CN112126615B - 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述枯草芽孢杆菌的基因组上缺失自溶相关基因和乙酸代谢相关基因；同时，所述基因组上还包含丁酸合成相关基因BCoAT。本发明中，将底盘细胞枯草芽孢杆菌中的自溶相关基因和乙酸代谢相关基因敲除，同时将丁酸合成相关基因BCoAT插入枯草芽孢杆菌的基因组上，优化枯草芽孢杆菌的丁酸代谢途径，敲除旁路基因并引入异源代谢途径，最终优化得到的枯草芽孢杆菌的丁酸产量相对原始菌的产量提高了6.95倍。

Description

一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
丁酸(butyric acid，BA)是肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸(SCFA)之一，主要以游离的形式存在。人和动物胃肠道中都栖息了大量的产丁酸微生物。已有研究证实，丁酸具有许多重要的生理功能，参与物质代谢、促进肠道组织发育、增强机体免疫等生理活动。
目前，丁酸作为一种广泛应用于食品、化学和医药等行业的有机酸，其生产工艺以化学合成为主，但是随着人们环保意识的增强和石油能源价值的提高，生物合成法越来越受到社会的关注。由于丁酸发酵是一种终产物抑制发酵，因此微生物发酵法生产丁酸收率较低且经济效益差，难以替代化学合成法。因此，为了进一步提高丁酸发酵的产量，研究人员对发酵方法、发酵培养基及发酵菌株等进行了改进。
CN109355318A公开了一种发酵生产丁酸的方法，包括如下步骤：将酪丁酸梭菌(Clostrdium tyrobutyricum)活化，制备成种子液；以甘露醇和葡萄糖的混合物为碳源，配制液体培养基，并经过灭菌；将种子液接种于液体培养基中，在温度为35～39℃，pH为5～7，转速为100～300rpm的条件下，进行细胞发酵，得到丁酸。此发明可以提高目标产物丁酸的转化率和选择性，从而降低后续的分离纯化成本。然而，该方法需要以大量的葡萄糖、甘露醇作为发酵碳源，若以废弃物作为碳源，则存在大量毒性抑制物，因此该发酵方法成本较高。
CN108441462A公开了一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ΔWB800及其制备方法，通过对枯草芽抱杆菌ΔWB800菌株的自溶相关基因skfA、sdpC、lytC和xpf的敲除，获得了自溶抑制菌株ΔWB800，该菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐的优良性能，显现出了较好的工业应用前景。虽然，原始枯草芽孢杆菌具有一定的产丁酸能力，但丁酸产量较低，该发明仅提高了菌株耐热和耐酸等性能，并未明显提升枯草芽胞杆菌的丁酸产量。
因此，提供一种丁酸产量较高的枯草芽孢杆菌对于本领域而言具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述枯草芽孢杆菌的丁酸产量较高，且构建方法成熟，成功率较高，适用于丁酸的发酵和生产。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的基因组上缺失自溶相关基因和乙酸代谢相关基因；同时，所述基因组上还包含丁酸合成相关基因BCoAT。
其中，丁酸合成相关基因BCoAT，即(丁酰CoA:乙酸)CoA转移酶(butyryl-CoA:acetate CoA-transferase，BCoAT)基因，是一种丁酸合成非经典途径上所涉及的基因。本发明中，通过敲除丁酸自溶相关基因和旁路代谢相关基因，同时插入丁酸合成相关基因BCoAT，能够明显提高枯草芽孢杆菌的丁酸产量。
作为本发明优选的技术方案，所述基因组上还包括硫解酶基因(thiolase，THL)、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因(β-hydroxybutyl-CoA dehydrongenase，BHBD)、丁酰CoA脱氢酶基因(butyryl-CoA dehydrogenase，BCD)和巴豆酸酶基因(crotonase，CRO)。
优选地，所述基因组上硫解酶基因、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因和BCoAT基因顺次连接。
丁酸合成微生物基因组的分析表明，在丁酸合成的中心途径中，相关酶基因的排列方式存在多样性，并且与最终途径酶基因的分布存在联系。在传统的BK途径中，大多数丁酰磷酸转移酶和丁酸激酶基因成对存在，且与中心途径的酶基因是相邻排列。
