL 클로람페니콜과 40 μg/mL 카나마이신 을 첨가한 후 37℃rpm 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 신선한 1.8 L의 PHE 배지에 200 mL의 inoculum을 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 용존 산소 (dissolved oxygen, DO)는 40%로 유지하였으며, 점차적으로 휘저음 속도 (agitation rate)를 증가시키며 최대 1000까지 증가시켰다. pH는 6.97보다 낮아질 경우 25% (v/v)의 암모니아를, 7.06보다 높아질 경우에는 700 g/L 포도당과 20 g/L MgSO47H2O로 이루어진 먹이 배지 (feeding solution)가 첨가되었다. 거품 억제제는 멸균 후 수동으로 공급하였다. OD600=80에 도달한 이후에는 30℃로 변경한 이후 1 mM의 IPTG (isopropyl-β를 첨가하였다. 배양한 대장균 균주는 시간대 별로 광학 밀도 (OD600)가 4가 되도록 따로 모아두어 단백질 분석에 이용하였으며, 원심분리를 통하여 얻어진 배양 상등액은 0.22 μm 필터링 (filter)하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse-phase HPLC) 분석을 통해 신남알데하이드 정량에 이용하였다 (Bang et al., Microb. Cell Fact. (2016)15:16).
그 결과, 도 5에 나타난 것과 같이 pHB-Tac-CA 플라스미드와 pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt 플라스미드가 형질전환된 H-02mR 균주의 OD600은 최대 89.4까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 501.3 mg/L가 생산되었다.
<실시예 6> 신남알데하이드 유전자가 삽입된 대장균주 개량
실시예 5에서 도입한 pHB-Tac-CA 플라스미드와 pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt 플라스미드를 대장균 염색체 삽입되어 안정적으로 발현되도록 하였다.
먼저, 첫 번째 효소 유전자인 Smpal을 삽입하기에 앞서, 강한 상시발현 프로모터인 BBa_J23100 프로모터를 이용하여 시스템을 구축하였다. 앞서 구축한 pHB-Tac-CA 플라스미드를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 24F/24R을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 실시예 1과 같은 방법으로 증폭한 후, 제한효소 EcoRI-SphI으로 37℃에서 처리하였다. 이후 동일한 효소로 처리한 pKIKOarsBCm 플라스미드 (Addgene # 46763) (Sabri et al., Microb. Cell Fact. (2013)12:60)에 라이게이션 함으로써 pKIKOarsB-PJ23100-SmPAL-rrnB를 구축하였다. 이후 발현양을 최대로 높이기 위해 대장균의 유전자 origin에 가장 가까운 위치에 있는 gidB와 atpI 유전자 사이에 삽입하였다. 대장균 W3110의 유전자 (genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 25F/25R (gidB HR1 (Accession # BBF21865))과 26F/26R (atpI HR2 (Accession # QKU51775))을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 실시예 1과 같은 방법으로 증폭한 후, 제한효소 SalI-EcoRI (gidB HR1) 또는 ScaI (atpI HR2)로 37℃에서 처리하였다. 이후 동일한 효소로 처리한 pKIKOarsB-PJ23100-SmPAL-rrnB 플라스미드에 순차적으로 라이게이션함으로써 pKIKOgidB-PJ23100-SmPAL-rrnB를 구축하였다. 이후 λ-Red recombinase와 flippase를 발현하는 H-02mR 균주의 염색체 DNA에 플라스미드 pKIKOgidB-PJ23100-SmPAL-rrnB를 이용하여 유전자 삽입을 진행함으로써 H-04GJmR 균주를 구축하였다.
이어 나머지 유전자인 MmCAR-NiNpt 효소의 유전자를 자동 유도 프로모터 (auto-inducible promoter) (PosmB)를 이용하여 시스템을 재구축 및 삽입하였다. 대장균의 유전자 (genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 27F/27R (PosmB), 28F/28R (aslA HR1 (Accession # QHF80945)), 29F/29R (aslB HR2 (Accession # BCL05523))를, pECmuloxC 플라스미드의 lox71-Cm-lox66를 주형으로 30F/30R (Cm)을, pKIKO-Fw를 주형으로 31F/31R (R6K ori)를 각각 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 후 (실험 방법은 상시 실시예 1과 같음), 제한효소 NcoI-EcoRI (aslA HR1), 또는 PstI-SfiI (aslB HR2), 또는 EcoRI-BamHI (PosmB), 또는 SpeI-PstI (Cm), 또는 SfiI-NcoI (R6K ori)로 처리하였다. 앞서 실시예 2에서 구축한 pBBR1Tac-MmCAR-NiNpt 플라스미드는 BamHI-SpeI를 처리하였다. 이후 총 6개의 조각들을 한꺼번에 라이게이션함으로써, pR6K-PosmB-MmCAR-NiNpt를 구축하였다. 이후 λ recombinase와 cre recombinase를 발현하기 위해 pCW611이 형질전환 된 H-04GJmR 염색체 DNA에 pR6K-PosmB-MmCAR-NiNpt 플라스미드의 유전자 삽입을 진행함으로써 H-07OmR 균주를 구축하였다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위한 세포 고농도 배양을 실시예 5와 같은 방법으로 진행하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 것과 같이 H-07OmR 균주의 OD600은 최대 119.8까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 559.9 mg/L가 생산되었다.
