CN115094015A - 一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途 - Google Patents

一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产(‑)‑α‑红没药醇的基因工程菌，通过在含有特定基因：MrBBS基因、ispA基因和mvaKmm等MVA途径基因的重组大肠杆菌的基础上，进一步引入密码子优化的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰CoA还原酶mvaA‑1基因和乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因，使得到的重组大肠杆菌之在生产过程的摇瓶阶段产量从6.8g/L进一步提高到了7.9g/L；进一步敲除大肠杆菌基因组上的富马酸还原酶frdC基因、乙醛‑CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因，摇瓶阶段产量可进一步提升至9.5g/L，适宜实际推广应用。

Description

一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于基因重组发酵技术领域，具体涉及一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途。
背景技术
红没药醇是一种有机化合物，分子式为C15H26O，是一种存在天然精油中无毒的倍半萜烯醇；在自然界中以两种结构形式存在：β和α。β-红没药醇是从玉米和棉花中收获的，主要用作调味剂。(-)-α-红没药醇主要存在于春黄菊精油中，含量达17％，其右旋体存在于胶杨精油以及某些苦槛蓝属和鼠尾草属的精油中，具有消炎、灭菌、愈合溃疡、溶解胆石等药效，故在医药行业中的用途较广。
(-)-α-红没药醇能够保护和治愈皮肤，使其免受日常张力的影响，能够加速皮肤的治愈过程，尤其适用于作为敏感皮肤和身体，被广泛应用于个人护肤(皮肤和身体的护理液、须后水和晒后护理产品)的配方中，加上其抗炎、天然、安全特性，使其成为一种用于皮肤护理的常用活性成分。国际上仅个人护理产品上的应用年需求量达到400t以上，逐渐成为个人护肤品原料新宠；此外，(-)-α-红没药醇香气清淡愉快，也是一种稳定性较好的定香剂，在香料香精中的应用也日益受到重视；然而，(-)-α-红没药醇作为次级代谢产物，纯天然从植物提取的量俨然无法满足市场的需求，因其受制于生物生长周期，环境等各种因素，扩大生产规模会导致生态环境的破坏甚至物种灭绝；若采用化学合成方法，α-红没药醇复杂手性化学结构，使得直接化学合成难度高，生物活性低以及纯度低等弊端。因此，利用合成生物学构建工程菌实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值的(-)-α-红没药醇是一条最具有潜力的途径。
目前文献报道中，利用基因工程菌生产(-)-α-红没药醇，发酵罐取得一定成果，但摇瓶产量并不理想；2016年Gui Hwan Han等人以大肠杆菌为宿主细胞，通过质粒过表达德国洋甘菊来源的(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS、大肠杆菌来源的ispA以及外源性MVA途径，从而获得最终产(-)-α-红没药醇基因工程菌，发酵48h后产量仅为0.08g/L；CN110016458A公开了一种利用基因工程菌生产(-)-α-红没药醇的方法，其虽然摇瓶产量达到4.15g/L，但还有进一步提高的空间，以促使发酵罐放大生产后的产量呈倍数级提高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌。其以E.coli携带双质粒pSTV28-24(包含(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因，以及MVA途径基因：mvaKmm、mvaD、mvaK2、idi、mvaS和mvaE)和pTrc99A-1(包含MVA途径基因：mvaD、mvaK2、idi、mvaK1)为底盘宿主的重组基因工程菌为基础，除了底盘宿主包含的基因外还包含乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因(原位替换pSTV28-24中的mvaE基因)、密码子优化的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因并在基因组上敲除富马酸还原酶frdC基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因。
本发明提供了一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌，它是重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含如下基因：
(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、MVA途径基因、乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因；
其中，MVA途径基因包括甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因和/或甲羟戊酸激酶mvaK1基因；
所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，上述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因来自春黄菊花；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因来源于大肠杆菌Escherichia coli；所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因来自甲烷八叠球古菌Methanosarcina mazei；所述甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和甲羟戊酸激酶mvaK1基因来自肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae；所述异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因来自大肠杆菌Escherichia coli；所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因来自粪肠球菌Enterococcus faecalis；
所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因来自大肠杆菌Escherichia coli，所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因是来源于Silicibacter pomeroyi的mvaA基因进行密码子优化后所得。
更进一步地，上述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述法尼基二磷酸合酶ispA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因序列如SEQ ID NO.4所示；
所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，甲羟戊酸激酶mvaK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，上述重组大肠杆菌不含如下基因：富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因、乳酸脱氢酶ldhA基因。
更进一步地，上述富马酸还原酶frdc基因序列如SEQ ID NO.5所示；
所述乙醛-CoA脱氢酶adhE基因序列如SEQ ID NO.6所示；
所述乳酸脱氢酶ldhA基因序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，上述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因的5’端连接有如SEQID NO.14所示序列；
所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因的5’端连接有序列GGTTAAACC；
所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的5’端连接有如SEQ ID NO.15所示序列；所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因的5’端连接有如SEQ ID NO.16所示序列；所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的5’端连接有如SEQ ID NO.17所示序列；所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的5’端连接有如SEQ ID NO.18所示序列。
进一步地，上述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌E.coli DH5α或E.coli W3110。
进一步地，上述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因与法尼基二磷酸合酶ispA基因之间连接有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；
优选地，所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因去掉终止密码子TAA，所述法尼基二磷酸合酶ispA基因去掉起始密码子ATG后，通过SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列连接。
进一步地，上述重组菌是含有重组质粒pSTV28-24-a和重组质粒pTrc99A-1的大肠杆菌；
所述重组质粒pSTV28-24-a是含有(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因的pSTV28质粒；
所述重组质粒pTrc99A-1是含有甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、甲羟戊酸激酶mvaK1基因的pTrc99A质粒。
更进一步地，上述重组质粒pSTV28-24-a是含有如SEQ ID NO.20和如SEQ IDNO.21所示序列的pSTV28质粒；
所述重组质粒pTrc99A-1是含有如SEQ ID NO.22所示序列的pTrc99A质粒。
本发明还提供了上述的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
1)取(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因和法尼基二磷酸合酶ispA基因融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体A；
2)取甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因融合，融合产物与酶切后的步骤1)所得重组表达载体A连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体B；所述乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因序列如SEQ ID NO.23所示；
3)取乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因与酶切后的步骤2)所得重组表达载体B连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体C；
4)取3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因与酶切后的步骤3)所得重组表达载体C连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体D；
5)取甲羟戊酸激酶mvaK1基因，与包含甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的基因片段融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体E；
6)将步骤4)所得重组表达载体D、步骤5)所得重组表达载体E导入大肠杆菌中，即得。
进一步地，步骤6)所述大肠杆菌是：在大肠杆菌基因组上叠加敲除富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组大肠杆菌；
优选地，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌基因组上叠加敲除富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组大肠杆菌E.coli DH5α或E.coli W3110；
进一步地，步骤1)所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因中的终止密码子TAA被如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列代替；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因中的起始密码子ATG被如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列代替。
进一步地，步骤3)所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因原位替换重组表达载体B上的mvaE基因，与重组表达载体B连接。
进一步地，步骤1)所述线性化表达载体是psTV28质粒，和/或，步骤5)所述线性化表达载体是pTrc99A质粒。
本发明还提供了上述的重组基因工程菌在制备(-)-α-红没药醇及其制剂中的用途。
本发明还提供了一种产(-)-α-红没药醇的方法，它包括如下步骤：
(1)取上述未敲除富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组基因工程菌，接种于种子培养基，培养8～10h；
(2)将种子液接种于发酵培养基，加正十二烷以及IPTG，发酵培养30～60h，分离纯化即得；
所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、磷酸氢二钾2～3g/L、酵母粉20～25g/L、酵母蛋白胨10～15g/L、IPTG 0.05～0.15mM、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度为30～40mg/L，余量为水。
优选地，所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基、正十二烷的体积比为5：1，IPTG的添加量为：培养容器容量0.04％的0.25M IPTG母液。
进一步地，上述发酵培养的条件为：振荡培养，温度30℃，转速200rpm。
本发明还提供了另一种产(-)-α-红没药醇的方法，它包括如下步骤：
(1)取上述敲出了富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组基因工程菌，接种于种子培养基，培养8～10h；再接种于含葡萄糖的LB培养基中，培养时间16-20h，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基，加正十二烷、碳酸镁以及IPTG，厌氧发酵培养30～60h，分离纯化即得；
所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、葡萄糖5～15g/L氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述含葡萄糖的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、葡萄糖10～20g/L、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L和氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、磷酸氢二钾2～3g/L、酵母粉20～25g/L、酵母蛋白胨10～15g/L、碳酸镁15～25g/L、IPTG 0.05～0.15mM、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度为30～40mg/L，余量为水；
优选地，所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述含葡萄糖的LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、10g/L葡萄糖、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、碳酸镁20g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水。
所述发酵培养基、正十二烷的体积比为5：1，IPTG的添加量为：培养容器容量0.04％的0.25M IPTG母液。
进一步地，上述种子液离心收集菌体的OD600至少为20，再转入发酵培养基进行厌氧发酵培养；所述厌氧发酵培养条件为：振荡培养，温度30℃，转速200rpm，以1mL/min速度注入CO2 1min。
本发明的有益效果：本发明提供了一种产(-)-α-红没药醇的基因工程菌，通过在含有特定基因：MrBBS基因、ispA基因和mvaKmm等MVA途径基因的重组大肠杆菌的基础上，进一步引入，密码子优化的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因和乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因，使得到的重组大肠杆菌之在生产过程的摇瓶阶段产量从6.8g/L进一步提高到了7.9g/L；进一步敲除大肠杆菌基因组上的富马酸还原酶frdC基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因，产量可进一步提升至9.5g/L。本发明高摇瓶阶段产量的基因工程菌，再经发酵罐放大后的产量相对目前公开报道的产量进一步突破新高，适宜实际推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 E.coli中(-)-α-红没药醇合成代谢图。
图2 pTrc99A-1质粒图谱。
图3 pSTV28-4质粒图谱。
图4(-)-α-红没药醇的GC-MS分析。
图5试验实例1重组大肠杆菌在摇瓶上培养50h后(-)-α-红没药醇积累量。
图6试验实例2重组大肠杆菌在摇瓶上培养50h后(-)-α-红没药醇积累量。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明涉及的核苷酸序列信息：
(一)功能基因序列
3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