而在含有BCoAT编码基因的产丁酸菌中，最终途径酶基因分布没有规律性，与中心途径酶基因的分布排列呈现出多样性，这可能对BA的合成产生影响。本发明中，硫解酶基因、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因和BCoAT基因顺次连接，所得枯草芽孢杆菌的丁酸产量最高。
优选地，所述自溶相关基因包括skfA、sdpC、lytC或xpf中的任意一种或至少两种的组合，优选为skfA和sdpC的组合。
优选地，所述乙酸代谢相关基因包括acdA基因和/或ackA基因。
乙酸也是枯草芽孢杆菌代谢的产物，其与丁酸分享共同的底物乙酰CoA，会弱化丁酸合成方向的代谢流。因此，阻断AA的合成途径，减少AA的合成，是增强丁酸合成的有效途径。基因acdA编码乙酰CoA连接酶，调控乙酰CoA生成乙酸，敲除该基因可以阻断乙酸的生成。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的枯草芽孢杆菌的构建方法，具体包括如下步骤：
采用双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系对底盘细胞进行基因编辑，敲除自溶相关基因和乙酸代谢相关基因，插入丁酸合成相关基因BCoAT，得到所述枯草芽孢杆菌。
双质粒CRISRP/Cas9基因编辑体系，主要包括pCas质粒和pTargetF质粒，pCas质粒产生Cas蛋白，pTargetF质粒产生引导RNA，两者结合引导Cas蛋白特异性切割基因组。本发明主要以pTargetF质粒为骨架构建靶向引导质粒，该质粒主要包括启动子、sgRNA、同源臂修复片段，选择原有的壮观霉素作为筛选标记基因，sgRNA的转录由组成型P43启动子来完成。
作为本发明优选的技术方案，所述底盘细胞的基因组上包括顺次相连的硫解酶基因、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、丁酰CoA脱氢酶基因和巴豆酸酶基因。本发明中，所用的底盘细胞为Bacillus subtilis SCK6。
优选地，所述双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系中，所用的质粒包括pCas质粒和pTargetF质粒。
优选地，所述pCas质粒上的筛选标记包括卡那霉素(Kanamycin)标记基因。
优选地，所述pCas质粒上还包括温敏性复制子区域rep101。pCas质粒中含有温度敏感的复制子区域rep101，当培养温度超过30℃后，质粒对温度敏感，因此，pCas质粒选择在37℃过夜培养中生长即可以被消除。
在敲除自溶相关基因和乙酸代谢相关基因时，所述pTargetF质粒上包括启动子、筛选标记和sgRNA。
优选地，所述启动子包括P43启动子。
优选地，所述筛选标记包括壮观霉素(spectinomycin)标记基因。
优选地，所述sgRNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTG；
在插入丁酸合成相关基因BCoAT时，所述pTargetF质粒上还包括同源臂和丁酸合成相关基因BCoAT。
优选地，所述丁酸合成相关基因BCoAT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2为：
ATGGATTTTACGGAATTGTATGCGCAGAAGAAAATGACAGCTGACCAGGCTGCCGCGTTGGTCAAAAGCGGCGACTGGGTGGATTACGGCTGGGCTGTGAACACCCCCGTTGCAGTGGACGCTGCCATTGCAAAGCGTCTGCCCGAGCTGGAGGATGTCAACTTCCGCGGCGGCATCCTGATGTGGGTGCCCGCCATCTTCCAGATCGAGGATCCCGCTGCCCACATGACCTGGAACAGCTGGCACATGGGCGGCATTGAGCGCAAGGCCATTGCCCAGGGCTTCTCCTTCTACTCCCCCATCCGCTACTCTGAACTGCCCCGCTACTATCGCGACAGCTCTGACCCCGTGGATGTGGCGGTGTTCCAGGTGACCCCCATGGACGAGCACGGCTATTTTAACTTTGGCCCCTGTGCTTCCCACCTGGGTGCCGTCTGCGATAAGGCCAAAAAGATCATCGTTGAGGTCAATCGGAACATGCCCAAATGCCTGGGCGGCACCGAGAACTGGGTGCACATCTCCCAGGTTGCCGGTGTTGTGGAGGGCAGCAACCCGCCCATCGGCCAGATGGCCGCTGCCGGTGCCGCCACCGAGGTCGATCTGAAGGTGGCAAACCTCATCGTCCCGCAGATCCCCGACGGTGCCTGCCTGCAGCTGGGCATCGGCGGTATGCCCAACGCCATCGGCAACCTGATCGCGCAGAGCGACCTGAAGGATCTGGGCGTGCACACCGAGATGTATGTGGATGCCTTTGTGGATATTGCAAAGGCAGGCAAGATCACCGGCCGCCACAAGAATCTGGACAAGGGCCGTCAGGTCTATGCCTTTGGTGCCGGCACCCAGAAGATGTATGATTACCTGAACGACAACCCGGAGTGCATGGCCGCTCCCGTGGAGTACACCAACGACATCCGCAGCATCTCCGCCATCGACAACTTCATCTCCATCAACAATGCGGTGGACATTGACCTGTTCGGTCAGGTGAACGCGGAGAGCGCAGGCATCAAGCACATTTCCGGTGCAGGTGGTCAGCTGGACTTTGTTCTGGGCGCATACCTTTCCAACGGCGGCAAGAGCTTCATCTGCCTGTCCTCTACCTTTATGAATAAAAAGACCGGCAAGCTGGAGAGCCGCATCCGTCCCACCCTGGAAAACGGCAGCATCGTCACCGACACCCGCGCAAACGTGCACTACCTGTGCACCGAGTACGGCTGTGTGAACCTGAAGGGACTGACCAGCTGGGAAAAGGCAGAAGCACTGATCAGCGTGGCACACCCCGATTTCCGGGACGAGCTGATCGCCGAAGCCGAAAAACTGCACATCTGGCGCAGGAGCAACAAGCGCTGA
示例性地，本发明中所述枯草芽孢杆菌基因组可以采用如下方法进行编辑：
1、提取pCas质粒并将其转入枯草芽孢杆菌中，使用含有卡那霉素抗性的LB平板进行筛选，获得阳性单克隆；
2、将所述阳性单克隆制成感受态细胞，转入pTargetF质粒，将转化液涂布于含有双重抗性，即含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上，倒置30℃恒温过夜培养，最终筛选获得同时含有pCas和pTargetF两个质粒的重组枯草芽孢杆菌；
3、将上述重组菌株接种至含有阿拉伯糖的LB液体培养基中，其中阿拉伯糖的终浓度为10～15mM(例如可以是11mM、12mM、13mM或14mM等)在30℃、200rpm摇床培养16～20h(例如可以是17h、18h或19h等)后，提取基因组，进行PCR和测序验证；
4、收集经过测序验证菌株进行质粒消除，具体操作为：
在验证编辑成功后，将菌株接种至含有卡那霉素和IPTG的培养基中，其中，卡那霉素的浓度为0.03～0.06g/L(例如可以是0.035g/L、0.04g/L、0.045g/L或0.05g/L)，IPTG的浓度为0.4～0.6mM(例如可以是0.42mM、0.45mM、0.48mM、0.5mM或0.55mM等)，在30℃、200rpm摇床中培养8～16h(例如可以是9h、10h、12h或14h等)，稀释后涂布至含有壮观霉素的LB平板上；通过测定菌落对壮观霉素的敏感性确认菌落是否被治愈，即是否消除了pTargetF质粒；
将pTargetF消除的菌落用于第二轮基因编辑，直至编辑工作完成。
其中，pCas质粒中含有温度敏感的复制子区域rep101，当培养温度超过30℃后，质粒对温度敏感，因此，pCas质粒选择在37℃过夜培养中生长以确定被消除。pCas质粒在编辑过程中一直存在，在编辑结束后被消除，消除质粒的菌株才是得到的工程菌，发酵的使用的菌株是不携带质粒的。
作为本发明优选的技术方案，所述构建方法包括如下步骤：
(1)构建用于敲除的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系，所述基因编辑体系包括含有卡那霉素标记基因的pCas质粒和含有壮观霉素标记基因的pTargetF质粒；
(2)将步骤(1)所述基因编辑体系转入底盘细胞，敲除自溶相关基因skfA，验证基因编辑成功后消除所述pCas质粒和pTargetF质粒；
其中，所述底盘细胞的基因组中包括硫解酶基因、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、丁酰CoA脱氢酶基因和巴豆酸酶基因，