<실시예 7> NADPH 생산량 증가를 위한 균주 개량
신남알데하이드의 생산성을 증가시키기 위해 반응에 필요한 보조 인자 (cofactor) 중 하나인 NADPH의 양을 증가시키기 위한 균주 개량을 도입하였다. 우선 λrecombinase와 Cas9 (from Streptococcus pyogenes)를 발현하는 플라스미드 pB-Cas9을 구축하였다. λ-Red recombinase와 cre recombinase를 발현할 수 있는 pCW611 플라스미드를 제한효소 XbaI/SacII로 처리하여 cre recombinase 유전자를 제거하였다. 그리고 S. pyogenes 유전자를 주형으로, 하기 표 1에 기재된 서열의 32F/32R (Cas9)을 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 진행하여 증폭한 Cas9 DNA를 확보하였다. 이후 같은 제한효소 XbaI/SacII로 처리한 후 라이게이션 함으로써 pCW611-Cas9 플라스미드를 구축하였다. 이어 대장균 W3110의 게놈 DNA를 주형으로, 하기 표 1에 기재된 서열의 33F/33R (gRNA)을 이용하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 gRNA DNA를 확보하였다. 이후 제한효소 SfiI/SacII로 처리한 후, 같은 제한효소로 처리한 pCW611-Cas9 플라스미드와 함께 라이게이션 함으로써 pB-Cas9 플라스미드를 구축하였다.
대장균 유전자 중 pntAB, yfjB 두 유전자를 강화하기 위해, pECmuloxC 플라스미드 내의 Cm 유전자를 주형으로 (Song and Lee, Biotechnol. J. (2013)8(7)776-784) 하기 표 1에 기재된 서열의 34F/34R (pntAB (Accession # VWQ02559,VWQ02558)), 35F/35R (yfjB (Accession # CUU94844)) 프라이머 세트를 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 DNA를 확보하였다. 이후 λ-Red recombinase와 Cas9 (from Streptococcus pyogenes)를 발현하기 위해 pB-Cas9 플라스미드가 형질전환된 균주 H-07OmR의 염색체 DNA에 증폭한 DNA의 형질전환을 각각 진행하였다. 이로부터 pntAB, yfjB 두 유전자에 대한 프로모터를 강력한 상시 발현 프로모터 M1-46, M1-37 (Shi et al., 2013)으로 교체함으로써 H-08SmR 균주를 구축하였다.
이를 위하여, 우선 30℃배양 조건에서 pB-Cas9 플라스미드로부터 0.2% (w/v) arabinose를 이용하여 λ를 발현시킨 후, 10% (v/v) PCR 산물을 형질전환 하였다. 암피실린과 클로람페니콜 선별 배지로부터 염색체에 삽입된 균주를, 0.2% (w/v) arabinose와 1 mM IPTG를 동시에 이용하여 Cas9을 발현시킴으로써 클로람페니콜 유전자를 제거한 이후, 37℃배양을 진행함으로써 pB-Cas9 플라스미드를 제거하였다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위하여, 실시예 5에서와 같이 세포 고농도 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 것과 같이 H-08SmR 균주는 OD600에서 최대 54.6까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 726.3 mg/L가 생산되었다.
<실시예 8> 균주 성장 저해를 완화시키기 위한 균주 개량
개량된 균주 H-08OmR이 세포 성장이 늦어지는 문제를 해결하기 위해 대장균이 자체적으로 보유하고 있는 아세트산 생성 경로를 억제하는 균주를 개량하였다. pECmuloxC 플라스미드 내의 Cm 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 36F/36R (pta-ackA (Accession # VWQ05064, VWQ05065)), 37F/37R (poxB (Accession # VWQ01675))를 이용하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 DNA를 확보하였다. 이후 λ-Red recombinase와 Cas9 (from Streptococcus pyogenes)를 발현하기 위해 pB-Cas9 플라스미드가 형질전환된 균주 H-08OmR의 염색체 DNA에서 유전자 제거를 실시예 7에서와 같은 방법으로 진행함으로써 H-09OmR 균주를 구축하였다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위하여 실시예 5에서와 같이 세포 고농도 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 것과 같이 H-09OmR 균주의 OD600은 최대 129.2까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 1.38 g/L가 생산되었다.
<실시예 9> coenzyme A 생산량 증가를 위한 균주 개량
신남알데하이드의 생산성을 증가시키기 위해 반응에 필요한 보조 인자 (cofactor) 중 하나인 coenzyme A의 양을 증가시키기 위한 균주 개량을 도입하였다. 대장균 유전자 중 coenzyme A 합성 효소인 coaA의 유전자를 강화하기 위해, pECmuloxC 플라스미드 내의 Cm 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 38F/38R (coaA (Accession # CUU96269))를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 DNA를 확보하였다 (실험 방법은 상기 실시예 1과 같음). 이후 λ-Red recombinase와 Cas9 (from Streptococcus pyogenes)를 발현하기 위해, pB-Cas9 플라스미드가 형질전환 된 균주 H-09OmR에 증폭한 DNA의 형질전환을 진행하였다. 이로부터 H-09OmR 염색체 DNA 내의 coaA 유전자에 대한 프로모터를 상기 실시예 7과 같은 방법으로 강력한 상시 발현 프로모터 BBa_J23100으로 교체함으로써 H-10SmR 균주를 구축하였다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위하여, 실시예 5에서와 같은 방법으로 세포 고농도 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 것과 같이 H-10SmR 균주의 OD600은 최대 108.2까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 2.33 g/L가 생산되었다.
<실시예 10> 이용 가능한 ATP양 증가를 위한 균주 개량
신남알데하이드의 생산성을 증가시키기 위해 반응에 필요한 보조 인자 (cofactor) 중 하나인 ATP의 양을 증가시키기 위한 균주 개량을 도입하였다. 대장균 유전자 중 ATP 소모 반응인 MetK (Accession # CUU95031)와 ProB (Accession # QDB64248)의 발현양을 감소시키기 위해, pECmuloxC 플라스미드 내의 Cm 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 서열의 39F/39R (metK-proB)를 이용하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한 DNA를 확보하였다. 이후 λ-Red recombinase와 Cas9 (from Streptococcus pyogenes)를 발현하기 위해, pB-Cas9 플라스미드가 형질전환된 균주 H-10SmR에 증폭한 DNA의 형질전환을 진행하였다. 이로부터 H-10SmR 염색체 DNA 내의 lacZ (Accession # VWQ01169) 위치에 metK-proB sRNA 시스템이 삽입됨으로써 H-11MPmR 균주를 구축하였다.