ATGACCGGCAAAACCGGCCATATTGATGGCCTGAACAGCCGCATTGAAAAAATGCGCGATCTGGATCCGGCGCAGCGCTTAGTGCGCGTGGCGGAAGCCGCGGGCCTGGAACCGGAAGCGATTAGTGCGCTGGCGGGCAACGGCGCGCTGCCGCTGAGCCTGGCGAACGGCATGATTGAAAACGTGATTGGCAAATTTGAGTTACCGTTAGGCGTGGCGACCAACTTTACCGTGAACGGCCGCGATTATCTGATTCCGATGGCGGTGGAAGAACCGAGCGTGGTGGCGGCCGCGAGCTATATGGCGCGCATTGCGCGCGAAAACGGCGGCTTTACCGCGCATGGCACCGCGCCGCTGATGCGCGCGCAGATTCAAGTGGTGGGCCTGGGTGATCCGGAAGGCGCGCGTCAGCGCCTGCTGGCGCATAAAGCGGCGTTTATGGAAGCGGCGGATGCGGTGGATCCGGTGTTAGTGGGTTTAGGCGGTGGCTGCCGCGATATTGAAGTGCATGTGTTTCGCGATACCCCGGTGGGCGCGATGGTGGTGCTGCATCTGATTGTGGATGTGCGCGATGCGATGGGCGCGAACACCGTGAACACCATGGCGGAACGCCTGGCCCCGGAAGTGGAACGCATTGCGGGCGGCACCGTGCGCCTGCGCATTCTGAGCAACCTGGCGGATCTGCGCCTGGTGCGCGCGCGCGTGGAACTGGCGCCGGAAACGCTGACCACCCAAGGCTATGATGGCGCGGATGTGGCGCGCGGCATGGTGGAAGCGTGCGCGCTGGCCATTGTGGATCCGTATCGCGCGGCGACCCATAACAAAGGCATTATGAACGGCATTGATCCGGTGGTTGTGGCGACCGGCAACGATTGGCGCGCGATTGAAGCGGGCGCGCATGCGTATGCGGCGCGCACCGGCCATTATACGAGCCTGACCCGCTGGGAACTGGCGAACGATGGCCGCCTGGTGGGCACGATCGAACTGCCGCTGGCGTTAGGTCTGGTTGGCGGTGCGACCAAGACGCACCCGACCGCGCGTGCGGCGCTGGCGCTGATGCAAGTGGAGACGGCGACCGAACTGGCCCAAGTGACCGCCGCGGTGGGTCTGGCGCAGAACATGGCGGCGATTCGCGCGTTAGCGACGGAAGGCATTCAGCGCGGCCATATGACCCTGCATGCGCGCAACATTGCGATTATGGCGGGCGCGACCGGCGCGGATATTGATCGCGTGACCCGCGTGATTGTGGAAGCGGGCGATGTGAGCGTGGCGCGCGCGAAACAAGTGCTGGAAAACACCTAA
(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：ATGAGCACACTGAGCGTCAGCACCCCGAGCTTTAGCAGCAGCCCTCTGTCGAGCGTGAATAAGAACAGCACCAAGCAGCATGTCACTCGTAACAGCGTGATCTTTCACGACTCGATTTGGGGGGACCAGTTCCTGGAATACAAAGAGAAATTCAACGTTGCAACCGAGAAACAGCTTATAGAAGAGCTGAAAGAAGAAGTGCGTAACGAACTGATGATTCGTGCATGTAATGAAGCGAGCCGGTATATCAAACTGATCCAGCTGATCGATGTTGTTGAACGTCTGGGGCTGGCCTATCATTTTGAAAAAGAGATTGAGGAAAGCCTCCAGCATATATATGTGACGTATGGTCATAAATGGACGAATTACAACAATATTGAGAGCCTGAGTCTGTGGTTCCGCCTGCTTCGTCAAAATGGCTTTAATGTTAGCTCGGATATATTTGAAAATCACATTGATGAGAAAGGAAATTTTCAGGAGAGCCTGTGCAATGATCCGCAGGGGATGCTGGCGCTGTATGAAGCGGCATATATGCGTGTTGAAGGAGAGATCATTCTGGACAAAGCACTCGAATTTACCAAGCTGCATCTGGGGATCATTAGCAATGATCCTAGCTGTGATAGCAGCCTACGTACGGAAATCAAGCAGGCACTGAAACAGCCACTGCGCCGGCGGCTGCCAAGGCTGGAAGCCGTTCGTTACATTGCCATTTATCAGCAGAAGGCGAGCCATAGCGAGGTTCTGCTGAAGCTGGCCAAACTGGACTTCAACGTTCTGCAGGAAATGCACAAAGACGAATTGAGCCAAATATGCAAATGGTGGAAAGATCTGGATATACGTAACAAACTGCCCTATGTTCGTGATCGTCTGATTGAAGGCTATTTTTGGATTCTGGGTATTTATTTCGAACCGCAACACTCCCGTACCCGTATGTTCCTGATGAAAACCTGTATGTGGCTGATCGTGCTGGACGATACGTTTGATAATTACGGCACCTATGAAGAGTTAGAGATCTTTACCCAAGCAGTCGAACGTTGGAGCATTACCTGTCTGGATGAACTGCCAGAGTATATGAAGCTGATATATCACGAGCAATTTCGCGTGCATCAGGAAATGGAGGAAAGCCTGGAAAAGGAGGGTAAGGCCTACCAGATTCATTATATCAAAGAAATGGCCAAAGAAGGTACTCGTTCGCTGCTGCTGGAAGCGAAATGGCTGAAGGAAGGCTATATGCCTACCCTGGATGAGTACCTGAGCAACAGCCTGGTCACCTGCGGCTATGCACTGATGACCGCACGCAGCTACGTTGCCCGTGACGACGGCATTGTTACCGAAGATGCATTCAAATGGGTTGCAACGCACCCGCCGATTGTTAAAGCAGCATGCAAAATTCTGCGCCTGATGGACGACATTGCAACCCATAAAGAGGAACAGGAGCGGGGACACATTGCAAGTAGCATTGAGTGTTACAGGAAGGAAACCGGAGCTAGCGAAGAGGAGGCTTGCATGGACTTTCTGAAGCAGGTTGAAGATGGTTGGAAAGTTATTAATCAAGAAAGCCTGATGCCGACCGATGTTCCGTTCCCTCTGCTGATTCCGGCAATTAACCTGGCACGTGTGAGCGACACCCTGTACAAAGACAACGATGGTTATAATCATGCCGATAAAGAGGTTATAGGTTATATTAAAAGCCTGTTTGTACATCCGATGATAGTCTAA
法尼基二磷酸合酶ispA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：ATGGACTTTCCGCAGCAACTCGAAGCCTGCGTTAAGCAGGCCAACCAGGCGCTGAGCCGTTTTATCGCCCCACTGCCCTTTCAGAACACTCCCGTGGTCGAAACCATGCAGTATGGCGCATTATTAGGTGGTAAGCGCCTGCGACCTTTCCTGGTTTATGCCACCGGTCATATGTTCGGCGTTAGCACAAACACGCTGGACGCACCCGCTGCCGCCGTTGAGTGTATCCACGCTTACTCATTAATTCATGATGATTTACCGGCAATGGATGATGACGATCTGCGTCGCGGTTTGCCAACCTGCCATGTGAAGTTTGGCGAAGCAAACGCGATTCTCGCTGGCGACGCTTTACAAACGCTGGCGTTCTCGATTTTAAGCGATGCCGATATGCCGGAAGTGTCGGACCGCGACAGAATTTCGATGATTTCTGAACTGGCGAGCGCCAGTGGTATTGCCGGAATGTGCGGTGGTCAGGCATTAGATTTAGACGCGGAAGGCAAACACGTACCTCTGGACGCGCTTGAGCGTATTCATCGTCATAAAACCGGCGCATTGATTCGCGCCGCCGTTCGCCTTGGTGCATTAAGCGCCGGAGATAAAGGACGTCGTGCTCTGCCGGTACTCGACAAGTATGCAGAGAGCATCGGCCTTGCCTTCCAGGTTCAGGATGACATCCTGGATGTGGTGGGAGATACTGCAACGTTGGGAAAACGCCAGGGTGCCGACCAGCAACTTGGTAAAAGTACCTACCCTGCACTTCTGGGTCTTGAGCAAGCCCGGAAGAAAGCCCGGGATCTGATCGACGATGCCCGTCAGTCGCTGAAACAACTGGCTGAACAGTCACTCGATACCTCGGCACTGGAAGCGCTAGCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAA
乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：
ATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTGCGGTACGTACTGCTATCGGTAGTTTTAACGGTTCACTCGCTTCCACCAGCGCCATCGACCTGGGGGCGACAGTAATTAAAGCCGCCATTGAACGTGCAAAAATCGATTCACAACACGTTGATGAAGTGATTATGGGTAACGTGTTACAAGCCGGGCTGGGGCAAAATCCGGCGCGTCAGGCACTGTTAAAAAGCGGGCTGGCAGAAACGGTGTGCGGATTCACGGTCAATAAAGTATGTGGTTCGGGTCTTAAAAGTGTGGCGCTTGCCGCCCAGGCCATTCAGGCAGGTCAGGCGCAGAGCATTGTGGCGGGGGGTATGGAAAATATGAGTTTAGCCCCCTACTTACTCGATGCAAAAGCACGCTCTGGTTATCGTCTTGGAGACGGACAGGTTTATGACGTAATCCTGCGCGATGGCCTGATGTGCGCCACCCATGGTTATCATATGGGGATTACCGCCGAAAACGTGGCTAAAGAGTACGGAATTACCCGTGAAATGCAGGATGAACTGGCGCTACATTCACAGCGTAAAGCGGCAGCCGCAATTGAGTCCGGTGCTTTTACAGCCGAAATCGTCCCGGTAAATGTTGTCACTCGAAAGAAAACCTTCGTCTTCAGTCAAGACGAATTCCCGAAAGCGAATTCAACGGCTGAAGCGTTAGGTGCATTGCGCCCGGCCTTCGATAAAGCAGGAACAGTCACCGCTGGGAACGCGTCTGGTATTAACGACGGTGCTGCCGCTCTGGTGATTATGGAAGAATCTGCGGCGCTGGCAGCAGGCCTTACCCCCCTGGCTCGCATTAAAAGTTATGCCAGCGGTGGCGTGCCCCCCGCATTGATGGGTATGGGGCCAGTACCTGCCACGCAAAAAGCGTTACAACTGGCGGGGCTGCAACTGGCGGATATTGATCTCATTGAGGCTAATGAAGCATTTGCTGCACAGTTCCTTGCCGTTGGGAAAAACCTGGGCTTTGATTCTGAGAAAGTGAATGTCAACGGCGGGGCCATCGCGCTCGGGCATCCTATCGGTGCCAGTGGTGCTCGTATTCTGGTCACACTATTACATGCCATGCAGGCACGCGATAAAACGCTGGGGCTGGCAACACTGTGCATTGGCGGCGGTCAGGGAATTGCGATGGTGATTGAACGGTTGAATTAA
富马酸还原酶frdc基因核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：
ATGACGACTAAACGTAAACCGTATGTACGGCCAATGACGTCCACCTGGTGGAAAAAATTGCCGTTTTATCGCTTTTACATGCTGCGCGAAGGCACGGCGGTTCCGGCTGTGTGGTTCAGCATTGAACTGATTTTCGGGCTGTTTGCCCTGAAAAATGGCCCGGAAGCCTGGGCGGGATTCGTCGACTTTTTACAAAACCCGGTTATCGTGATCATTAACCTGATCACTCTGGCGGCAGCTCTGCTGCACACCAAAACCTGGTTTGAACTGGCACCGAAAGCGGCCAATATCATTGTAAAAGACGAAAAAATGGGACCAGAGCCAATTATCAAAAGTCTCTGGGCGGTAACTGTGGTTGCCACCATCGTAATCCTGTTTGTTGCCCTGTACTGGTAA
乙醛-CoA脱氢酶adhE基因核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：
ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTAAAAAAAGCCCAGCGTGAATATGCCAGTTTCACTCAAGAGCAAGTAGACAAAATCTTCCGCGCCGCCGCTCTGGCTGCTGCAGATGCTCGAATCCCACTCGCGAAAATGGCCGTTGCCGAATCCGGCATGGGTATCGTCGAAGATAAAGTGATCAAAAACCACTTTGCTTCTGAATATATCTACAACGCCTATAAAGATGAAAAAACCTGTGGTGTTCTGTCTGAAGACGACACTTTTGGTACCATCACTATCGCTGAACCAATCGGTATTATTTGCGGTATCGTTCCGACCACTAACCCGACTTCAACTGCTATCTTCAAATCGCTGATCAGTCTGAAGACCCGTAACGCCATTATCTTCTCCCCGCACCCGCGTGCAAAAGATGCCACCAACAAAGCGGCTGATATCGTTCTGCAGGCTGCTATCGCTGCCGGTGCTCCGAAAGATCTGATCGGCTGGATCGATCAACCTTCTGTTGAACTGTCTAACGCACTGATGCACCACCCAGACATCAACCTGATCCTCGCGACTGGTGGTCCGGGCATGGTTAAAGCCGCATACAGCTCCGGTAAACCAGCTATCGGTGTAGGCGCGGGCAACACTCCAGTTGTTATCGATGAAACTGCTGATATCAAACGTGCAGTTGCATCTGTACTGATGTCCAAAACCTTCGACAACGGCGTAATCTGTGCTTCTGAACAGTCTGTTGTTGTTGTTGACTCTGTTTATGACGCTGTACGTGAACGTTTTGCAACCCACGGCGGCTATCTGTTGCAGGGTAAAGAGCTGAAAGCTGTTCAGGATGTTATCCTGAAAAACGGTGCGCTGAACGCGGCTATCGTTGGTCAGCCAGCCTATAAAATTGCTGAACTGGCAGGCTTCTCTGTACCAGAAAACACCAAGATTCTGATCGGTGAAGTGACCGTTGTTGATGAAAGCGAACCGTTCGCACATGAAAAACTGTCCCCGACTCTGGCAATGTACCGCGCTAAAGATTTCGAAGACGCGGTAGAAAAAGCAGAGAAACTGGTTGCTATGGGCGGTATCGGTCATACCTCTTGCCTGTACACTGACCAGGATAACCAACCGGCTCGCGTTTCTTACTTCGGTCAGAAAATGAAAACGGCGCGTATCCTGATTAACACCCCAGCGTCTCAGGGTGGTATCGGTGACCTGTATAACTTCAAACTCGCACCTTCCCTGACTCTGGGTTGTGGTTCTTGGGGTGGTAACTCCATCTCTGAAAACGTTGGTCCGAAACACCTGATCAACAAGAAAACCGTTGCTAAGCGAGCTGAAAACATGTTGTGGCACAAACTTCCGAAATCTATCTACTTCCGCCGTGGCTCCCTGCCAATCGCGCTGGATGAAGTGATTACTGATGGCCACAAACGTGCGCTCATCGTGACTGACCGCTTCCTGTTCAACAATGGTTATGCTGATCAGATCACTTCCGTACTGAAAGCAGCAGGCGTTGAAACTGAAGTCTTCTTCGAAGTAGAAGCGGACCCGACCCTGAGCATCGTTCGTAAAGGTGCAGAACTGGCAAACTCCTTCAAACCAGACGTGATTATCGCGCTGGGTGGTGGTTCCCCGATGGACGCCGCGAAGATCATGTGGGTTATGTACGAACATCCGGAAACTCACTTCGAAGAGCTGGCGCTGCGCTTTATGGATATCCGTAAACGTATCTACAAGTTCCCGAAAATGGGCGTGAAAGCGAAAATGATCGCTGTCACCACCACTTCTGGTACAGGTTCTGAAGTCACTCCGTTTGCGGTTGTAACTGACGACGCTACTGGTCAGAAATATCCGCTGGCAGACTATGCGCTGACTCCGGATATGGCGATTGTCGACGCCAACCTGGTTATGGACATGCCGAAGTCCCTGTGTGCTTTCGGTGGTCTGGACGCAGTAACTCACGCCATGGAAGCTTATGTTTCTGTACTGGCATCTGAGTTCTCTGATGGTCAGGCTCTGCAGGCACTGAAACTGCTGAAAGAATATCTGCCAGCGTCCTACCACGAAGGGTCTAAAAATCCGGTAGCGCGTGAACGTGTTCACAGTGCAGCGACTATCGCGGGTATCGCGTTTGCGAACGCCTTCCTGGGTGTATGTCACTCAATGGCGCACAAACTGGGTTCCCAGTTCCATATTCCGCACGGTCTGGCAAACGCCCTGCTGATTTGTAACGTTATTCGCTACAATGCGAACGACAACCCGACCAAGCAGACTGCATTCAGCCAGTATGACCGTCCGCAGGCTCGCCGTCGTTATGCTGAAATTGCCGACCACTTGGGTCTGAGCGCACCGGGCGACCGTACTGCTGCTAAGATCGAGAAACTGCTGGCATGGCTGGAAACGCTGAAAGCTGAACTGGGTATTCCGAAATCTATCCGTGAAGCTGGCGTTCAGGAAGCAGACTTCCTGGCGAACGTGGATAAACTGTCTGAAGATGCATTCGATGACCAGTGCACCGGCGCTAACCCGCGTTACCCGCTGATCTCCGAGCTGAAACAGATTCTGCTGGATACCTACTACGGTCGTGATTATGTAGAAGGTGAAACTGCAGCGAAGAAAGAAGCTGCTCCGGCTAAAGCTGAGAAAAAAGCGAAAAAATCCGCTTAA
乳酸脱氢酶ldhA基因核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：
ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACGAGTCCTTTGGCTTTGAGCTGGAATTTTTTGACTTTCTGCTGACGGAAAAAACCGCTAAAACTGCCAATGGCTGCGAAGCGGTATGTATTTTCGTAAACGATGACGGCAGCCGCCCGGTGCTGGAAGAGCTGAAAAAGCACGGCGTTAAATATATCGCCCTGCGCTGTGCCGGTTTCAATAACGTCGACCTTGACGCGGCAAAAGAACTGGGGCTGAAAGTAGTCCGTGTTCCAGCCTATGATCCAGAGGCCGTTGCTGAACACGCCATCGGTATGATGATGACGCTGAACCGCCGTATTCACCGCGCGTATCAGCGTACCCGTGATGCTAACTTCTCTCTGGAAGGTCTGACCGGCTTTACTATGTATGGCAAAACGGCAGGCGTTATCGGTACCGGTAAAATCGGTGTGGCGATGCTGCGCATTCTGAAAGGTTTTGGTATGCGTCTGCTGGCGTTCGATCCGTATCCAAGTGCAGCGGCGCTGGAACTCGGTGTGGAGTATGTCGATCTGCCAACCCTGTTCTCTGAATCAGACGTTATCTCTCTGCACTGCCCGCTGACACCGGAAAACTATCATCTGTTGAACGAAGCCGCCTTCGAACAGATGAAAAATGGCGTGATGATCGTCAATACCAGTCGCGGTGCATTGATTGATTCTCAGGCAGCAATTGAAGCGCTGAAAAATCAGAAAATTGGTTCGTTGGGTATGGACGTGTATGAGAACGAACGCGATCTATTCTTTGAAGATAAATCCAACGACGTGATCCAGGATGACGTATTCCGTCGCCTGTCTGCCTGCCACAACGTGCTGTTTACCGGGCACCAGGCATTCCTGACAGCAGAAGCTCTGACCAGTATTTCTCAGACTACGCTGCAAAACTTAAGCAATCTGGAAAAAGGCGAAACCTGCCCGAACGAACTGGTTTAA
甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)：
ATGGTGAGCTGCAGCGCGCCGGGCAAAATTTATCTGTTTGGCGAACATGCGGTGGTGTATGGCGAAACCGCGATTGCGTGCGCGGTGGAACTGCGCACCCGCGTGCGCGCGGAACTGAACGATAGCATTACCATTCAGAGCCAGATTGGCCGCACCGGCCTGGATTTTGAAAAACATCCGTATGTGAGCGCGGTGATTGAAAAAATGCGCAAAAGCATTCCGATTAACGGCGTGTTTCTGACCGTGGATAGCGATATTCCGGTGGGCAGCGGCCTGGGCAGCAGCGCGGCGGTGACCATTGCGAGCATTGGCGCGCTGAACGAACTGTTTGGCTTTGGCCTGAGCCTGCAGGAAATTGCGAAACTGGGCCATGAAATTGAAATTAAAGTGCAGGGCGCGGCGAGCCCGACCGATACCTATGTGAGCACCTTTGGCGGCGTGGTGACCATTCCGGAACGCCGCAAACTGAAAACCCCGGATTGCGGCATTGTGATTGGCGATACCGGCGTGTTTAGCAGCACCAAAGAACTGGTGGCGAACGTGCGCCAGCTGCGCGAAAGCTATCCGGATCTGATTGAACCGCTGATGACCAGCATTGGCAAAATTAGCCGCATTGGCGAACAGCTGGTGCTGAGCGGCGATTATGCGAGCATTGGCCGCCTGATGAACGTGAACCAGGGCCTGCTGGATGCGCTGGGCGTGAACATTCTGGAACTGAGCCAGCTGATTTATAGCGCGCGCGCGGCGGGCGCGTTTGGCGCGAAAATTACCGGCGCGGGCGGCGGCGGCTGCATGGTGGCGCTGACCGCGCCGGAAAAATGCAACCAGGTGGCGGAAGCGGTGGCGGGCGCGGGCGGCAAAGTGACCATTACCAAACCGACCGAACAGGGCCTGAAAGTGGATTAA
甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)：
ATGGATAGAGAGCCTGTAACAGTACGTTCCTACGCAAATATTGCTATTATCAAATATTGGGGAAAGAAAAAAGAAAAAGAGATGGTGCCTGCTACTAGCAGTATTTCTCTAACTTTGGAAAATATGTATACAGAGACGACCTTGTCGCCTTTACCAGCCAATGTAACAGCTGACGAATTTTACATCAATGGTCAGCTACAAAATGAGGTCGAGCATGCCAAGATGAGTAAGATTATTGACCGTTATCGTCCAGCTGGTGAGGGCTTTGTCCGTATCGATACTCAAAACAATATGCCTACTGCAGCGGGCCTGTCCTCAAGTTCTAGTGGTTTGTCCGCCCTGGTCAAGGCTTGTAATGCTTATTTCAAGCTTGGATTGGATAGAAGTCAGTTGGCACAGGAAGCCAAATTTGCCTCAGGCTCTTCTTCTCGGAGTTTTTATGGACCACTAGGAGCCTGGGATAAGGATAGTGGAGAAATTTACCCTGTAGAGACAGACTTGAAACTAGCTATGATTATGTTGGTGCTAGAGGACAAGAAAAAACCAATCTCTAGCCGTGACGGGATGAAACTTTGTGTGGAAACCTCGACGACTTTTGACGACTGGGTTCGTCAGTCTGAGAAGGACTATCAGGATATGCTGATTTATCTCAAGGAAAATGATTTTGCCAAGATTGGAGAATTAACGGAGAAAAATGCCCTGGCTATGCATGCTACGACAAAGACTGCTAGTCCAGCCTTTTCTTATCTGACGGATGCCTCTTATGAGGCTATGGACTTTGTTCGCCAGCTTCGTGAGAAAGGAGAGGCCTGCTACTTTACCATGGATGCTGGTCCCAATGTTAAGGTCTTCTGTCAGGAGAAAGACTTGGAGCATTTATCAGAAATTTTCGGTCATCGTTATCGCTTGATTGTGTCAAAAACAAAGGATTTGAGTCAAGATGATTGCTGTTAA
磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：
ATGATTGCTGTTAAAACTTGCGGAAAACTCTATTGGGCAGGTGAATATGCTATTTTAGAGCCAGGGCAGTTAGCTTTGATAAAGGATATTCCCATCTATATGAGGGCTGAGATTGCTTTTTCTGACAGCTACCGTATCTATTCAGATATGTTTGATTTCGCAGTGGACTTAAGGCCTAATCCTGACTACAGCTTGATTCAAGAAACGATTGCTTTGATGGGAGACTTCCTCGCTGTTCGTGGTCAGAATTTAAGACCTTTTTCTCTAGAAATCTGTGGCAAAATGGAACGAGAAGGGAAAAAGTTTGGTCTAGGTTCTAGTGGCAGCGTCGTTGTCTTGGTTGTCAAGGCTTTACTGGCTCTGTATGATGTTTCTGTTGATCAGGAGCTCTTGTTCAAGCTGACTAGCGCTGTCTTGCTCAAGCGAGGAGACAATGGTTCCATGGGCGACCTTGCCTGTATTGTGGCAGAGGATTTGGTTCTCTACCAGTCATTTGATCGCCAGAAGGTGGCTGCTTGGTTAGAAGAAGAAAACTTGGCGACAGTTCTGGAGCGTGATTGGGGCTTTTCAATTTCACAAGTGAAACCAACTTTAGAATGTGATTTCTTAGTGGGATGGACCAAGGAAGTGGCTGTATCGAGTCACATGGTCCAGCAAATCAAGCAAAATATCAATCAAAATTTTTTAAGTTCCTCAAAAGAAACGGTGGTTTCTTTGGTCGAAGCCTTGGAACAGGGGAAATCAGAAAAGATTATCGAGCAAGTAGAAGTAGCCAGCAAGCTTTTAGAAGGCTTGAGTACAGATATTTACACGCCTTTGCTTAGACAGTTGAAAGAAGCCAGTCAAGATTTGCAGGCCGTTGCCAAGAGTAGTGGTGCTGGTGGTGGTGACTGTGGCATCGCCCTGAGTTTTGATGCGCAATCAACCAAAACCTTAAAAAATCGTTGGGCCGATCTGGGGATTGAGCTCTTATATCAAGAAAGGATAGGACATGACGACAAATCGTAA
异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)：
ATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGCACAGGGAGTTCCCACGGGTACGCTGGAAAAGTATGCCGCACACACGGCAGACACCCGCTTACATCTCGCGTTCTCCAGTTGGCTGTTTAATGCCAAAGGACAATTATTAGTTACCCGCCGCGCACTGAGCAAAAAAGCATGGCCTGGCGTGTGGACTAACTCGGTTTGTGGGCACCCACAACTGGGAGAAAGCAACGAAGACGCAGTGATCCGCCGTTGCCGTTATGAGCTTGGCGTGGAAATTACGCCTCCTGAATCTATCTATCCTGACTTTCGCTACCGCGCCACCGATCCGAGTGGCATTGTGGAAAATGAAGTGTGTCCGGTATTTGCCGCACGCACCACTAGTGCGTTACAGATCAATGATGATGAAGTGATGGATTATCAATGGTGTGATTTAGCAGATGTATTACACGGTATTGATGCCACGCCGTGGGCGTTCAGTCCGTGGATGGTGATGCAGGCGACAAATCGCGAAGCCAGAAAACGATTATCTGCATTTACCCAGCTTAAATAA
3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：
ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAGTTTTTTTGTGCCCCCTTATTATATTGATATGACGGCACTGGCTGAAGCCAGAAATGTAGACCCTGGAAAATTTCATATTGGTATTGGGCAAGACCAAATGGCGGTGAACCCAATCAGCCAAGATATTGTGACATTTGCAGCCAATGCCGCAGAAGCGATCTTGACCAAAGAAGATAAAGAGGCCATTGATATGGTGATTGTCGGGACTGAGTCCAGTATCGATGAGTCAAAAGCGGCCGCAGTTGTCTTACATCGTTTAATGGGGATTCAACCTTTCGCTCGCTCTTTCGAAATCAAGGAAGCTTGTTACGGAGCAACTGCAGGCTTACAGTTAGCTAAGAATCACGTAGCCTTACATCCAGATAAAAAAGTCTTGGTCGTAGCAGCAGATATTGCAAAATATGGCTTAAATTCTGGCGGTGAGCCTACACAAGGAGCTGGGGCGGTTGCAATGTTAGTTGCTAGTGAACCGCGCATTTTGGCTTTAAAAGAGGATAATGTGATGCTGACGCAAGATATCTATGACTTTTGGCGTCCAACAGGCCATCCATATCCTATGGTCGATGGTCCTTTGTCAAACGAAACCTACATCCAATCTTTTGCCCAAGTCTGGGATGAACATAAAAAACGAACCGGTCTTGATTTTGCAGATTATGATGCTTTAGCGTTCCATATTCCTTACACAAAAATGGGCAAAAAAGCCTTATTAGCAAAAATCTCCGACCAAACTGAAGCAGAACAGGAACGAATTTTAGCCCGTTATGAAGAAAGCATCATCTATAGTCGTCGCGTAGGAAACTTGTATACGGGTTCACTTTATCTGGGACTCATTTCCCTTTTAGAAAATGCAACGACTTTAACCGCAGGCAATCAAATTGGGTTATTCAGTTATGGTTCTGGTGCTGTCGCTGAATTTTTCACTGGTGAATTAGTAGCTGGTTATCAAAATCATTTACAAAAAGAAACTCATTTAGCACTGCTGGATAATCGGACAGAACTTTCTATCGCTGAATATGAAGCCATGTTTGCAGAAACTTTAGACACAGACATTGATCAAACGTTAAAAGATGAATTAAAATATAGTATTTCTGCTATTAATAATACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAA
乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.23)：
ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGCATTACGAACACCAATTGGAAAATATAAAGGCAGCTTAAGTCAAGTAAGTGCCGTAGACTTAGGAACACATGTTACAACACAACTTTTAAAAAGACATTCCACTATTTCTGAAGAAATTGATCAAGTAATCTTTGGAAATGTTTTACAAGCTGGAAATGGCCAAAATCCCGCACGACAAATAGCAATAAACAGCGGTTTATCTCATGAAATTCCCGCAATGACAGTTAATGAGGTCTGCGGATCAGGAATGAAGGCCGTTATTTTGGCGAAACAATTGATTCAATTAGGAGAAGCGGAAGTTTTAATTGCTGGCGGGATTGAGAATATGTCCCAAGCACCTAAATTACAACGATTTAATTACGAAACAGAAAGCTATGATGCGCCTTTTTCTAGTATGATGTACGATGGGTTAACGGATGCCTTTAGTGGTCAAGCAATGGGCTTAACTGCTGAAAATGTGGCCGAAAAGTATCATGTAACTAGAGAAGAGCAAGATCAATTTTCTGTACATTCACAATTAAAAGCAGCTCAAGCACAAGCAGAAGGGATATTCGCTGACGAAATAGCCCCATTAGAAGTATCAGGAACGCTTGTGGAGAAAGATGAAGGGATTCGCCCTAATTCGAGCGTTGAGAAGCTAGGAACGCTTAAAACAGTTTTTAAAGAAGACGGTACTGTAACAGCAGGGAATGCATCAACCATTAATGATGGGGCTTCTGCTTTGATTATTGCTTCACAAGAATATGCCGAAGCACACGGTCTTCCTTATTTAGCTATTATTCGAGACAGTGTGGAAGTCGGTATTGATCCAGCCTATATGGGAATTTCGCCGATTAAAGCCATTCAAAAACTGTTAGCGCGCAATCAACTTACTACGGAAGAAATTGATCTGTATGAAATCAACGAAGCATTTGCAGCAACTTCAATCGTGGTCCAAAGAGAACTGGCTTTACCAGAGGAAAAGGTCAACATTTATGGTGGCGGTATTTCATTAGGTCATGCGATTGGTGCCACAGGTGCTCGTTTATTAACGAGTTTAAGTTATCAATTAAATCAAAAAGAAAAGAAATATGGAGTGGCTTCTTTATGTATCGGCGGTGGCTTAGGACTCGCTATGCTACTAGAGAGACCTCAGCAAAAAAAAAACAGCCGATTTTATCAAATGAGTCCTGAGGAACGCCTGGCTTCTCTTCTTAATGAAGGCCAGATTTCTGCTGATACAAAAAAAGAATTTGAAAATACGGCTTTATCTTCGCAGATTGCCAATCATATGATTGAAAATCAAATCAGTGAAACAGAAGTGCCGATGGGCGTTGGCTTACATTTAACAGTGGACGAAACTGATTATTTGGTACCAATGGCGACAGAAGAGCCCTCAGTGATTGCGGCTTTGAGTAATGGTGCAAAAATAGCACAAGGATTTAAAACAGTGAATCAACAACGTTTAATGCGTGGACAAATCGTTTTTTACGATGTTGCAGACGCCGAGTCATTGATTGATGAACTACAAGTAAGAGAAACGGAAATTTTTCAACAAGCAGAGTTAAGTTATCCATCTATCGTTAAACGCGGCGGCGGCTTAAGAGATTTGCAATATCGTGCTTTTGATGAATCATTTGTATCTGTCGACTTTTTAGTAGATGTTAAGGATGCAATGGGGGCAAATATCGTTAACGCTATGTTGGAAGGTGTGGCCGAGTTGTTCCGTGAATGGTTTGCGGAGCAAAAGATTTTATTCAGTATTTTAAGTAATTATGCCACGGAGTCGGTTGTTACGATGAAAACGGCTATTCCAGTTTCACGTTTAAGTAAGGGGAGCAATGGCCGGGAAATTGCTGAAAAAATTGTTTTAGCTTCACGCTATGCTTCATTAGATCCTTATCGGGCAGTCACGCATAACAAAGGGATCATGAATGGCATTGAAGCTGTCGTTTTAGCTACAGGAAATGATACACGCGCTGTTAGCGCTTCTTGTCATGCTTTTGCGGTGAAGGAAGGTCGCTACCAAGGTTTGACTAGTTGGACGCTGGATGGCGAACAACTAATTGGTGAAATTTCAGTTCCGCTTGCGTTAGCCACGGTTGGCGGTGCCACAAAAGTCTTACCTAAATCTCAAGCAGCTGCTGATTTGTTAGCAGTGACGGATGCAAAAGAACTAAGTCGAGTAGTAGCGGCTGTTGGTTTGGCACAAAATTTAGCGGCGTTACGGGCCTTAGTCTCTGAAGGAATTCAAAAAGGACACATGGCTCTACAAGCACGTTCTTTAGCGATGACGGTCGGAGCTACTGGTAAAGAAGTTGAGGCAGTCGCTCAACAATTAAAACGTCAAAAAACGATGAACCAAGACCGAGCCTTGGCTATTTTAAATGATTTAAGAAAACAATAA
甲戊酸激酶mvaK1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.13)：
ATGACAAAAAAAGTTGGTGTCGGTCAGGCACATAGTAAGATAATTTTAATAGGGGAACATGCGGTCGTTTACGGTTATCCTGCCATTTCCCTGCCTCTTTTGGAGGTGGAGGTGACCTGTAAGGTAGTTCCTGCAGAGAGTCCTTGGCGCCTTTATGAGGAGGATACCTTGTCCATGGCGGTTTATGCCTCACTGGAGTATTTGGATATCACAGAAGCCTGCATTCGTTGTGAGATTGACTCGGCTATCCCTGAGAAACGGGGGATGGGTTCGTCAGCGGCTATCAGCATAGCGGCCATTCGTGCGGTATTTGACTACTATCAGGCTGATCTGCCTCATGATGTACTAGAAATCTTGGTCAATCGAGCTGAAATGATTGCCCATATGAATCCTAGTGGTTTGGATGCTAAGACCTGTCTCAGTGACCAACCTATTCGCTTTATCAAGAACGTAGGATTTACAGAACTTGAGATGGATTTATCCGCCTATTTGGTGATTGCCGATACGGGTGTTTATGGTCATACTCGTGAAGCCATCCAAGTGGTTCAAAATAAGGGCAAGGATGCCCTACCGTTTTTGCATGCCTTGGGAGAATTAACCCAGCAAGCAGAAGTTGCGATTTCACAAAAAGATGCTGAAGGACTGGGACAAATCCTCAGTCAAGCGCATTTACATTTAAAAGAAATTGGAGTCAGTAGCCCTGAGGCAGACTTTTTGGTTGAAACGACTCTTAGCCATGGTGCTCTGGGTGCCAAGATGAGCGGTGGTGGGCTAGGAGGTTGTATCATAGCCTTGGTAACCAATTTGACACACGCACAAGAACTAGCAGAAAGATTAGAAGAGAAAGGAGCTGTTCAGACATGGATAGAGAGCCTGTAA