(3)分别敲除自溶相关基因sdpC、乙酸代谢相关基因acdA和乙酸代谢相关基因ackA；
(4)构建用于插入的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系，包括pCas质粒和pTargetF质粒，所述pTargetF质粒上包含P43启动子、壮观霉素标记基因、sgRNA、同源臂和丁酸合成相关基因BCoAT，所述sgRNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述丁酸合成相关基因BCoAT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(5)将步骤(4)所述基因编辑体系转入敲除了skfA基因、sdpC基因、acdA基因和ackA基因的底盘细胞中，将所述丁酸合成相关基因BCoAT插入巴豆酸酶基因下游，得到所述枯草芽孢杆菌。
第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的枯草芽孢杆菌在制备丁酸中的应用。
示例性地，本发明可以使用如下方法对枯草芽孢杆菌进行发酵和产物测定，具体方法如下：
(1)菌株的发酵培养
将所构建的枯草芽孢杆菌接种于发酵瓶中，起始接种量为0.5～1.5％(例如可以是0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.3％或1.4％等)；
在37℃、180～220rpm(例如可以是190rpm、200rpm或210rpm等)条件下摇床培养发酵20～24h(例如可以是21h、22h、22.5h或23h等)，并在发酵过程中采用pH电极监控发酵液pH值，发酵初期pH值约为7，由于不断产酸，最终发酵液的pH约为4；
(2)短链脂肪酸(SCFAs)的测定
预处理：发酵结束后测定发酵液中SCFAs的含量，将收集的上清检测样品进行酸化处理；
取上清培养液于离心管中，加入质量分数为50％硫酸溶液和乙醚，室温下置于摇床中180～220rpm(例如可以是190rpm、200rpm或210rpm等)混合一段时间，离心，取上清，加入无水氯化钙(CaCl2)进行脱水处理，离心，取上清液用于气相色谱质谱联用(GC-MS)分析。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明中，采用双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系进行基因编辑，将底盘细胞枯草芽孢杆菌中的自溶相关基因和乙酸代谢相关基因敲除，同时将丁酸合成相关基因BCoAT插入枯草芽孢杆菌的基因组上，敲除旁路基因，优化枯草芽孢杆菌的丁酸代谢途径，得到了一种高产丁酸的枯草芽孢杆菌；
(2)本发明以Bacillus subtilis SCK6为出发菌株，将自溶相关基因skfA和sdpC和旁路代谢基因acdA、ackA的敲除，引入丁酸合成非经典途径基因BCoAT，并对BCoAT基因插入位置进行了优化，最终优化得到的枯草芽孢杆菌工程的丁酸产量高达1.53g/L，相对原始菌的产量提高了6.95倍。
附图说明
图1为实施例1中双质粒编辑体系中空白pTargetF质粒的结构示意图。
图2为实施例1中插入基因时双质粒编辑体系中pTargetF质粒的结构示意图。
图3为实施例1～3中构建的BsS-5、BsS-6和BsS-7的基因簇排列顺序示意图。
图4为验证实施例1～3中构建的BsS-5、BsS-6和BsS-7中含有BCoAT基因时所得的凝胶电泳图，其中泳道M表示DNA Marker，泳道1和2为BsS-5的验证结果，泳道4和5为BsS-6的验证结果，泳道7和8为BsS-7的验证结果，泳道3、6和9为空白对照。
图5为BsS、BsS-ΔskfA、BsS-ΔsdpC和BsS-1的丁酸产量柱状图。
图6为BsS-1、BsS-2、BsS-3和BsS-4的丁酸乙酸产量随时间变化曲线图；其中，A图为BsS-1对应的曲线，B图为BsS-2对应的曲线，C图为BsS-3对应的曲线，D图为BsS-4对应的曲线。
图7为BsS-4、BsS-5、BsS-6和BsS-7的丁酸产量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用实验方法均为本领域常见的技术方法；若无特殊说明，所使用的试剂、耗材和菌株等均可购自本领域常规厂商。
以下实施例中，所述枯草芽孢杆菌基因组的编辑方法如下：
1、将含有pCas质粒的菌株从-80℃中取出后接种于新鲜的液体LB培养基中，200rpm、37℃恒温摇床培养8～10h后涂布到含有卡那霉素的LB固体平板上，之后挑取单菌落于新鲜的LB培养基中过夜培养，提取pCas质粒；