이후 신남알데하이드의 생산성을 확인하기 위하여 실시예 5와 같은 방법으로 세포 고농도 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 것과 같이 H-11MPmR 균주는 OD600은 최대 126.6까지 성장하였으며 이후 점차적으로 감소하였다. 그리고 신남알데하이드는 최대 3.78 g/L가 생산되었다.
<실시예 11> 서열정보
car - Nocardia iowensis (서열번호 1)
car - Mycobacterium marinum (서열번호 2)
sfp - Bacillus subtilis (서열번호 3)
npt - Nocardia iowensis (서열번호 4)
crr - Escherichia coli (서열번호 5)
tyrR - Escherichia coli (서열번호 6)
pykA - Escherichia coli (서열번호 7)
aroG - Escherichia coli (서열번호 8)
aroG8/15 - Escherichia coli (서열번호 9)
pheA- Escherichia coli (서열번호 10)
pheA fbr/dm - Escherichia coli (서열번호 11)
BBa_J23100 - 합성 프로모터 (서열번호 12)
BBa_J23106 - 합성 프로모터 (서열번호 13)
galP - Escherichia coli (서열번호 14)
glk - Escherichia coli (서열번호 15)
dkgB - Escherichia coli (서열번호 16)
yahK - Escherichia coli (서열번호 17)
yeaE - Escherichia coli (서열번호 18)
yjgB - Escherichia coli (서열번호 19)
yqhC - Escherichia coli (서열번호 20)
yqhD - Escherichia coli (서열번호 21)
dkgA - Escherichia coli (서열번호 22)
gldA - Escherichia coli (서열번호 23)
ybbO - Escherichia coli (서열번호 24)
yqhA - Escherichia coli (서열번호 25)
pal - Streptomyces maritimus (서열번호 26)
gidB - Escherichia coli (서열번호 27)
atpI - Escherichia coli (서열번호 28)
PosmB - Escherichia coli (promoter) (서열번호 29)
aslA - Escherichia coli (서열번호 30)
aslB - Escherichia coli (서열번호 31)
pntAB - Escherichia coli (서열번호 32)
yfjB - Escherichia coli (서열번호 33)
PM1-46- 합성 프로모터 (서열번호 34)
PM1-37 - 합성 프로모터 (서열번호 35)
pta-ackA - Escherichia coli (서열번호 36)
poxB - Escherichia coli (서열번호 37)
coaA - Escherichia coli (서열번호 38)
metK sRNA - sRNA targeting to Escherichia coli metK (서열번호 39)
proB sRNA - sRNA targeting to Escherichia coli proB (서열번호 40)
lacZ - Escherichia coli (서열번호 41)
프라이머 서열
Name sequence (5'→3') target
1F ATGGGTTTGTTCGATAAACTGAAATCTCTGGTTTCCGACGACAAGAAGGATACCGGAACTATTGAGATCATTGCTCCGCTCTCTGGCGAGATCGTCAATAGACACTATAGAACGCGGCCG crr
1R TTACTTCTTGATGCGGATAACCGGGGTTTCACCCACGGTTACGCTACCGGACAGTTTGATCAGTTCTTTGATTTCGTCCATGTTGGAGATAACAACCGGACCGCATAGGCCACTAGTGGA
2F ATGCGTCTGGAAGTCTTTTGTGAAGACCGACTCGGTCTGACCCGCGAATTACTCGATCTACTCGTGCTAAGAGGCATTGATTTACGCGGTATTGAGATTGGACACTATAGAACGCGGCCG tyrR
2R TTACTCTTCGTTCTTCTTCTGACTCAGACCATATTCCCGCAACTTATTGGCAATCGCGGTATGTGAAACGCCGAGACGTTTTGCCAGTTTGCGCGTGCTGCCGCATAGGCCACTAGTGGA
3F ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGCCCAGCAACAGATCGCGATAATAATCGACACTATAGAACGCGGCCG pykA
3R TTACTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACTCATCACGTCGCCCTGGGTGACACCGCATAGGCCACTAGTGGA
4F CAGGTGAATATAAGGCATTGGTTTAAGATTTCAGCCAGGTTATGAAACGCAGCAGAGAATCTTGAAATAAGACACTATAGAACGCGGCCG aroG
4R TTACCCGCGACGCGCTTTTACTGCATTCGCCAGTTGACGTAACAGAGCATCGGTATCTTCCCAGCCGATGCCGCATAGGCCACTAGTGGA
5F CAACTTCGTCGAAGAAGTTGAAGAAGAGTAGTCCTTTATATTGAGTGTATCGCCAACGCGCCTTCGGGCGGACACTATAGAACGCGGCCG pheA
5R TCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGGTAACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTCCGCATAGGCCACTAGTGGA
6F TCCTGCAGTTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCCGACAAAAAGAAAGGAGCATCTAACA aroG8/15-pheAfbr/dm
6R GCAGGATCCTCACAACGTGGTTTTCGCCGGAA
7F CTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAATCTTTCTTCACCTGCGTTCAAAGGCCAGCCTCGCGCTGGCGACACTATAGAACGCGGCCG galP
7R CAAGGAAGCAGACGAAAAACGTCATTGCCTTGTTTGACCGCCCCTGTTTTTTAGCGTCAGGCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAAGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
8F CTTTCCGGCGTTGTTGTTATGCCCCCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAATTATTTTGACTTTAGCGGAGGACACTATAGAACGCGGCCG glk
8R TATCACACAGAGCAAGACGTGCGTTGGTGCCGCCCACATCACCGACTAATGCATACTTTGTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAAGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
9F TGAAAATGATGTGCGGTTTGGCGAGCGTAAATTTTGCACCCGGTTAAACACAATTAAGCATAGAGGTTAAGACACTATAGAACGCGGCCG ydiB
9R ATAAACTGTGGCGGATAGGATAGGCCATCAACCCAATCAATTCGTATTTTGCGGTAACATCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAAGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
10F ATCACGCCACGACTGGTTTCCAGTGAGTAAACAGCCGTAAAAGCGGTAATGTTTTTACGCTGAACGTGTTGACACTATAGAACGCGGCCG aroK
10R GCCCAATAGTGCTTTTTCCGGCACCCATAGGCCCAACCAGAAAGATATTGCGTTTCTCTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAAGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
11F GCATTCTAGATTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCACCACCATCACCATTCGCCAATCACGCGTGAAG MmCAR
11R ATGCAAGCTTTTATCAGAGCAGGCCGAGTAGGCG
12F GCATTCTAGATTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCACCACCATCACCATGCAGTGGATTCACCGGAT NiCAR
12R ATGCAAGCTTTTATCAGAGCAGCTGAAGCAGTTCCAG
13F ATAAAAGCTTTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGATTTACGGAATTTATATGGACCG BsSfp
13R GCCAAGCTTATCAATGGTGATGGTGGTGGTGTAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
14F ATAAAAGCTTTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATCGAGACAATTTTGCCTG NiNpt
14R GCCAAGCTTATCAATGGTGATGGTGGTGGTGGGCGTACGCGATCGCGGT