(二)RBS或启动子序列(5’-3’)：
mvaA-1基因5’端连接的RBS(SEQ ID NO.14)：AGGAGGTAAAAGTTCMrBBS基因5’端连接的RBS：GGTTAAACC
idi基因5’端连接的RBS(SEQ ID NO.15)：AGGAGAGAAATT
乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因或mvaE基因5’端连接的RBS(SEQ IDNO.16)：AGGAGCATTTAG
mvaS基因5’端连接的RBS(SEQ ID NO.17)：AGGAGAAACCTT
mvaKmm基因5’端连接的启动子pLac(SEQ ID NO.18)：
TAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC
(三)连接短肽序列
分别表达(-)-α-红没药醇合成酶和法尼基二磷酸合酶融合酶连接肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.19)：GGAAGCGGAGGA
(四)融合序列
MrBBS基因与ispA基因通过连接短肽相连的序列(SEQ ID NO.20)：
Figure BDA0003675369620000171
Figure BDA0003675369620000181
注：大写正体部分为MrBBS基因5’端RBS序列(GGTTAAACC)；小写正体部分为去掉终止密码子的MrBBS基因序列(SEQ ID NO.2)；大写加粗部分为连接短肽序列(SEQ IDNO.19)；小写斜体部分为去掉起始密码子的ispA基因序列(SEQ ID NO.13)。
mvaKmm基因、mvaD基因、mvaK2基因、idi基因、mvaS基因、atoB基因融合产物的核苷酸序列(SEQ ID NO.21)：
Figure BDA0003675369620000191
Figure BDA0003675369620000201
Figure BDA0003675369620000211
Figure BDA0003675369620000221
注：大写正体部分为mvaKmm基因5’端pLac序列(SEQ ID NO.18)；小写正体部分为mvaKmm基因序列(SEQ ID NO.8)；小写斜体划线部分为mvaD基因序列(SEQ ID NO.9)；小写斜体部分为mvaK2基因序列(SEQ IDNO. 10)；小写加粗部分为idi基因5’端RBS序列(SEQ IDNO.15)，大写正体划线部分为idi基因序列(SEQ ID NO.11)；大写正体加粗部分为atoB基因5’端RBS序列(SEQ ID NO.16)，大写正体加粗划线部分为atoB基因序列(SEQ ID NO.4)；大写斜体部分为mvaS基因5’端RBS序列(SEQ IDNO.17)，大写斜体划线部分为mvaS基因序列(SEQ ID NO.12)。
mvaK1基因、mvaD基因、mvaK2基因和idi基因融合产物的核苷酸序列(SEQ IDNO.22)：
Figure BDA0003675369620000222
Figure BDA0003675369620000231
注：大写正体部分为mvaK1基因序列(SEQ ID NO.13)；小写正体部分为mvaD基因序列(SEQ ID NO.9)；小写划线部分为mvaK2基因序列(SEQID NO.10)；小写加粗斜体部分为idi基因5’端RBS序列(SEQ ID NO.15)，小写斜体部分为idi基因序列(SEQ ID NO.11)。
(五)涉及到的引物信息
表1引物的核苷酸序列
Figure BDA0003675369620000241
Figure BDA0003675369620000251
实施例1、产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌的构建
1、构建质粒
1.1构建重组质粒pSTV28-24
(1)化合合成(苏州金唯智生物科技有限公司)编码春黄菊花来源的(-)-α-红没药醇合成酶基因MrBBS；以MrBBS-F/MrBBS-R4为引物，对(-)-α-红没药醇合成酶基因MrBBS进行PCR扩增，PCR产物是前端带有9bp RBS、末尾去除终止密码子TAA后，连接有不同长度短肽编码序列的(-)-α-红没药醇合成酶基因MrBBS(RBS的核苷酸序列为GGTTAAACC，短肽编码序列如SEQ ID NO.19所示)，对PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化片段；
以E.coli DH5α/W3110基因组为模板，通过PCR使用引物ispA-F4/ispA-R扩增出无起始密码子ATG，同时带有不同长度短肽编码序列的ispA片段(短肽编码序列如SEQ IDNO.19所示)，并用clean-up试剂盒纯化片段；
将回收的两个DNA片段分别使用引物ispA-R/MrBBS-F进行融合PCR，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段；然后采用诺唯赞的一步克隆试剂盒将纯化好的融合PCR产物(序列如SEQ ID NO.20所示)与线性化质粒pSTV28进行连接(37℃30min)，质粒线性化获得使用引物pSTV28-F1和pSTV28-R1；将连接产物转化到E.coli DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含终浓度34mg/L氯霉素)上，于37℃、220rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pSTV28-14；
(2)化合合成(苏州金唯智生物科技有限公司)pUC57/mvaKmmDK2-idi质粒为模板，该合成质粒包含编码甲烷八叠球古菌来源的甲羟戊酸激酶基因mvaKmm、肺炎链球菌来源的甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD、磷酸甲羟戊酸激酶基因mvaK2以及带有12bp RBS的大肠杆菌来源的异戊烯二磷酸δ异构酶基因idi(RBS核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)；以mvaKmm-F、idi-R为引物，对mvaKmmDK2-idi基因进行PCR扩增，扩增得到带有pLac的mvaK1DK2-idi片段(pLac核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，插入mvaKmm基因5’端前)，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化片段；
以化合合成(苏州金唯智生物科技有限公司)的pUC57/mvaES质粒为模板，该合成质粒包含粪肠杆菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶基因mvaS以及乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因mvaE；(mvaE基因前带有RBS，RBS核苷酸序列如SEQID NO.16所示；mvaS基因前带有RBS，RBS核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)通过PCR使用引物mvaES-F、mvaES-R进行扩增，PCR产物用clean-up试剂盒纯化片段；
将回收的两个DNA片段使用mvaKmm-F和mvaES-R进行融合PCR，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段；然后采用诺唯赞的一步克隆试剂盒将纯化好的融合PCR产物与线性化质粒pSTV28-14进行连接(37℃30min)，质粒线性化获得使用引物pSTV28-1-F和pSTV28-1-R；将连接产物转化到E.coli DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含终浓度34mg/L氯霉素)上，于37℃、220rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pSTV28-24；
1.2构建重组质粒pSTV28-3
E.coli DH5α基因组为模板，以atoB-F、atoB-R为引物，对乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.4)进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化片段；
采用诺维赞的一步克隆试剂盒将纯化好的atoB片段与线性化质粒pSTV28-24进行连接(37℃30min)，atoB片段原位替换质粒中mvaE的片段，形成连接有核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示的融合产物的质粒，质粒线性化获得使用引物pSTV28-F2和pSTV28-R2；将连接产物转化到E.coli DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含终浓度34mg/L氯霉素)上，于37℃、220rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pSTV28-3；
1.3构建重组质粒pSTV28-4
化合合成(苏州金唯智生物科技有限公司)pUC57/RBS-mvaA-1质粒为模板，该合成质粒包含编码3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶密码子优化的mvaA-1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；以mvaA-F、mvaA-R为引物，对MvaA-1基因进行PCR扩增，扩增得到带有15bp RBS的mvaA-1片段(RBS核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，插入mvaA-1基因5’端前)，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化片段；
采用诺唯赞的一步克隆试剂盒将纯化好的mvaA-1与线性化质粒pSTV28-3进行连接(37℃30min)，质粒线性化获得使用引物pSTV28-2-F和pSTV28-2-R；将连接产物转化到E.coli DH 5α，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含终浓度34mg/L氯霉素)上，于37℃、220rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pSTV28-4(图3)；
1.4构建重组质粒pTrc99A-1
化合合成(苏州金唯智生物科技有限公司)pUC57/mvaK1质粒为模板；以mvaK1-F、mvaK1-R为引物，对肺炎链球菌来源甲羟戊酸激酶mvaK1基因进行PCR扩增，扩增得到mvaK1片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化该片段；
以pUC57/mvaKmmDK2-idi质粒为模板，使用引物mvaDK2-idi-F和mvaDK2-idi-R进行PCR扩增，扩增得到包含肺炎链球菌来源的甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的基因片段，即mvaDK2-idi片段(该片段的idi基因5’端前带有12bp RBS，该RBS核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)，将PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化该片段；
将回收的两个DNA片段使用引物mvaK1-F和mvaDK2-idi-R进行融合PCR，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段mvaK1DK2-idi(序列如SEQ ID NO.22所示)；然后采用诺唯赞的一步克隆试剂盒将纯化好的PCR产物与线性化质粒pTrc99A进行连接(37℃30min)，质粒线性化获得使用引物pTrc99A-F和pTrc99A-R；将连接产物转化到E.coli DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含终浓度100mg/L氨苄)上，于37℃、220rpm的条件下试管培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pTrc99A-1(图2)；
2、构建本发明产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌
将上述步骤构建的质粒pSTV28-4与pTrc99A-1一起转化到大肠杆菌E.coli DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有终浓度为100mg/L氨苄以及34mg/L氯霉素抗性)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，得到转化子，此转化子即为重组大肠杆菌工程菌株DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1。
实施例2、(-)-α-红没药醇的制备
取实施例1构建的大肠杆菌工程菌株DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1接种于种子培养基，30℃、200rpm摇床振荡培养8～10h，取种子液，按照8％(v/v)接种到发酵培养基，再覆盖20％(v/v)正十二烷，30℃200rpm摇床振荡培养3h，添加10μL(培养容器容量0.04％)的0.25M IPTG母液，再30℃200rpm摇床振荡培养47h，即得；
其中，种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
发酵培养基的配方为葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水。
实施例3、产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌的构建
1、构建三敲菌株
(1)采用lamda Red敲除基因系统编辑E.coli DH5α菌株基因组中编码富马酸还原酶frdC基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因。通过PCR分别使用引物frdC-F/frdC-R、adhE-F/adhE-R、ldhA-F/ldhA-R，都以pKD4载体为模板，扩增出相应的DNA片段；三个PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用clean-up试剂盒纯化；将回收到的三个DNA片段分别电转化到含有pKD46载体的E.coli DH5α菌株中；
(2)有pKD46载体的E.coli DH5α菌株在含有100mg/L的氨苄抗性和2g/L L-阿拉伯糖的LB培养基中，30℃培养，直到OD600达到0.4-0.5，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。将三个纯化好的片段分别电转到感受态中，电击转化在1.8KV下进行，电转化后加入1mL含有2g/L阿拉伯糖，放置30℃50rpm培养过夜；第二天将三支菌液分别涂至含有50mg/L卡那抗性的平板上，30℃过夜培养。三块平板上挑取单菌落作为模板，分别以各自对应的引物frdCyz-F/frdCyz-R、adhEyz-F/adhEyz-R、ldhAyz-F/ldhAyz-R进行PCR，并且通过观察在1.0％琼脂糖凝胶中是否有正确的DNA条带确认frdC、adhE以及ldhA基因的缺失。将已敲除成功的菌株放置37℃培养过夜以去除pKD46载体。如此构建的菌株记为E.coli DH5αΔfrdC::Kan、E.coli DH5αΔadhE::Kan以及E.coli DH5αΔldhA::Kan；在此基础上，将上面三株菌株制备成化转感受态，并各导入pCP20载体涂布于氨苄抗性，30℃过夜培养。第二天挑取平板上的单菌落于含有卡那抗性的平板上，37℃过夜培养，观察生长情况，则验证基因组上的卡那是否消除；将已消除成功的单菌落放置37℃培养过夜以除去pCP20载体,如此构建的菌株记为E.coli DH5αΔfrdC、E.coli DH5αΔadhE以及E.coli DH5αΔldhA。
(3)采用P1噬菌体转导技术，将富马酸还原酶frdC基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因在E.coli DH5α基因组上依次叠加敲除；通过P1噬菌体分别侵染E.coli DH5αΔadhE::Kan以及E.coli DH5αΔldhA::Kan，最终分别获得E.coli DH5αΔadhE::Kan以及E.coli DH5αΔldhA::Kan的噬菌体侵染液；用E.coli DH5αΔadhE::Kan的噬菌体侵染液侵染E.coli DH5αΔfrdC，通过一系列验证以及消卡那抗性最终获得二敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhE；在此继续用E.coli DH5αΔldhA::Kan的噬菌体侵染液侵染二敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhE，通过一系列验证以及消除卡那抗性最终获得三敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA。
2、按照实施例1的记载构建重组质粒pSTV28-4和重组质粒pTrc99A-1。
3、将质粒pSTV28-4与pTrc99A-1一起转化到上面构建的三敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有终浓度为100mg/L氨苄以及34mg/L氯霉素抗性)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，得到转化子，此转化子即为重组大肠杆菌工程菌株，即三敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhApSTV28-4&pTrc99A-1。
实施例4、(-)-α-红没药醇的制备
取实施例3构建的大肠杆菌工程菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA pSTV28-4&pTrc99A-1，接种于种子培养基，30℃、200rpm摇床振荡培养8～10h，再接种于含葡萄糖的LB培养基中，培养时间16-20h，离心收集菌体到达一定OD600值(不低于20)，将种子液接种于发酵培养基，加正十二烷、碳酸镁以及IPTG，并注入CO2，30℃200rpm厌氧发酵培养30～60h，红没药醇即存在于上清正十二烷相中；
其中，种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、10g/L葡萄糖、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
无氧发酵培养基的配方为葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、20g/L碳酸镁、CO2、IPTG0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水。