2、将所述pCas质粒转入枯草芽孢杆菌中，用含有卡那霉素抗性的LB平板进行筛选，获得阳性单克隆后制备感受态细胞，之后再进行pTargetF质粒的转化；
3、将转化液涂布于含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上，倒置30℃恒温过夜培养，最终筛选获得同时含有pCas和pTargetF两个质粒的重组枯草芽孢杆菌；
4、之后将上述重组菌株接种至含有终浓度为10mM的阿拉伯糖的LB液体培养基中，在30℃、200rpm摇床培养16h后，提取基因组，进行PCR和测序验证；
5、在验证编辑成功后，将含有上述菌株接种至2mL培养基中(含有0.05g/L卡那霉素和0.5mM的IPTG)，在37℃、200rpm摇床培养16h，稀释后涂布至含有抗生素的LB平板上；
通过测定菌落对壮观霉素的敏感性确认菌落是否被治愈，即是否消除了pTargetF质粒，将pTargetF质粒消除的菌落用于第二轮基因编辑，直至编辑工作完成。
以下实施例中，所使用的发酵培养方法及产物测定方法如下：
(1)工程菌株的发酵培养
将所构建的工程菌接种于0.5L的发酵瓶中，发酵培养基为：在LB培养基中添加MgSO4·7H2O 0.4g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，补充葡萄糖含量为1％-3％。以起始接种量为1％进行接种，即5mL的种子液，在37℃、200rpm条件下摇床培养发酵约24h，发酵过程中采用pH电极监控发酵液pH值；
(2)短链脂肪酸(SCFAs)的测定
1、预处理
发酵结束后测定发酵液中SCFAs的含量，将收集的上清检测样品进行酸化处理，具体步骤如下：
取2mL上清培养液于5mL聚乙烯离心管中，加入0.4mL 50％的硫酸溶液和乙醚，置于摇床中室温、200rpm培养45min，然后3000rpm离心5min，取出上清置于另外一个无菌离心管中，加入无水氯化钙进行脱水处理，之后进一步取上清液用于气相色谱质谱联用分析；
2、GC-MS分析
所用色谱柱为Agilent 123-7032DB-WAX石英毛细管柱(30m×320μm×0.25μm)；
升温程序：柱温的起始温度为60℃，保持2min，10℃/min的速度上升至220℃，保持20min，以氦气作为载气，流速为1mL/min，分流比20:1，进样体积2μL，进样口起始温度为250℃。
质谱条件：EI离子源70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，溶剂延迟时间2min，扫描质量范围m/z 20-150。
实施例1
本实施例提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌。
所述枯草芽孢杆菌以原始Bacillus subtilis SCK6(BsS)为出发菌株，该菌株购自武汉淼灵生物科技有限公司，采用构建的双质粒编辑体系分别敲除基因skfA、sdpC，acdA和ackA；
再通过双质粒编辑体系在巴豆酸酶(CRO)基因簇的下游插入BCoAT基因RS-06650；所得枯草芽孢杆菌记为BsS-5。
其中，BCoAT基因来源于NCBI数据库肠道源产丁酸菌Faecalibacteriumprausnitzii A2-165，Gene ID 34752126，具体序列如SEQ ID NO.2所示；
双质粒编辑体系中空白pTargetF质粒的示意图如图1所示。
插入BCoAT基因时，双质粒编辑体系中pTargetF质粒的示意图如图2所示，其中，sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
与实施例1的区别在于，将BCoAT基因插入β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(BHBD)基因簇下游，其他步骤与实施例1相同，得到的枯草芽孢杆菌记为BsS-6。
实施例3
与实施例1的区别在于，将BCoAT基因插入硫解酶(THL)基因簇下游，其他步骤与实施例1相同，得到的枯草芽孢杆菌记为BsS-7。
实施例1～3中所得菌株的基因组中，编码THL、BHBD、BCD、CRO和BCoAT的基因簇的排列顺序如图3所示；
实施例1～3中插入BCoAT基因后，提取基因组进行验证，所得凝胶电泳图谱图如图4所示，由图可知，BsS-5、BsS-6和BsS-7中成功插入了BCoAT基因。
对比例1
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中仅敲除skfA基因，记为BsS-ΔskfA。