15F ATGGCTATCCCTGCATTTGGTTTAGGTACTTTCCGTCTGAAAGACGACGTTGTTATTTCATCTGTGATAAGACACTATAGAACGCGGCCG dkgB
15R TTAATCCCATTCAGGAGCCAGACCTTCCGGGCTAACCAGGCGGTCGTTGCAATCCAGTGCGGCGATCGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA
16F ATGAAGATCAAAGCTGTTGGTGCATATTCCGCTAAACAACCACTTGAACCGATGGATATCACCCGGCGTGGACACTATAGAACGCGGCCG yahK
16R TCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATCGATAACAAAACGATATTTCACATCACCGCGCAGCATTCGCTCATAGCCGCATAGGCCACTAGTGGA
17F ATGCAACAAAAAATGATTCAATTTAGTGGCGATGTCTCACTGCCAGCCGTAGGGCAGGGAACATGGTATAGACACTATAGAACGCGGCCG yeaE
17R TCACACCATATCCAGCGCAGTTTTTCCTTTTGGTGCCGGATATGCCTTATCCAGCATAGCTAATTCCGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA
18F ATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAGAAGCGGGCGGCGAACTGGAAGTTTATGAGTACGATCCCGGACACTATAGAACGCGGCCG yjgB
18R TCAAAAATCGGCTTTCAACACCACGCGGTAACGCGCCTTACCGTCGCGCACATGCTGGATGGCGTCGTTACCGCATAGGCCACTAGTGGA
19F CCGATTTTATGCCCGGAAAAGAGAATTATGATGCCAGGCTCGTACATCACCGGTGTACGTGCGAAAGGCGGACACTATAGAACGCGGCCG yqhC-yqhD-dkgA
19R TTCCACAGCTTAGTGGTGATGAACAGTTCTTCTCTGTTGACTGAGGCATTTTTCAGGGCTTTGCCGACACCCGCATAGGCCACTAGTGGA
20F ATGGACCGCATTATTCAATCACCGGGTAAATACATCCAGGGCGCTGATGTGATTAATCGTCTGGGCGAATGACACTATAGAACGCGGCCG gldA
20R TCCACTAGTGGCCTATGCGGGCCAGATCAGGTTTACGCCGCTCTGCTGGTAGCCGACCAGTACGGTCAGCGTTTCCTGCAAGAGTGGGAA
21F ATGACTCATAAAGCAACGGAGATCCTGACAGGTAAAGTTATGCAAAAATCGGTCTTAATTACCGGATGTTGACACTATAGAACGCGGCCG ybbO
21R TCCACTAGTGGCCTATGCGGGGTGACCTGGGCGGTAATGGTGCTTAAGCGCCTGCTGCCGGGGCGCGTGATGGACAAAATATTGCAGGGG
22F ATGGAACGTTTTCTTGAAAATGCAATGTATGCTTCTCGCTGGCTGCTTGCCCCCGTGTACTTTGGCCTTTGACACTATAGAACGCGGCCG yqhA
22R TCCACTAGTGGCCTATGCGGTATCCATCTGACGTTTGTGCTTTCTGCATTTGTGATGGGCTATCTTGACCGACTGACTCGTCATAATCAC
23F GCATGAGCTCTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGGACCTTCGTTATTGAACT SmPAL
23R ACTGGTACCTTATCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTC
24F GCTAGAATTCTTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGGACCTTCGTTATTGAACTGGATAT SmPAL
24R ATGCATGCTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTAT
25F GCTAGTCGACGCAAGGCCGTTTCTACGCGC gidB HR1
25R ATCGAATTCACAACAAAAACCACCCATTGACA
26F GCTAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAGGCGCGCCATTTAAATGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACGATTATAAATATGCTGTGCGCGAAC atpI HR2
26R ATGAGTACTCTCACGAGCGACACAGACAT
27F GCATGAATTCCCATTTCCCTTCTCTACGGATGATT PosmB
27R ATGCGGATCCAATACTCTCTCCTGAATTTATGATTCACG
28F GCATCCATGGAAAGGGATGATCCAACCG aslA HR1
28R ATGCGAATTCAGCGATAGCGCCGGCTTAGT
29F GCATCTGCAGGAGATCTGCCTTTGCCGGAT aslB HR2
29R CATGGGCCACAGTGGCCGGGAGGCTGCCCGAAACACC
30F GCATACTAGTAGGATCTGATGGGTACCGTTC Cm
30R ATGCTGCAGTAGGTGACACTATAGAACGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATAC
31F GCATGGCCACAGTGGCCGGTCAGACCAAGTT R6K ori
31R ATGCCATGGCATGGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCC
32F CACGGCTGAATCGTTAATATTTTGCGAGTTCACGCCGAAATACTGATTTTTGGCGCTAGATCACAGGCATGACACTATAGAACGCGGCCG pntAB
32R CCACTGTTTTTGGCGTTGCTGCAACACGGGTTTCATTGGTTAACCGTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAACCGAATTGGTGGGGCGAGAGGCTCAATTATATCAACGTTGTTATCTCTTGTCAACACCGCCAGAGATAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
33F TCGCTAACTTCGCTTATTATGGGGATCAGTTTCAGGGTTTCAAGGGAAGCACTCACATTGTCATCAATCTGACACTATAGAACGCGGCCG yfjB
33R CATGTGTTGTCAGTGCAGTGGGGTGCCGTGGGTGTCCCACAATGCCAATACACTTGAAATGATTATTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAACAATAAATTACGAGCCAGTGGCTCAATTATATCAACGTTGTTATCTCTTGTCAACACCGCCAGAGATAACCGCATAGGCCACTAGTGGA
34F ACGGCGCGCACGGCACCAGCCACTTCTATGTAACCCAGGAAGCGGCAAAAATGCTGAACAAACCGGTAGAAGAACTGAACATCATCACCTGCCACCTGGGCAACGGTGGTTCCGTTTCTGCTATCCGCAACGTCCGCTTATTATCACTTATTCAGGC pta-ackA
34R GATTACCCAGCAGTACGCAAGTTGCGATACCACGTTCAGCACAGATAGCGGCTGCTTTAACGGTACGCGGTTCGTCACCTTCCGGCAGTACGATACGTTTGCCCGCTTTGCAACGACGGATGCCGTGCTCTTTGTACAGGTTGTAAGGCAGCCTTACTTCGGTTCGATGGACTAATACCTGTGACGGAAGATCA
35F TGCCGCTCATATTCCCTCCAGCGAAATTGGCAGCGGCTATTTCCAGGAAACCCACCCACAAGAGCTATTCCGCGAATGTAGTCACTATTGCGAGCTGGTTTCCAGCCCGGAGCAGATCCCACAAGTACTGGCGATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGC poxB
35R AAATCGTCCAGCCCTTTGCGGGCGTCGCGGTAATCTTCCAGCGCTTTATCCAGAAACTTGCGATCGGCTTTTTCTTCCACCAATGGAAGCAATGCACGCAGAGTCGAAATAGCTCTTGTGGGTGGGTTTCCTGGAAATAGCCGCTGCCCTTACTTCGGTTCGATGGACTAATACCTGTGACGGAAGATCA
36F TGCTTTTCAACGATAGCTTCCTGGCAGAGATTTTTTCTTATTATTCCTCCCCATCTGGTGTTACCCTCCTGCCCATTAACCCATTCAACAGAACTGTGACGCGCCATGGCAAATATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGC coaA
36R CGGTCAAACTGTAGGTAAGGCGTCATTAACGTTTGCTCTTTTATACTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAAGCTAGCACTGTACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAACACCAGATGGGGAGGAATAATAAGAAAAAATCTCTGCCAGCCTTACTTCGGTTCGATGGACTAATACCTGTGACGGAAGATCA
37F GGTTACGGCCAGGACAGTCGTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCGGACGTAAAAAGGTGTTTTGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCA metK-proB