含葡萄糖的LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、10g/L葡萄糖、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水。
对比例1、未敲除frdC基因、adhE基因ldhA基因且不含atoB基因过表达和mvaA-1基因的重组菌
参照实施例1的制备方法，按照第2部分的记载构建得到重组质粒pSTV28-24与pTrc99A-1，然后一起转化到大肠杆菌DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有终浓度为100mg/L氨苄以及34mg/L氯霉素抗性)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，得到转化子，此转化子即为重组大肠杆菌工程菌株DH5αpSTV28-24&pTrc99A-1。
对比例2、未敲除frdC基因、adhE基因ldhA基因且不含mvaA-1基因的重组菌
参照实施例1的制备方法，按照第2部分的记载构建得到质粒pSTV28-3与pTrc99A-1，然后一起转化到大肠杆菌DH5α，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有终浓度为100mg/L氨苄以及34mg/L氯霉素抗性)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，得到转化子，此转化子即为重组大肠杆菌工程菌株DH5αpSTV28-3&pTrc99A-1。
对比例3、未引入mvaA-1基因基因的三敲重组菌
参照实施例1的制备方法，按照第1部分的记载构建得到三敲大肠杆菌E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA，按照第2部分的记载构建得到质粒pSTV28-3与pTrc99A-1。
将上述步骤构建的质粒pSTV28-3与pTrc99A-1一起转化到上面构建的三敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有终浓度为100mg/L氨苄以及34mg/L氯霉素抗性)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，得到转化子，此转化子即为重组大肠杆菌工程菌株，即三敲菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA pSTV28-3&pTrc99A-1。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、重组大肠杆菌在合成(-)-α-红没药醇中的应用
(1)培养基配制
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。LB平板是在LB液体培养基中添加终浓度2g/L琼脂。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L；
发酵培养基：葡萄糖/甘油10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L。
(2)(-)-α-红没药醇生产
挑取大肠杆菌工程菌株DH5αpSTV28-3&pTrc99A-1(对比例2)、E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1(实施例1)以及对照菌E.coli DH5αpSTV28-24&pTrc99A-1(对比例1)在摇瓶进行发酵实验测试(发酵过程(-)-α-红没药醇合成代谢过程见图1)，具体摇瓶发酵实验步骤如下：挑取在LB固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30℃、200rpm摇床振荡培养8～10h。将培养好的种子按照8％(v/v)接种到发酵培养基，再添加20％(v/v)正十二烷，在30℃200rpm摇床振荡培养至50h，其中发酵3h后添加10μL 0.25MIPTG母液，发酵结束后发酵液取上清即得到(-)-α-红没药醇。
(3)(-)-α-红没药醇含量的测定：
标样准备：配置9g/L(-)-α-红没药醇标样，分别稀释成浓度为10、30、50、70、90mg/L的标样，1mL过膜待测；
样品准备：取1mL发酵液在转速12000rpm下离心5min，两相分离；分离得到的有机相过膜待测；
GC-MS检测方法:柱温控温程序为50℃保持3min；以20℃/min升温到280℃保持5min；进样口温度为200℃；进样模式分流比为10：1；分流流量为10mL/min；色谱柱为安捷伦HP-5MS UI(30m*250um*0.25um)；柱流量为：1mL/min；(-)-α-红没药醇的GC-MS分析结果如图4。
检测重组E.coli DH5αpSTV28-24&pTrc99A-1、E.coli DH5αpSTV28-3/pTrc99A-1和E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1发酵获得的发酵液中(-)-α-红没药醇的含量如图5。由图5可知，将E.coli DH5αpSTV28-24/pTrc99A-1、E.coli DH5αpSTV28-3&pTrc99A-1和E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1分别接种至以葡萄糖为碳源的发酵培养基中发酵50h，重组菌株E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1(实施例1)发酵液中的(-)-α-红没药醇的产量达到7.9g/L，比对照菌株E.coli DH5αpSTV28-24&pTrc99A-1(对比例1)产量(6.8g/L)提高了16％，而E.coli DH5αpSTV28-3&pTrc99A-1(对比例2)产量只有0.5g/L，表明MVA途径比MEP途径更有利于(-)-α-红没药醇的合成以及以NADH依赖型的mvaA更比NADPH依赖型的mvaE更有利于目标产物的积累。即本发明导入atoB和mvaA-1基因的菌株基因表达量高，产红没药醇的产量大。
实验例2、重组大肠杆菌在合成(-)-α-红没药醇中的应用
(1)培养基配制
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。LB平板是在LB液体培养基中添加终浓度2g/L琼脂。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、10g/L葡萄糖、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L；
厌氧发酵培养基：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、IPTG 0.1mM、20g/L碳酸镁、CO2、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L。
(2)(-)-α-红没药醇生产
挑取实施例3构建的大肠杆菌工程菌株E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhApSTV28-4&pTrc99A-1与实施例1构建的E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1在摇瓶进行发酵实验测试(发酵过程(-)-α-红没药醇合成代谢过程见图1)，具体摇瓶发酵实验步骤如下：挑取在LB固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30℃、200rpm摇床振荡培养8～10h。将培养好的种子再转接于含有葡萄糖的LB培养基中，培养时间16-20h，离心收集菌体到达一定OD600值，将种子液接种于厌氧发酵培养基，加20％(v/v)正十二烷、20g/L碳酸镁以及添加10μL 0.25M IPTG母液，并以1mL/min速度注入CO21min。，30℃200rpm厌氧发酵培养50h，发酵结束后发酵液取上清即得到(-)-α-红没药醇。
(3)(-)-α-红没药醇含量的测定：
标样准备：配置9g/L(-)-α-红没药醇标样，分别稀释成浓度为10、30、50、70、90mg/L的标样，1mL过膜待测；
样品准备：取1mL发酵液在转速12000rpm下离心5min，两相分离；分离得到的有机相过膜待测；
GC-MS检测方法:柱温控温程序为50℃保持3min；以20℃/min升温到280℃保持5min；进样口温度为200℃；进样模式分流比为10：1；分流流量为10mL/min；色谱柱为安捷伦HP-5MS UI(30m*250um*0.25um)；柱流量为：1mL/min；
检测重组E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA pSTV28-4&pTrc99A-1与E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1发酵获得的发酵液中(-)-α-红没药醇的含量如图6。由图6可知，将E.coli DH5αΔfrdCΔadhEΔldhA pSTV28-4&pTrc99A-1与E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1分别接种至以葡萄糖为碳源的厌氧发酵培养基中发酵50h，可使重组菌株E.coliDH5αΔfrdCΔadhEΔldhA pSTV28-4&pTrc99A-1(实施例3)发酵液中的(-)-α-红没药醇的产量达到9.5g/L，比实施例1的菌株E.coli DH5αpSTV28-4&pTrc99A-1产量(7.9g/L)进一步提高了20％，表明进一步增加NADH的供给，有利于打通MVA上游途径的代谢流，从而增加(-)-α-红没药醇产量的积累。即敲除frdC、adhE、dhA基因后，本发明重组菌株产量进一步显著提高。
综上，本发明提供了一种产(-)-α-红没药醇的基因工程菌，通过在含有特定基因：MrBBS基因、ispA基因和mvaKmm等MVA途径基因的重组大肠杆菌的基础上，进一步引入，密码子优化的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因和乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因，使得到的重组大肠杆菌之在生产过程的摇瓶阶段产量从6.8g/L进一步提高到了7.9g/L；进一步敲除大肠杆菌基因组上的富马酸还原酶frdC基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因，产量可进一步提升至9.5g/L。本发明高摇瓶阶段产量的基因工程菌，再经发酵罐放大后的产量相对目前公开报道的产量进一步突破新高，适宜实际推广应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海锐康生物技术研发有限公司
<120> 一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途
<130> GY218-2022P0115277CCR3
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1302
<212> DNA
<213> mvaA-1
<400> 1
atgaccggca aaaccggcca tattgatggc ctgaacagcc gcattgaaaa aatgcgcgat 60
ctggatccgg cgcagcgctt agtgcgcgtg gcggaagccg cgggcctgga accggaagcg 120
attagtgcgc tggcgggcaa cggcgcgctg ccgctgagcc tggcgaacgg catgattgaa 180
aacgtgattg gcaaatttga gttaccgtta ggcgtggcga ccaactttac cgtgaacggc 240
cgcgattatc tgattccgat ggcggtggaa gaaccgagcg tggtggcggc cgcgagctat 300
atggcgcgca ttgcgcgcga aaacggcggc tttaccgcgc atggcaccgc gccgctgatg 360
cgcgcgcaga ttcaagtggt gggcctgggt gatccggaag gcgcgcgtca gcgcctgctg 420
gcgcataaag cggcgtttat ggaagcggcg gatgcggtgg atccggtgtt agtgggttta 480
ggcggtggct gccgcgatat tgaagtgcat gtgtttcgcg ataccccggt gggcgcgatg 540
gtggtgctgc atctgattgt ggatgtgcgc gatgcgatgg gcgcgaacac cgtgaacacc 600
atggcggaac gcctggcccc ggaagtggaa cgcattgcgg gcggcaccgt gcgcctgcgc 660
attctgagca acctggcgga tctgcgcctg gtgcgcgcgc gcgtggaact ggcgccggaa 720
acgctgacca cccaaggcta tgatggcgcg gatgtggcgc gcggcatggt ggaagcgtgc 780
gcgctggcca ttgtggatcc gtatcgcgcg gcgacccata acaaaggcat tatgaacggc 840
attgatccgg tggttgtggc gaccggcaac gattggcgcg cgattgaagc gggcgcgcat 900
gcgtatgcgg cgcgcaccgg ccattatacg agcctgaccc gctgggaact ggcgaacgat 960
ggccgcctgg tgggcacgat cgaactgccg ctggcgttag gtctggttgg cggtgcgacc 1020
aagacgcacc cgaccgcgcg tgcggcgctg gcgctgatgc aagtggagac ggcgaccgaa 1080
ctggcccaag tgaccgccgc ggtgggtctg gcgcagaaca tggcggcgat tcgcgcgtta 1140
gcgacggaag gcattcagcg cggccatatg accctgcatg cgcgcaacat tgcgattatg 1200
gcgggcgcga ccggcgcgga tattgatcgc gtgacccgcg tgattgtgga agcgggcgat 1260
gtgagcgtgg cgcgcgcgaa acaagtgctg gaaaacacct aa 1302
<210> 2
<211> 1719
<212> DNA
<213> MrBBS
<400> 2
atgagcacac tgagcgtcag caccccgagc tttagcagca gccctctgtc gagcgtgaat 60
aagaacagca ccaagcagca tgtcactcgt aacagcgtga tctttcacga ctcgatttgg 120
ggggaccagt tcctggaata caaagagaaa ttcaacgttg caaccgagaa acagcttata 180
gaagagctga aagaagaagt gcgtaacgaa ctgatgattc gtgcatgtaa tgaagcgagc 240
cggtatatca aactgatcca gctgatcgat gttgttgaac gtctggggct ggcctatcat 300
tttgaaaaag agattgagga aagcctccag catatatatg tgacgtatgg tcataaatgg 360
acgaattaca acaatattga gagcctgagt ctgtggttcc gcctgcttcg tcaaaatggc 420
tttaatgtta gctcggatat atttgaaaat cacattgatg agaaaggaaa ttttcaggag 480
agcctgtgca atgatccgca ggggatgctg gcgctgtatg aagcggcata tatgcgtgtt 540
gaaggagaga tcattctgga caaagcactc gaatttacca agctgcatct ggggatcatt 600
agcaatgatc ctagctgtga tagcagccta cgtacggaaa tcaagcaggc actgaaacag 660
ccactgcgcc ggcggctgcc aaggctggaa gccgttcgtt acattgccat ttatcagcag 720
aaggcgagcc atagcgaggt tctgctgaag ctggccaaac tggacttcaa cgttctgcag 780
gaaatgcaca aagacgaatt gagccaaata tgcaaatggt ggaaagatct ggatatacgt 840
aacaaactgc cctatgttcg tgatcgtctg attgaaggct atttttggat tctgggtatt 900
tatttcgaac cgcaacactc ccgtacccgt atgttcctga tgaaaacctg tatgtggctg 960
atcgtgctgg acgatacgtt tgataattac ggcacctatg aagagttaga gatctttacc 1020
caagcagtcg aacgttggag cattacctgt ctggatgaac tgccagagta tatgaagctg 1080
atatatcacg agcaatttcg cgtgcatcag gaaatggagg aaagcctgga aaaggagggt 1140
aaggcctacc agattcatta tatcaaagaa atggccaaag aaggtactcg ttcgctgctg 1200
ctggaagcga aatggctgaa ggaaggctat atgcctaccc tggatgagta cctgagcaac 1260
agcctggtca cctgcggcta tgcactgatg accgcacgca gctacgttgc ccgtgacgac 1320
ggcattgtta ccgaagatgc attcaaatgg gttgcaacgc acccgccgat tgttaaagca 1380
gcatgcaaaa ttctgcgcct gatggacgac attgcaaccc ataaagagga acaggagcgg 1440
ggacacattg caagtagcat tgagtgttac aggaaggaaa ccggagctag cgaagaggag 1500
gcttgcatgg actttctgaa gcaggttgaa gatggttgga aagttattaa tcaagaaagc 1560
ctgatgccga ccgatgttcc gttccctctg ctgattccgg caattaacct ggcacgtgtg 1620
agcgacaccc tgtacaaaga caacgatggt tataatcatg ccgataaaga ggttataggt 1680
tatattaaaa gcctgtttgt acatccgatg atagtctaa 1719
<210> 3
<211> 900
<212> DNA
<213> ispA
<400> 3
atggactttc cgcagcaact cgaagcctgc gttaagcagg ccaaccaggc gctgagccgt 60
tttatcgccc cactgccctt tcagaacact cccgtggtcg aaaccatgca gtatggcgca 120