对比例2
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中仅敲除sdpC基因，记为BsS-ΔsdpC。
对比例3
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中仅敲除skfA基因和sdpC基因，记为BsS-1。
对比例4
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中敲除skfA基因、sdpC基因和acdA基因，记为BsS-2；
即在BsS-1的基础上，进一步敲除acdA基因。
对比例5
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中敲除skfA基因、sdpC基因和ackA基因，记为BsS-3；
即在BsS-1的基础上，进一步敲除ackA，记为BsS-3。
对比例6
与实施例1的区别在于，本对比例提供的枯草芽孢杆菌中敲除skfA基因、sdpC基因、acdA基因和ackA基因，记为BsS-4；
在BsS-1的基础上，进一步敲除acdA和ackA，记为BsS-4。
上述实施例及对比例提供的菌株信息汇总如下表1所示：
表1
Figure BDA0002713751730000141
针对上述实施例及对比例提供的菌株进行性能比较，具体测试如下：
(1)菌株生长速率比较
与BsS相比，BsS-ΔskfA，BsS-ΔsdpC和BsS-1的生长速率得到了提高，BsS在培养16h后，OD600趋于稳定，而BsS-ΔskfA，BsS-ΔsdpC和BsS-1三者的生长速率相似，在培养约10h后即可趋于稳定；同时，菌体的干重量增加，BsS的菌体干重最低，BsS-1的菌体干重最高，BsS-ΔskfA次之，且结合如图5可知，敲除基因skfA和sdpC不仅可以提高菌株的生物量和生长速率，同时，还能提高丁酸产量，其中，BsS-1的丁酸产量显著提高。
(2)乙酸和丁酸产量测试
以工程菌BsS-1作为底盘细胞，进一步敲除acdA和ackA基因，依次得到工程菌株BsS-2(敲除acdA)，BsS-3(敲除ackA)和BsS-4(同时敲除acdA和ackA)。
BsS-1、BsS-2、BsS-3和BsS-4的丁酸产量及乙酸产量如图6所示，其中，A图为BsS-1对应曲线，B图为BsS-2对应曲线，C图为BsS-3对应曲线，D图为BsS-4对应曲线。由图可知，菌株BsS-4的AA产量明显降低。
以工程菌BsS-4作为底盘细胞，分别在不同位置插入BCoAT基因，得到BsS-5、BsS-6和BsS-7，最终所得丁酸产量如图7所示，由图可知，插入BCoAT基因后，BsS-5、BsS-6和BsS-7的丁酸产量明显上升，且以BsS-5产量最高，约为1.53g/L，BsS-6和BsS-7的丁酸产量分别为1.009g/L和0.91g/L。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
<130> 20200915
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttg 84
<210> 2
<211> 1347
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<400> 2
atggatttta cggaattgta tgcgcagaag aaaatgacag ctgaccaggc tgccgcgttg 60
gtcaaaagcg gcgactgggt ggattacggc tgggctgtga acacccccgt tgcagtggac 120
gctgccattg caaagcgtct gcccgagctg gaggatgtca acttccgcgg cggcatcctg 180
atgtgggtgc ccgccatctt ccagatcgag gatcccgctg cccacatgac ctggaacagc 240
tggcacatgg gcggcattga gcgcaaggcc attgcccagg gcttctcctt ctactccccc 300
atccgctact ctgaactgcc ccgctactat cgcgacagct ctgaccccgt ggatgtggcg 360
gtgttccagg tgacccccat ggacgagcac ggctatttta actttggccc ctgtgcttcc 420