37R CGTTCGGCGTATCGCCAAAATCACCGCCGTAAGCCGACCACGGGTTGCCGTTTTCATCATATTTAATCAGCGACTGATCCACCCAGTCCCAGACGAAGCCGCCCTGTAAACGGGGGACCATGATTGCATGCGGTA
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Engineering of Escherichia coli for enhanced production of cinnamaldehyde <130> P20-B250 <160> 115 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3525 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Nocardia iowensis <400> 1 atggcagtgg attcaccgga tgagcggcta cagcgccgca ttgcacagtt gtttgcagaa 60 gatgagcagg tcaaggccgc acgtccgctc gaagcggtga gcgcggcggt gagcgcgccc 120 ggtatgcggc tggcgcagat cgccgccact gttatggcgg gttacgccga ccgcccggcc 180 gccgggcagc gtgcgttcga actgaacacc gacgacgcga cgggccgcac ctcgctgcgg 240 ttacttcccc gattcgagac catcacctat cgcgaactgt ggcagcgagt cggcgaggtt 300 gccgcggcct ggcatcatga tcccgagaac cccttgcgcg caggtgattt cgtcgccctg 360 ctcggcttca ccagcatcga ctacgccacc ctcgacctgg ccgatatcca cctcggcgcg 420 gttaccgtgc cgttgcaggc cagcgcggcg gtgtcccagc tgatcgctat cctcaccgag 480 acttcgccgc ggctgctcgc ctcgaccccg gagcacctcg atgcggcggt cgagtgccta 540 ctcgcgggca ccacaccgga acgactggtg gtcttcgact accaccccga ggacgacgac 600 cagcgtgcgg ccttcgaatc cgcccgccgc 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gcgatatcgt ggccgagctc 1500 gagcacgatc ggctggtcta tgtcgaccgt cgcaacaatg tgctcaaact gtcgcagggc 1560 gagttcgtga ccgtcgccca tctcgaggcc gtgttcgcca gcagcccgct gatccggcag 1620 atcttcatct acggcagcag cgaacgttcc tatctgctcg cggtgatcgt ccccaccgac 1680 gacgcgctgc gcggccgcga caccgccacc ttgaaatcgg cactggccga atcgattcag 1740 cgcatcgcca aggacgcgaa cctgcagccc tacgagattc cgcgcgattt cctgatcgag 1800 accgagccgt tcaccatcgc caacggactg ctctccggca tcgcgaagct gctgcgcccc 1860 aatctgaagg aacgctacgg cgctcagctg gagcagatgt acaccgatct cgcgacaggc 1920 caggccgatg agctgctcgc cctgcgccgc gaagccgccg acctgccggt gctcgaaacc 1980 gtcagccggg cagcgaaagc gatgctcggc gtcgcctccg ccgatatgcg tcccgacgcg 2040 cacttcaccg acctgggcgg cgattccctt tccgcgctgt cgttctcgaa cctgctgcac 2100 gagatcttcg gggtcgaggt gccggtgggt gtcgtcgtca gcccggcgaa cgagctgcgc 2160 gatctggcga attacattga ggcggaacgc aactcgggcg cgaagcgtcc caccttcacc 2220 tcggtgcacg gcggcggttc cgagatccgc gccgccgatc tgaccctcga caagttcatc 2280 gatgcccgca ccctggccgc cgccgacagc attccgcacg 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gtaccactgc agaccagcgc ggcgataacc cagctgcagc cgatcgtcgc cgagacccag 480 cccaccatga tcgcggccag cgtcgacgca ctcgctgacg ccaccgaatt ggctctgtcc 540 ggtcagaccg ctacccgagt cctggtgttc gaccaccacc ggcaggttga cgcacaccgc 600 gcagcggtcg aatccgcccg ggagcgcctg gccggctcgg cggtcgtcga aaccctggcc 660 gaggccatcg cgcgcggcga cgtgccccgc ggtgcgtccg ccggctcggc gcccggcacc 720 gatgtgtccg acgactcgct cgcgctactg atctacacct cgggcagcac gggtgcgccc 780 aagggcgcga tgtacccccg acgcaacgtt gcgaccttct ggcgcaagcg cacctggttc 840 gaaggcggct acgagccgtc gatcacgctg aacttcatgc caatgagcca cgtcatgggc 900 cgccaaatcc tgtacggcac gctgtgcaat ggcggcaccg cctacttcgt ggcgaaaagc 960 gatctctcca ccttgttcga agacctggcg ctggtgcggc ccaccgagct gaccttcgtg 1020 ccgcgcgtgt gggacatggt gttcgacgag tttcagagtg aggtcgaccg ccgcctggtc 1080 gacggcgccg accgggtcgc gctcgaagcc caggtcaagg ccgagatacg caacgacgtg 1140 ctcggtggac ggtataccag cgcactgacc ggctccgccc ctatctccga cgagatgaag 1200 gcgtgggtcg aggagctgct cgacatgcat ctggtcgagg gctacggctc caccgaggcc 1260 gggatgatcc 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ttcttcttct gactcagacc atattcccgc aacttattgg caatcgcggt 60 atgtgaaacg ccgagacgtt ttgccagttt gcgcgtgctg ccgcataggc cactagtgga 120 120 <210> 46 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcccagc aacagatcgc 60 gataataatc gacactatag aacgcggccg 90 <210> 47 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtactca tcacgtcgcc 60 ctgggtgaca ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 48 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 caggtgaata taaggcattg gtttaagatt tcagccaggt tatgaaacgc agcagagaat 60 cttgaaataa gacactatag aacgcggccg 90 <210> 49 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 ttacccgcga cgcgctttta ctgcattcgc cagttgacgt aacagagcat cggtatcttc 60 ccagccgatg ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 50 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 caacttcgtc gaagaagttg aagaagagta gtcctttata ttgagtgtat cgccaacgcg 60 ccttcgggcg gacactatag aacgcggccg 90 <210> 51 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 tcaggttgga tcaacaggca ctacgttctc acttgggtaa cagcccaata ccttcattga 60 acgggtgatt ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 52 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 tcctgcagtt gacggctagc tcagtcctag gtacagtgct agccgacaaa aagaaaggag 60 catctaaca 69 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 gcaggatcct cacaacgtgg ttttcgccgg aa 32 <210> 54 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 ctgctgcgcg atgctgccgg tctgaagtaa tctttcttca cctgcgttca aaggccagcc 60 tcgcgctggc gacactatag aacgcggccg 90 <210> 55 