ttattaggtg gtaagcgcct gcgacctttc ctggtttatg ccaccggtca tatgttcggc 180
gttagcacaa acacgctgga cgcacccgct gccgccgttg agtgtatcca cgcttactca 240
ttaattcatg atgatttacc ggcaatggat gatgacgatc tgcgtcgcgg tttgccaacc 300
tgccatgtga agtttggcga agcaaacgcg attctcgctg gcgacgcttt acaaacgctg 360
gcgttctcga ttttaagcga tgccgatatg ccggaagtgt cggaccgcga cagaatttcg 420
atgatttctg aactggcgag cgccagtggt attgccggaa tgtgcggtgg tcaggcatta 480
gatttagacg cggaaggcaa acacgtacct ctggacgcgc ttgagcgtat tcatcgtcat 540
aaaaccggcg cattgattcg cgccgccgtt cgccttggtg cattaagcgc cggagataaa 600
ggacgtcgtg ctctgccggt actcgacaag tatgcagaga gcatcggcct tgccttccag 660
gttcaggatg acatcctgga tgtggtggga gatactgcaa cgttgggaaa acgccagggt 720
gccgaccagc aacttggtaa aagtacctac cctgcacttc tgggtcttga gcaagcccgg 780
aagaaagccc gggatctgat cgacgatgcc cgtcagtcgc tgaaacaact ggctgaacag 840
tcactcgata cctcggcact ggaagcgcta gcggactaca tcatccagcg taataaataa 900
<210> 4
<211> 1185
<212> DNA
<213> atoB
<400> 4
atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttca 60
ctcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgt 120
gcaaaaatcg attcacaaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt acaagccggg 180
ctggggcaaa atccggcgcg tcaggcactg ttaaaaagcg ggctggcaga aacggtgtgc 240
ggattcacgg tcaataaagt atgtggttcg ggtcttaaaa gtgtggcgct tgccgcccag 300
gccattcagg caggtcaggc gcagagcatt gtggcggggg gtatggaaaa tatgagttta 360
gccccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420
tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480
accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540
ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600
gtcccggtaa atgttgtcac tcgaaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660
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agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgccac gcaaaaagcg 900
ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960
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acactattac atgccatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actgtgcatt 1140
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<211> 396
<212> DNA
<213> frdc
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ctgctgcaca ccaaaacctg gtttgaactg gcaccgaaag cggccaatat cattgtaaaa 300
gacgaaaaaa tgggaccaga gccaattatc aaaagtctct gggcggtaac tgtggttgcc 360
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<213> adhE
<400> 6
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cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120
gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180
atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240
aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300
gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360
atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420
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ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540
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gccgcataca gctccggtaa accagctatc ggtgtaggcg cgggcaacac tccagttgtt 660
atcgatgaaa ctgctgatat caaacgtgca gttgcatctg tactgatgtc caaaaccttc 720
gacaacggcg taatctgtgc ttctgaacag tctgttgttg ttgttgactc tgtttatgac 780
gctgtacgtg aacgttttgc aacccacggc ggctatctgt tgcagggtaa agagctgaaa 840
gctgttcagg atgttatcct gaaaaacggt gcgctgaacg cggctatcgt tggtcagcca 900
gcctataaaa ttgctgaact ggcaggcttc tctgtaccag aaaacaccaa gattctgatc 960
ggtgaagtga ccgttgttga tgaaagcgaa ccgttcgcac atgaaaaact gtccccgact 1020
ctggcaatgt accgcgctaa agatttcgaa gacgcggtag aaaaagcaga gaaactggtt 1080
gctatgggcg gtatcggtca tacctcttgc ctgtacactg accaggataa ccaaccggct 1140
cgcgtttctt acttcggtca gaaaatgaaa acggcgcgta tcctgattaa caccccagcg 1200
tctcagggtg gtatcggtga cctgtataac ttcaaactcg caccttccct gactctgggt 1260
tgtggttctt ggggtggtaa ctccatctct gaaaacgttg gtccgaaaca cctgatcaac 1320
aagaaaaccg ttgctaagcg agctgaaaac atgttgtggc acaaacttcc gaaatctatc 1380
tacttccgcc gtggctccct gccaatcgcg ctggatgaag tgattactga tggccacaaa 1440
cgtgcgctca tcgtgactga ccgcttcctg ttcaacaatg gttatgctga tcagatcact 1500
tccgtactga aagcagcagg cgttgaaact gaagtcttct tcgaagtaga agcggacccg 1560
accctgagca tcgttcgtaa aggtgcagaa ctggcaaact ccttcaaacc agacgtgatt 1620
atcgcgctgg gtggtggttc cccgatggac gccgcgaaga tcatgtgggt tatgtacgaa 1680
catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740
tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800
acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860
ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920
gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980
gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040
ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100
gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160
gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220
aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280
actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340
cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400
tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460
caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcatt cgatgaccag 2520
tgcaccggcg ctaacccgcg ttacccgctg atctccgagc tgaaacagat tctgctggat 2580
acctactacg gtcgtgatta tgtagaaggt gaaactgcag cgaagaaaga agctgctccg 2640
gctaaagctg agaaaaaagc gaaaaaatcc gcttaa 2676
<210> 7
<211> 990
<212> DNA
<213> ldhA
<400> 7
atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60
gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120
actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180
ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240
aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300
gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360
caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420
actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480
cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540
gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600
atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660
gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720
caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780
gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840
ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900
gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960
ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990
<210> 8
<211> 906
<212> DNA
<213> mvaKmm
<400> 8
atggtgagct gcagcgcgcc gggcaaaatt tatctgtttg gcgaacatgc ggtggtgtat 60
ggcgaaaccg cgattgcgtg cgcggtggaa ctgcgcaccc gcgtgcgcgc ggaactgaac 120
gatagcatta ccattcagag ccagattggc cgcaccggcc tggattttga aaaacatccg 180
tatgtgagcg cggtgattga aaaaatgcgc aaaagcattc cgattaacgg cgtgtttctg 240
accgtggata gcgatattcc ggtgggcagc ggcctgggca gcagcgcggc ggtgaccatt 300
gcgagcattg gcgcgctgaa cgaactgttt ggctttggcc tgagcctgca ggaaattgcg 360
aaactgggcc atgaaattga aattaaagtg cagggcgcgg cgagcccgac cgatacctat 420
gtgagcacct ttggcggcgt ggtgaccatt ccggaacgcc gcaaactgaa aaccccggat 480
tgcggcattg tgattggcga taccggcgtg tttagcagca ccaaagaact ggtggcgaac 540
gtgcgccagc tgcgcgaaag ctatccggat ctgattgaac cgctgatgac cagcattggc 600
aaaattagcc gcattggcga acagctggtg ctgagcggcg attatgcgag cattggccgc 660
ctgatgaacg tgaaccaggg cctgctggat gcgctgggcg tgaacattct ggaactgagc 720
cagctgattt atagcgcgcg cgcggcgggc gcgtttggcg cgaaaattac cggcgcgggc 780
ggcggcggct gcatggtggc gctgaccgcg ccggaaaaat gcaaccaggt ggcggaagcg 840
gtggcgggcg cgggcggcaa agtgaccatt accaaaccga ccgaacaggg cctgaaagtg 900
gattaa 906
<210> 9
<211> 954
<212> DNA
<213> mvaD
<400> 9
atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata ttgctattat caaatattgg 60
ggaaagaaaa aagaaaaaga gatggtgcct gctactagca gtatttctct aactttggaa 120
aatatgtata cagagacgac cttgtcgcct ttaccagcca atgtaacagc tgacgaattt 180
tacatcaatg gtcagctaca aaatgaggtc gagcatgcca agatgagtaa gattattgac 240
cgttatcgtc cagctggtga gggctttgtc cgtatcgata ctcaaaacaa tatgcctact 300
gcagcgggcc tgtcctcaag ttctagtggt ttgtccgccc tggtcaaggc ttgtaatgct 360
tatttcaagc ttggattgga tagaagtcag ttggcacagg aagccaaatt tgcctcaggc 420
tcttcttctc ggagttttta tggaccacta ggagcctggg ataaggatag tggagaaatt 480
taccctgtag agacagactt gaaactagct atgattatgt tggtgctaga ggacaagaaa 540
aaaccaatct ctagccgtga cgggatgaaa ctttgtgtgg aaacctcgac gacttttgac 600
gactgggttc gtcagtctga gaaggactat caggatatgc tgatttatct caaggaaaat 660
gattttgcca agattggaga attaacggag aaaaatgccc tggctatgca tgctacgaca 720
aagactgcta gtccagcctt ttcttatctg acggatgcct cttatgaggc tatggacttt 780
gttcgccagc ttcgtgagaa aggagaggcc tgctacttta ccatggatgc tggtcccaat 840
gttaaggtct tctgtcagga gaaagacttg gagcatttat cagaaatttt cggtcatcgt 900
tatcgcttga ttgtgtcaaa aacaaaggat ttgagtcaag atgattgctg ttaa 954
<210> 10
<211> 1008
<212> DNA
<213> mvaK2
<400> 10
atgattgctg ttaaaacttg cggaaaactc tattgggcag gtgaatatgc tattttagag 60
ccagggcagt tagctttgat aaaggatatt cccatctata tgagggctga gattgctttt 120
tctgacagct accgtatcta ttcagatatg tttgatttcg cagtggactt aaggcctaat 180