cacctgggtg ccgtctgcga taaggccaaa aagatcatcg ttgaggtcaa tcggaacatg 480
cccaaatgcc tgggcggcac cgagaactgg gtgcacatct cccaggttgc cggtgttgtg 540
gagggcagca acccgcccat cggccagatg gccgctgccg gtgccgccac cgaggtcgat 600
ctgaaggtgg caaacctcat cgtcccgcag atccccgacg gtgcctgcct gcagctgggc 660
atcggcggta tgcccaacgc catcggcaac ctgatcgcgc agagcgacct gaaggatctg 720
ggcgtgcaca ccgagatgta tgtggatgcc tttgtggata ttgcaaaggc aggcaagatc 780
accggccgcc acaagaatct ggacaagggc cgtcaggtct atgcctttgg tgccggcacc 840
cagaagatgt atgattacct gaacgacaac ccggagtgca tggccgctcc cgtggagtac 900
accaacgaca tccgcagcat ctccgccatc gacaacttca tctccatcaa caatgcggtg 960
gacattgacc tgttcggtca ggtgaacgcg gagagcgcag gcatcaagca catttccggt 1020
gcaggtggtc agctggactt tgttctgggc gcataccttt ccaacggcgg caagagcttc 1080
atctgcctgt cctctacctt tatgaataaa aagaccggca agctggagag ccgcatccgt 1140
cccaccctgg aaaacggcag catcgtcacc gacacccgcg caaacgtgca ctacctgtgc 1200
accgagtacg gctgtgtgaa cctgaaggga ctgaccagct gggaaaaggc agaagcactg 1260
atcagcgtgg cacaccccga tttccgggac gagctgatcg ccgaagccga aaaactgcac 1320
atctggcgca ggagcaacaa gcgctga 1347

Claims (2)

1.一种产丁酸的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
（1）构建用于敲除的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系，所述基因编辑体系包括含有卡那霉素标记基因的pCas质粒和含有壮观霉素标记基因的pTargetF质粒；
（2）将步骤（1）所述基因编辑体系转入底盘细胞，敲除自溶相关基因skfA，验证基因编辑成功后消除所述pTargetF质粒；
其中，所述底盘细胞的基因组中包括硫解酶基因、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、丁酰CoA脱氢酶基因和巴豆酸酶基因；
（3）分别敲除自溶相关基因sdpC、乙酸代谢相关基因acdA和乙酸代谢相关基因ackA，验证基因编辑成功后消除所述用于敲除的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系；
（4）构建用于插入的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑体系，包括pCas质粒和pTargetF质粒，所述pTargetF质粒上包含P43启动子、壮观霉素标记基因、sgRNA、同源臂和丁酸合成相关基因BCoAT；
所述sgRNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（5）将步骤（4）所述基因编辑体系转入敲除了skfA基因、sdpC基因、acdA基因和ackA基因的底盘细胞中，将所述丁酸合成相关基因BCoAT插入巴豆酸酶基因下游，得到所述枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述丁酸合成相关基因BCoAT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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