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 caaggaagca gacgaaaaac gtcattgcct tgtttgaccg cccctgtttt ttagcgtcag 60 gcatatgtat atctccttct taaagttcaa gctagcacta tacctaggac tgagctagcc 120 gtaaaccgca taggccacta gtgga 145 <210> 56 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 ctttccggcg ttgttgttat gcccccaggt atttacagtg tgagaaagaa ttattttgac 60 tttagcggag gacactatag aacgcggccg 90 <210> 57 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 tatcacacag agcaagacgt gcgttggtgc cgcccacatc accgactaat gcatactttg 60 tcatatgtat atctccttct taaagttcaa gctagcacta tacctaggac tgagctagcc 120 gtaaaccgca taggccacta gtgga 145 <210> 58 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 tgaaaatgat gtgcggtttg gcgagcgtaa attttgcacc cggttaaaca caattaagca 60 tagaggttaa gacactatag aacgcggccg 90 <210> 59 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 ataaactgtg gcggatagga taggccatca acccaatcaa ttcgtatttt gcggtaacat 60 ccatatgtat atctccttct taaagttcaa gctagcacta tacctaggac tgagctagcc 120 gtaaaccgca taggccacta gtgga 145 <210> 60 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 atcacgccac gactggtttc cagtgagtaa acagccgtaa aagcggtaat gtttttacgc 60 tgaacgtgtt gacactatag aacgcggccg 90 <210> 61 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 gcccaatagt gctttttccg gcacccatag gcccaaccag aaagatattg cgtttctctg 60 ccatatgtat atctccttct taaagttcaa gctagcacta tacctaggac tgagctagcc 120 gtaaaccgca taggccacta gtgga 145 <210> 62 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 gcattctaga ttgaacttta agaaggagat atacatatgc accaccacca tcaccattcg 60 ccaatcacgc gtgaag 76 <210> 63 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 atgcaagctt ttatcagagc aggccgagta ggcg 34 <210> 64 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 gcattctaga ttgaacttta agaaggagat atacatatgc accaccacca tcaccatgca 60 gtggattcac cggat 75 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 atgcaagctt ttatcagagc agctgaagca gttccag 37 <210> 66 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 ataaaagctt ttgaacttta agaaggagat atacatatga agatttacgg aatttatatg 60 gaccg 65 <210> 67 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 gccaagctta tcaatggtga tggtggtggt gtaaaagctc ttcgtacgag acc 53 <210> 68 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 ataaaagctt ttgaacttta agaaggagat atacatatga tcgagacaat tttgcctg 58 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 gccaagctta tcaatggtga tggtggtggt gggcgtacgc gatcgcggt 49 <210> 70 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 atggctatcc ctgcatttgg tttaggtact ttccgtctga aagacgacgt tgttatttca 60 tctgtgataa gacactatag aacgcggccg 90 <210> 71 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 ttaatcccat tcaggagcca gaccttccgg gctaaccagg cggtcgttgc aatccagtgc 60 ggcgatcgct ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 72 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 atgaagatca aagctgttgg tgcatattcc gctaaacaac cacttgaacc gatggatatc 60 acccggcgtg gacactatag aacgcggccg 90 <210> 73 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 tcagtctgtt agtgtgcgat tatcgataac aaaacgatat ttcacatcac cgcgcagcat 60 tcgctcatag ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 74 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 atgcaacaaa aaatgattca atttagtggc gatgtctcac tgccagccgt agggcaggga 60 acatggtata gacactatag aacgcggccg 90 <210> 75 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 75 tcacaccata tccagcgcag tttttccttt tggtgccgga tatgccttat ccagcatagc 60 taattccgct ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 76 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 atgtcgatga taaaaagcta tgccgcaaaa gaagcgggcg gcgaactgga agtttatgag 60 tacgatcccg gacactatag aacgcggccg 90 <210> 77 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 tcaaaaatcg gctttcaaca ccacgcggta acgcgcctta ccgtcgcgca catgctggat 60 ggcgtcgtta ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 78 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 ccgattttat gcccggaaaa gagaattatg atgccaggct cgtacatcac cggtgtacgt 60 gcgaaaggcg gacactatag aacgcggccg 90 <210> 79 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 ttccacagct tagtggtgat gaacagttct tctctgttga ctgaggcatt tttcagggct 60 ttgccgacac ccgcataggc cactagtgga 90 <210> 80 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 80 atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60 ctgggcgaat gacactatag aacgcggccg 90 <210> 81 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 81 tccactagtg gcctatgcgg gccagatcag gtttacgccg ctctgctggt agccgaccag 60 tacggtcagc gtttcctgca agagtgggaa 90 <210> 82 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 82 atgactcata aagcaacgga gatcctgaca ggtaaagtta tgcaaaaatc ggtcttaatt 60 accggatgtt gacactatag aacgcggccg 90 <210> 83 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 83 tccactagtg gcctatgcgg ggtgacctgg