cctgactaca gcttgattca agaaacgatt gctttgatgg gagacttcct cgctgttcgt 240
ggtcagaatt taagaccttt ttctctagaa atctgtggca aaatggaacg agaagggaaa 300
aagtttggtc taggttctag tggcagcgtc gttgtcttgg ttgtcaaggc tttactggct 360
ctgtatgatg tttctgttga tcaggagctc ttgttcaagc tgactagcgc tgtcttgctc 420
aagcgaggag acaatggttc catgggcgac cttgcctgta ttgtggcaga ggatttggtt 480
ctctaccagt catttgatcg ccagaaggtg gctgcttggt tagaagaaga aaacttggcg 540
acagttctgg agcgtgattg gggcttttca atttcacaag tgaaaccaac tttagaatgt 600
gatttcttag tgggatggac caaggaagtg gctgtatcga gtcacatggt ccagcaaatc 660
aagcaaaata tcaatcaaaa ttttttaagt tcctcaaaag aaacggtggt ttctttggtc 720
gaagccttgg aacaggggaa atcagaaaag attatcgagc aagtagaagt agccagcaag 780
cttttagaag gcttgagtac agatatttac acgcctttgc ttagacagtt gaaagaagcc 840
agtcaagatt tgcaggccgt tgccaagagt agtggtgctg gtggtggtga ctgtggcatc 900
gccctgagtt ttgatgcgca atcaaccaaa accttaaaaa atcgttgggc cgatctgggg 960
attgagctct tatatcaaga aaggatagga catgacgaca aatcgtaa 1008
<210> 11
<211> 549
<212> DNA
<213> idi
<400> 11
atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60
aagtatgccg cacacacggc agacacccgc ttacatctcg cgttctccag ttggctgttt 120
aatgccaaag gacaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggc 180
gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agacgcagtg 240
atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300
gactttcgct accgcgccac cgatccgagt ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360
tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag atcaatgatg atgaagtgat ggattatcaa 420
tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc gttcagtccg 480
tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc atttacccag 540
cttaaataa 549
<210> 12
<211> 1152
<212> DNA
<213> mvaS
<400> 12
atgacaattg ggattgataa aattagtttt tttgtgcccc cttattatat tgatatgacg 60
gcactggctg aagccagaaa tgtagaccct ggaaaatttc atattggtat tgggcaagac 120
caaatggcgg tgaacccaat cagccaagat attgtgacat ttgcagccaa tgccgcagaa 180
gcgatcttga ccaaagaaga taaagaggcc attgatatgg tgattgtcgg gactgagtcc 240
agtatcgatg agtcaaaagc ggccgcagtt gtcttacatc gtttaatggg gattcaacct 300
ttcgctcgct ctttcgaaat caaggaagct tgttacggag caactgcagg cttacagtta 360
gctaagaatc acgtagcctt acatccagat aaaaaagtct tggtcgtagc agcagatatt 420
gcaaaatatg gcttaaattc tggcggtgag cctacacaag gagctggggc ggttgcaatg 480
ttagttgcta gtgaaccgcg cattttggct ttaaaagagg ataatgtgat gctgacgcaa 540
gatatctatg acttttggcg tccaacaggc catccatatc ctatggtcga tggtcctttg 600
tcaaacgaaa cctacatcca atcttttgcc caagtctggg atgaacataa aaaacgaacc 660
ggtcttgatt ttgcagatta tgatgcttta gcgttccata ttccttacac aaaaatgggc 720
aaaaaagcct tattagcaaa aatctccgac caaactgaag cagaacagga acgaatttta 780
gcccgttatg aagaaagcat catctatagt cgtcgcgtag gaaacttgta tacgggttca 840
ctttatctgg gactcatttc ccttttagaa aatgcaacga ctttaaccgc aggcaatcaa 900
attgggttat tcagttatgg ttctggtgct gtcgctgaat ttttcactgg tgaattagta 960
gctggttatc aaaatcattt acaaaaagaa actcatttag cactgctgga taatcggaca 1020
gaactttcta tcgctgaata tgaagccatg tttgcagaaa ctttagacac agacattgat 1080
caaacgttaa aagatgaatt aaaatatagt atttctgcta ttaataatac cgttcgttct 1140
tatcgaaact aa 1152
<210> 13
<211> 879
<212> DNA
<213> mvaK1
<400> 13
atgacaaaaa aagttggtgt cggtcaggca catagtaaga taattttaat aggggaacat 60
gcggtcgttt acggttatcc tgccatttcc ctgcctcttt tggaggtgga ggtgacctgt 120
aaggtagttc ctgcagagag tccttggcgc ctttatgagg aggatacctt gtccatggcg 180
gtttatgcct cactggagta tttggatatc acagaagcct gcattcgttg tgagattgac 240
tcggctatcc ctgagaaacg ggggatgggt tcgtcagcgg ctatcagcat agcggccatt 300
cgtgcggtat ttgactacta tcaggctgat ctgcctcatg atgtactaga aatcttggtc 360
aatcgagctg aaatgattgc ccatatgaat cctagtggtt tggatgctaa gacctgtctc 420
agtgaccaac ctattcgctt tatcaagaac gtaggattta cagaacttga gatggattta 480
tccgcctatt tggtgattgc cgatacgggt gtttatggtc atactcgtga agccatccaa 540
gtggttcaaa ataagggcaa ggatgcccta ccgtttttgc atgccttggg agaattaacc 600
cagcaagcag aagttgcgat ttcacaaaaa gatgctgaag gactgggaca aatcctcagt 660
caagcgcatt tacatttaaa agaaattgga gtcagtagcc ctgaggcaga ctttttggtt 720
gaaacgactc ttagccatgg tgctctgggt gccaagatga gcggtggtgg gctaggaggt 780
tgtatcatag ccttggtaac caatttgaca cacgcacaag aactagcaga aagattagaa 840
gagaaaggag ctgttcagac atggatagag agcctgtaa 879
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> mvaA-1 RBS
<400> 14
aggaggtaaa agttc 15
<210> 15
<211> 12
<212> DNA
<213> idi RBS
<400> 15
aggagagaaa tt 12
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> atoB/mvaE RBS
<400> 16
aggagcattt ag 12
<210> 17
<211> 12
<212> DNA
<213> mvaS RBS
<400> 17
aggagaaacc tt 12
<210> 18
<211> 151
<212> DNA
<213> mvaKmm pLac
<400> 18
taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 60
tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 120
ttacgaattc gagctcggta cccggggatc c 151
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> Peptide
<400> 19
ggaagcggag ga 12
<210> 20
<211> 2634
<212> DNA
<213> MrBBS-ispA
<400> 20
ggttaaacca tgagcacact gagcgtcagc accccgagct ttagcagcag ccctctgtcg 60
agcgtgaata agaacagcac caagcagcat gtcactcgta acagcgtgat ctttcacgac 120
tcgatttggg gggaccagtt cctggaatac aaagagaaat tcaacgttgc aaccgagaaa 180
cagcttatag aagagctgaa agaagaagtg cgtaacgaac tgatgattcg tgcatgtaat 240
gaagcgagcc ggtatatcaa actgatccag ctgatcgatg ttgttgaacg tctggggctg 300
gcctatcatt ttgaaaaaga gattgaggaa agcctccagc atatatatgt gacgtatggt 360
cataaatgga cgaattacaa caatattgag agcctgagtc tgtggttccg cctgcttcgt 420
caaaatggct ttaatgttag ctcggatata tttgaaaatc acattgatga gaaaggaaat 480
tttcaggaga gcctgtgcaa tgatccgcag gggatgctgg cgctgtatga agcggcatat 540
atgcgtgttg aaggagagat cattctggac aaagcactcg aatttaccaa gctgcatctg 600
gggatcatta gcaatgatcc tagctgtgat agcagcctac gtacggaaat caagcaggca 660
ctgaaacagc cactgcgccg gcggctgcca aggctggaag ccgttcgtta cattgccatt 720
tatcagcaga aggcgagcca tagcgaggtt ctgctgaagc tggccaaact ggacttcaac 780
gttctgcagg aaatgcacaa agacgaattg agccaaatat gcaaatggtg gaaagatctg 840
gatatacgta acaaactgcc ctatgttcgt gatcgtctga ttgaaggcta tttttggatt 900
ctgggtattt atttcgaacc gcaacactcc cgtacccgta tgttcctgat gaaaacctgt 960
atgtggctga tcgtgctgga cgatacgttt gataattacg gcacctatga agagttagag 1020
atctttaccc aagcagtcga acgttggagc attacctgtc tggatgaact gccagagtat 1080
atgaagctga tatatcacga gcaatttcgc gtgcatcagg aaatggagga aagcctggaa 1140
aaggagggta aggcctacca gattcattat atcaaagaaa tggccaaaga aggtactcgt 1200
tcgctgctgc tggaagcgaa atggctgaag gaaggctata tgcctaccct ggatgagtac 1260
ctgagcaaca gcctggtcac ctgcggctat gcactgatga ccgcacgcag ctacgttgcc 1320
cgtgacgacg gcattgttac cgaagatgca ttcaaatggg ttgcaacgca cccgccgatt 1380
gttaaagcag catgcaaaat tctgcgcctg atggacgaca ttgcaaccca taaagaggaa 1440
caggagcggg gacacattgc aagtagcatt gagtgttaca ggaaggaaac cggagctagc 1500
gaagaggagg cttgcatgga ctttctgaag caggttgaag atggttggaa agttattaat 1560
caagaaagcc tgatgccgac cgatgttccg ttccctctgc tgattccggc aattaacctg 1620
gcacgtgtga gcgacaccct gtacaaagac aacgatggtt ataatcatgc cgataaagag 1680
gttataggtt atattaaaag cctgtttgta catccgatga tagtcggaat cggaggagac 1740
tttccgcagc aactcgaagc ctgcgttaag caggccaacc aggcgctgag ccgttttatc 1800
gccccactgc cctttcagaa cactcccgtg gtcgaaacca tgcagtatgg cgcattatta 1860
ggtggtaagc gcctgcgacc tttcctggtt tatgccaccg gtcatatgtt cggcgttagc 1920
acaaacacgc tggacgcacc cgctgccgcc gttgagtgta tccacgctta ctcattaatt 1980
catgatgatt taccggcaat ggatgatgac gatctgcgtc gcggtttgcc aacctgccat 2040
gtgaagtttg gcgaagcaaa cgcgattctc gctggcgacg ctttacaaac gctggcgttc 2100
tcgattttaa gcgatgccga tatgccggaa gtgtcggacc gcgacagaat ttcgatgatt 2160
tctgaactgg cgagcgccag tggtattgcc ggaatgtgcg gtggtcaggc attagattta 2220
gacgcggaag gcaaacacgt acctctggac gcgcttgagc gtattcatcg tcataaaacc 2280
ggcgcattga ttcgcgccgc cgttcgcctt ggtgcattaa gcgccggaga taaaggacgt 2340
cgtgctctgc cggtactcga caagtatgca gagagcatcg gccttgcctt ccaggttcag 2400
gatgacatcc tggatgtggt gggagatact gcaacgttgg gaaaacgcca gggtgccgac 2460
cagcaacttg gtaaaagtac ctaccctgca cttctgggtc ttgagcaagc ccggaagaaa 2520
gcccgggatc tgatcgacga tgcccgtcag tcgctgaaac aactggctga acagtcactc 2580
gatacctcgg cactggaagc gctagcggac tacatcatcc agcgtaataa ataa 2634
<210> 21
<211> 5941
<212> DNA
<213> mvaKmm-mvaD-mvaK2-idi-mvaS-atoB
<400> 21
taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 60
tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 120
ttacgaattc gagctcggta cccggggatc catggtgagc tgcagcgcgc cgggcaaaat 180
ttatctgttt ggcgaacatg cggtggtgta tggcgaaacc gcgattgcgt gcgcggtgga 240
actgcgcacc cgcgtgcgcg cggaactgaa cgatagcatt accattcaga gccagattgg 300
ccgcaccggc ctggattttg aaaaacatcc gtatgtgagc gcggtgattg aaaaaatgcg 360
caaaagcatt ccgattaacg gcgtgtttct gaccgtggat agcgatattc cggtgggcag 420
cggcctgggc agcagcgcgg cggtgaccat tgcgagcatt ggcgcgctga acgaactgtt 480
tggctttggc ctgagcctgc aggaaattgc gaaactgggc catgaaattg aaattaaagt 540
gcagggcgcg gcgagcccga ccgataccta tgtgagcacc tttggcggcg tggtgaccat 600
tccggaacgc cgcaaactga aaaccccgga ttgcggcatt gtgattggcg ataccggcgt 660
gtttagcagc accaaagaac tggtggcgaa cgtgcgccag ctgcgcgaaa gctatccgga 720