gcggtaatgg tgcttaagcg cctgctgccg 60 gggcgcgtga tggacaaaat attgcagggg 90 <210> 84 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 atggaacgtt ttcttgaaaa tgcaatgtat gcttctcgct ggctgcttgc ccccgtgtac 60 tttggccttt gacactatag aacgcggccg 90 <210> 85 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 tccactagtg gcctatgcgg tatccatctg acgtttgtgc tttctgcatt tgtgatgggc 60 tatcttgacc gactgactcg tcataatcac 90 <210> 86 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 86 gcatgagctc ttgaacttta agaaggagat atacatatgg ggaccttcgt tattgaact 59 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 87 actggtacct tatcacttgt catcgtcatc cttgtagtc 39 <210> 88 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 88 gctagaattc ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcttgaa ctttaagaag 60 gagatataca tatggggacc ttcgttattg aactggatat 100 <210> 89 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 89 atgcatgctc tcatgagcgg atacatattt gaatgtat 38 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 90 gctagtcgac gcaaggccgt ttctacgcgc 30 <210> 91 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 91 atcgaattca caacaaaaac cacccattga ca 32 <210> 92 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 92 gctagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaaggcgc gccatttaaa tgaagttcct 60 attccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg aagcagctcc agcctacgat 120 tataaatatg ctgtgcgcga ac 142 <210> 93 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 93 atgagtactc tcacgagcga cacagacat 29 <210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 94 gcatgaattc ccatttccct tctctacgga tgatt 35 <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 95 atgcggatcc aatactctct cctgaattta tgattcacg 39 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 gcatccatgg aaagggatga tccaaccg 28 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 atgcgaattc agcgatagcg ccggcttagt 30 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 gcatctgcag gagatctgcc tttgccggat 30 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 catgggccac agtggccggg aggctgcccg aaacacc 37 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 100 gcatactagt aggatctgat gggtaccgtt c 31 <210> 101 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 101 atgctgcagt aggtgacact atagaacgcg gccgccagct gaagctttac cgttcgtata 60 gcatacatta tac 73 <210> 102 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 102 gcatggccac agtggccggt cagaccaagt t 31 <210> 103 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 103 atgccatggc atggctaatt cccatgtcag ccgttaagtg ttcc 44 <210> 104 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 104 cacggctgaa tcgttaatat tttgcgagtt cacgccgaaa tactgatttt tggcgctaga 60 tcacaggcat gacactatag aacgcggccg 90 <210> 105 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 105 ccactgtttt tggcgttgct gcaacacggg tttcattggt taaccgttct cttggtatgc 60 caattcgcat agctgtttcc tggtttaaac cgaattggtg gggcgagagg ctcaattata 120 tcaacgttgt tatctcttgt caacaccgcc agagataacc gcataggcca ctagtgga 178 <210> 106 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 106 tcgctaactt cgcttattat ggggatcagt ttcagggttt caagggaagc actcacattg 60 tcatcaatct gacactatag aacgcggccg 90 <210> 107 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 107 catgtgttgt cagtgcagtg gggtgccgtg ggtgtcccac aatgccaata cacttgaaat 60 gattattcat agctgtttcc tggtttaaac aataaattac gagccagtgg ctcaattata 120 tcaacgttgt tatctcttgt caacaccgcc agagataacc gcataggcca ctagtgga 178 <210> 108 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 108 acggcgcgca cggcaccagc cacttctatg taacccagga agcggcaaaa atgctgaaca 60 aaccggtaga agaactgaac atcatcacct gccacctggg caacggtggt tccgtttctg 120 ctatccgcaa cgtccgctta ttatcactta ttcaggc 157 <210> 109 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 109 gattacccag cagtacgcaa gttgcgatac cacgttcagc acagatagcg gctgctttaa 60 cggtacgcgg ttcgtcacct tccggcagta cgatacgttt gcccgctttg caacgacgga 120 tgccgtgctc tttgtacagg ttgtaaggca gccttacttc ggttcgatgg actaatacct 180 gtgacggaag atca 194 <210> 110 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 110 tgccgctcat attccctcca gcgaaattgg cagcggctat ttccaggaaa cccacccaca 60 agagctattc cgcgaatgta gtcactattg cgagctggtt tccagcccgg agcagatccc 120 acaagtactg gcgatccgct tattatcact tattcaggc 159 <210> 111 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 111 aaatcgtcca gccctttgcg ggcgtcgcgg taatcttcca gcgctttatc cagaaacttg 60 cgatcggctt tttcttccac caatggaagc aatgcacgca gagtcgaaat agctcttgtg 120 ggtgggtttc ctggaaatag ccgctgccct tacttcggtt cgatggacta atacctgtga 180 cggaagatca 190 <210> 112 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 112 tgcttttcaa cgatagcttc ctggcagaga ttttttctta ttattcctcc ccatctggtg 60 ttaccctcct gcccattaac ccattcaaca gaactgtgac gcgccatggc aaatatccgc 120 ttattatcac ttattcaggc 140 <210> 113 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 113 cggtcaaact gtaggtaagg cgtcattaac gtttgctctt ttatactcat atgtatatct 60 ccttcttaaa gttcaagcta gcactgtacc taggactgag ctagccgtca acaccagatg 120 gggaggaata ataagaaaaa atctctgcca gccttacttc ggttcgatgg actaatacct 180 gtgacggaag atca 194 <210> 114 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 114 ggttacggcc aggacagtcg taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat 60 aatggttgcg gacgtaaaaa ggtgttttgc cattttctgt tgggccattg ca 112 <210> 115 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 115 cgttcggcgt atcgccaaaa tcaccgccgt aagccgacca cgggttgccg ttttcatcat 60 atttaatcag cgactgatcc acccagtccc agacgaagcc gccctgtaaa cgggggacca 120 tgattgcatg cggta 135

Claims (22)

  1. PTS (phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system) 및 GalP (D-galactose transporter) 생합성능을 가지는 대장균에,
    (i) 카르복시산 환원효소 (carboxylic acid reductase)를 인코딩하는 유전자; 및 (ii) 포스포판테테이닐 전이효소 (phosphopantetheinyl transferase)를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있고,
    야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 dkgB(2,5-diketo-D-gluconate reductase B), yahK(oxidoreductase), yeaE(oxidoreductase), yjgB(alcohol dehydrogenase), yqhC(DNA-binding transcriptional regulator), yqhD(alcohol dehydrogenase), dkgA(2,5-diketo-D-gluconate reductase A), gldA(glycerol dehydrogenase), ybbO(oxidoreductase) 및 yqhA(inner membrane protein) 유전자가 추가로 결실되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자는 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래의 car 유전자인 것을 특징으로 하는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 sfp 유전자 또는 노카디아 이오웬시스(Nocardia iowensis) 유래의 npt 유전자인 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은
    (i) crr (glucose-specific enzyme IIA components of PTS), tyrR (DNA-binding transcriptional dual regulator) 및 pykA (pyruvate kinase) 유전자가 결실; 및
    (ii) aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase) 및 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)의 피드백 저항성이 향상되도록 변이되어 있는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  5. 제4항에 있어서, 상기 aroG (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase)는 aroG8/15로 교체 및 pheA (fused chorismate mutase P and prephenate dehydratase)는 pheAfbr/dm 로 교체되어 있고,
    상기 교체된 aroG8/15 및 pheAfbr/dm 의 프로모터는 상시 발현 프로모터인 것을 특징으로 하는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 galP (D-galactose transporter) 및 glk (glucokinase) 유전자의 프로모터가 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 페닐알라닌 암모니아 분해효소 (phenylalanine ammonia lyase)를 인코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  9. 제8항에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 상시 발현 프로모터 하에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  10. 제8항에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 스트렙토미세스 마리티무스(Streptomyces maritimus) 유래의 pal 유전자인 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  11. 제8항에 있어서, 상기 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 인코딩하는 유전자는 대장균에 내재적으로 존재하는 gidB (methyltransferase)와 atpI (ATP synthase) 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  12. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은 마이코박테리움 마리눔 유래의 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자 및 노카디아 이오웬시스 유래의 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 상기 카르복시산 환원효소를 인코딩하는 유전자 및 포스포판테테이닐 전이효소를 인코딩하는 유전자는 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 aslA (putative anaerobic sulfatase maturation enzyme AslB)와 aslB (putative anaerobic sulfatase maturation enzyme AslB) 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  13. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제 α & β(pyridine nucleotide transhydrogenase α & β) 코딩 유전자 pntAB 및 NAD 키나아제 (NAD kinase) 코딩 유전자 yfjB 의 프로모터가 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  14. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 pta-ackA (phosphate acetyltransferase & acetate kinase A) 및 poxB (pyruvate dehydrogenase) 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  15. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 coaA (pantothenate kinase) 유전자의 프로모터가 상시 발현 프로모터로 교체되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  16. 제1항에 있어서, 상기 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균은, 야생형 대장균에 내재적으로 존재하는 metK (methionine adenosyltransferase) 및 proB (γkinase) 유전자가 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 하는, 신남알데히드 생산성이 향상된 재조합 대장균.
  17. 제5항, 제6항, 제9항, 제13항 및 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상시 발현 프로모터는 BBa_J23100, BBa_J23106, M1-46, M1-37 및 bacteriophage λPR로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 대장균
  18. 다음 단계를 포함하는 신남알데히드의 생산방법:
    (a) 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 배양하여 신남알데히드를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 신남알데히드를 회수하는 단계.
  19. 삭제
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