tctgattgaa ccgctgatga ccagcattgg caaaattagc cgcattggcg aacagctggt 780
gctgagcggc gattatgcga gcattggccg cctgatgaac gtgaaccagg gcctgctgga 840
tgcgctgggc gtgaacattc tggaactgag ccagctgatt tatagcgcgc gcgcggcggg 900
cgcgtttggc gcgaaaatta ccggcgcggg cggcggcggc tgcatggtgg cgctgaccgc 960
gccggaaaaa tgcaaccagg tggcggaagc ggtggcgggc gcgggcggca aagtgaccat 1020
taccaaaccg accgaacagg gcctgaaagt ggattaaatg gatagagagc ctgtaacagt 1080
acgttcctac gcaaatattg ctattatcaa atattgggga aagaaaaaag aaaaagagat 1140
ggtgcctgct actagcagta tttctctaac tttggaaaat atgtatacag agacgacctt 1200
gtcgccttta ccagccaatg taacagctga cgaattttac atcaatggtc agctacaaaa 1260
tgaggtcgag catgccaaga tgagtaagat tattgaccgt tatcgtccag ctggtgaggg 1320
ctttgtccgt atcgatactc aaaacaatat gcctactgca gcgggcctgt cctcaagttc 1380
tagtggtttg tccgccctgg tcaaggcttg taatgcttat ttcaagcttg gattggatag 1440
aagtcagttg gcacaggaag ccaaatttgc ctcaggctct tcttctcgga gtttttatgg 1500
accactagga gcctgggata aggatagtgg agaaatttac cctgtagaga cagacttgaa 1560
actagctatg attatgttgg tgctagagga caagaaaaaa ccaatctcta gccgtgacgg 1620
gatgaaactt tgtgtggaaa cctcgacgac ttttgacgac tgggttcgtc agtctgagaa 1680
ggactatcag gatatgctga tttatctcaa ggaaaatgat tttgccaaga ttggagaatt 1740
aacggagaaa aatgccctgg ctatgcatgc tacgacaaag actgctagtc cagccttttc 1800
ttatctgacg gatgcctctt atgaggctat ggactttgtt cgccagcttc gtgagaaagg 1860
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agacttggag catttatcag aaattttcgg tcatcgttat cgcttgattg tgtcaaaaac 1980
aaaggatttg agtcaagatg attgctgtta aatgattgct gttaaaactt gcggaaaact 2040
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ggcaggtcag gcgcagagca ttgtggcggg gggtatggaa aatatgagtt tagcccccta 3960
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tgcggcgctg gcagcaggcc ttacccccct ggctcgcatt aaaagttatg ccagcggtgg 4440
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ggcggggctg caactggcgg atattgatct cattgaggct aatgaagcat ttgctgcaca 4560
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cttttggcgt ccaacaggcc atccatatcc tatggtcgat ggtcctttgt caaacgaaac 5400
ctacatccaa tcttttgccc aagtctggga tgaacataaa aaacgaaccg gtcttgattt 5460
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a 5941
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<212> DNA
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<400> 22
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tttgcggagc aaaagatttt attcagtatt ttaagtaatt atgccacgga gtcggttgtt 1800
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gccgtttatg ttgccagaca gcgctactga ttaagcggac atatgaatat cctccttag 59
<210> 54
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<400> 61
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Claims (20)

1.一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌，其特征在于：它是重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含如下基因：
(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、MVA途径基因、乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因；
其中，MVA途径基因包括甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因和/或甲羟戊酸激酶mvaK1基因；
所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因来自春黄菊花；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因来源于大肠杆菌Escherichia coli；所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因来自甲烷八叠球古菌Methanosarcina mazei；所述甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和甲羟戊酸激酶mvaK1基因来自肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae；所述异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因来自大肠杆菌Escherichia coli；所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因来自粪肠球菌Enterococcus faecalis；
所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因来自大肠杆菌Escherichia coli，所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因是来源于Silicibacter pomeroyi的mvaA基因进行密码子优化后所得。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述法尼基二磷酸合酶ispA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因序列如SEQ ID NO.4所示；
所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，甲羟戊酸激酶mvaK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌不含如下基因：富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因、乳酸脱氢酶ldhA基因。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述富马酸还原酶frdc基因序列如SEQ ID NO.5所示；
所述乙醛-CoA脱氢酶adhE基因序列如SEQ ID NO.6所示；
所述乳酸脱氢酶ldhA基因序列如SEQ ID NO.7所示。
6.如权利要求1～5任一项所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因的5’端连接有如SEQ ID NO.14所示序列；
所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因的5’端连接有序列GGTTAAACC；
所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的5’端连接有如SEQ ID NO.15所示序列；所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因的5’端连接有如SEQ ID NO.16所示序列；所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的5’端连接有如SEQ ID NO.17所示序列；所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的5’端连接有如SEQ ID NO.18所示序列。
7.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌E.coliDH5α或E.coli W3110。
8.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因与法尼基二磷酸合酶ispA基因之间连接有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；
优选地，所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因去掉终止密码子TAA，所述法尼基二磷酸合酶ispA基因去掉起始密码子ATG后，通过SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列连接。
9.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，它是含有重组质粒pSTV28-24-a和重组质粒pTrc99A-1的大肠杆菌；
所述重组质粒pSTV28-24-a是含有(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因的pSTV28质粒；
所述重组质粒pTrc99A-1是含有甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、甲羟戊酸激酶mvaK1基因的pTrc99A质粒。
10.如权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒pSTV28-24-a是含有如SEQ ID NO.20和如SEQ ID NO.21所示序列的pSTV28质粒；
所述重组质粒pTrc99A-1是含有如SEQ ID NO.22所示序列的pTrc99A质粒。
11.权利要求1～10任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因和法尼基二磷酸合酶ispA基因融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体A；
2)取甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因融合，融合产物与酶切后的步骤1)所得重组表达载体A连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体B；所述乙酰乙酰CoA硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因序列如SEQ ID NO.23所示；
3)取乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因与酶切后的步骤2)所得重组表达载体B连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体C；
4)取3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶mvaA-1基因与酶切后的步骤3)所得重组表达载体C连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体D；
5)取甲羟戊酸激酶mvaK1基因，与包含甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和异戊烯基二磷酸δ-异构酶idi基因的基因片段融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体E；
6)将步骤4)所得重组表达载体D、步骤5)所得重组表达载体E导入大肠杆菌中，即得。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述大肠杆菌是：在大肠杆菌基因组上叠加敲除富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组大肠杆菌；
优选地，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌基因组上叠加敲除富马酸还原酶frdc基因、乙醛-CoA脱氢酶adhE基因以及乳酸脱氢酶ldhA基因的重组大肠杆菌E.coli DH5α或E.coliW3110。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述(-)-α-红没药醇合成酶MrBBS基因中的终止密码子TAA被如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列代替；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因中的起始密码子ATG被如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列代替。
14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述乙酰乙酰CoA硫解酶atoB基因原位替换重组表达载体B上的mvaE基因，与重组表达载体B连接。
15.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述线性化表达载体是psTV28质粒，和/或，步骤5)所述线性化表达载体是pTrc99A质粒。
16.权利要求1～10任一项所述的重组基因工程菌在制备(-)-α-红没药醇及其制剂中的用途。
17.一种产(-)-α-红没药醇的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)取权利要求1～3、6～10任一项所述的重组基因工程菌，接种于种子培养基，培养8～10h；
(2)将种子液接种于发酵培养基，加正十二烷以及IPTG，发酵培养30～60h，分离纯化即得；
所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、磷酸氢二钾2～3g/L、酵母粉20～25g/L、酵母蛋白胨10～15g/L、IPTG 0.05～0.15mM、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度为30～40mg/L，余量为水；
优选地，所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基、正十二烷的体积比为5：1，IPTG的添加量为：培养容器容量0.04％的0.25M IPTG母液。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：振荡培养，温度30℃，转速200rpm。
19.一种产(-)-α-红没药醇的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)取权利要求4～10任一项所述的重组基因工程菌，接种于种子培养基，培养8～10h；再接种于含葡萄糖的LB培养基中，培养时间16-20h，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基，加正十二烷、碳酸镁以及IPTG，厌氧发酵培养30～60h，分离纯化即得；
所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、葡萄糖5～15g/L氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述含葡萄糖的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～8g/L、氯化钠5～15g/L、葡萄糖10～20g/L、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L和氯霉素终浓度30～40mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、磷酸氢二钾2～3g/L、酵母粉20～25g/L、酵母蛋白胨10～15g/L、碳酸镁15～25g/L、IPTG 0.05～0.15mM、氨苄青霉素终浓度50～150mg/L、氯霉素终浓度为30～40mg/L，余量为水；
优选地，所述种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述含葡萄糖的LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、10g/L葡萄糖、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、酵母粉24g/L、酵母蛋白胨12g/L、碳酸镁20g/L、IPTG 0.1mM、氨苄青霉素终浓度100mg/L和氯霉素终浓度为34mg/L，余量为水；
所述发酵培养基、正十二烷的体积比为5：1，IPTG的添加量为：培养容器容量0.04％的0.25M IPTG母液。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述种子液离心收集菌体的OD600至少为20，再转入发酵培养基进行厌氧发酵培养；所述厌氧发酵培养条件为：振荡培养，温度30℃，转速200rpm，以1mL/min速度注入CO21min。
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