CN114989996B - 一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，其为包含编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因、编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因的重组宿主菌；所述宿主菌优选为酿酒酵母BY4741。该基因工程菌安全无毒，且能够高产对羟基苯甲酸甲酯；利用该基因工程菌生产对羟基苯甲酸甲酯，转化率高，经济性好，易于工业化生产，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学领域，涉及一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌及其应用。
背景技术
对羟基苯甲酸甲酯(Methyl p-hydroxybenzoate)分子式为C8H7O3，化学式量为151.1399。对羟基苯甲酸甲酯是一种芳香族化合物，在医药、食品、化妆品等行业广泛用作防腐剂以及抗菌剂，在饲料添加剂方面也有广泛的应用前景。
目前，对羟基苯甲酸甲酯主要以化学合成的方法生产。但传统化学合成方法存在污染大、成本高、产率低等缺点。随着合成生物学的大力发展，生物法合成对羟基苯甲酸甲酯成为一种替代化学合成最具潜力的策略。
因此，目前需要研究开发一种转化率高，经济性好，易于工业化生产的对羟基苯甲酸甲酯生物合成技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产对羟基苯甲酸甲酯的酿酒酵母基因工程菌，利用该基因工程菌生产对羟基苯甲酸甲酯，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
为此，本发明提供了一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，其为包含编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因、编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因为来源于大肠杆菌(菌株K12)的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic或来源于大肠杆菌(菌株K12)且经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic。
在本发明的一些优选的实施例中，所述编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因为来源于大肠杆菌(菌株K12)且经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic。
在本发明的另一些实施例中，所述编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因选自来源于澳大利亚烟草的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt或来源于澳大利亚烟草且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt、来源于拟南芥的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1或来源于拟南芥且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1、来源于矮牵牛的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2或来源于矮牵牛的且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2。
在本发明的一些优选的实施例中，所述编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因为来源于澳大利亚烟草且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt。
本发明中，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为酿酒酵母。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述宿主菌为酿酒酵母BY4741。
本发明还提供了一种如本发明上述的基因工程菌在生产对羟基苯甲酸甲酯中的应用。
根据本发明，所述应用包括将产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得对羟基苯甲酸甲酯。
在本发明的一些实施例中，所述发酵培养条件为：发酵培养时间为120小时，温度为30℃。
在本发明的一些实施方式中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
步骤S1，向发酵培养液加入等量乙酸乙酯，进行第Ⅰ次离心分离，获得第Ⅰ上清液；
步骤S2，将上层有机相取出，旋蒸后加入甲醇，进行第Ⅱ次离心分离，获得第Ⅱ上清液；
步骤S3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液，获得对羟基苯甲酸甲酯。
本发明人以酿酒酵母为宿主细胞，通过导入异源编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因以及异源编码苯甲酸羧甲基转移酶基因，构建并获得一种生产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，该菌为可高产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，利用该基因工程菌生产对羟基苯甲酸甲酯，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出在酿酒酵母中构建对羟基苯甲酸甲酯生物合成途径示意图；以酿酒酵母内源莽草酸途径生成的分支酸(CHA)为前体，在Ubic基因编码的分支酸丙酮酸裂解酶作用下转化为对羟基苯甲酸(P-HBA)，在Bsmt编码的苯甲酸羧甲基转移酶作用下合成对羟基苯甲酸甲酯。
图2示出分支酸丙酮酸裂解酶基因与不同来源的苯甲酸羧甲基转移酶基因对生产对羟基苯甲酸甲酯产量的影响。
图3示出GC-MS分析发酵产物对羟基苯甲酸甲酯的质子图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
I.术语
本发明所述用语“内源途径”是指生物合成芳香族化合物的莽草酸途径以及维持微生物生命活动的糖酵解途径、戊糖磷酸途径。
本发明所述用语“异源性基因”是通过基因工程技术等途径引入靶细胞中的基因序列。
本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌或真菌，例如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。
本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
Ⅱ.实施方案
为实现上述生物合成对羟基苯甲酸甲酯的目标，本发明人对生物法合成对羟基苯甲酸甲酯的工艺技术进行了大量的研究。本发明人发现采用酿酒酵母为宿主细胞，通过导入编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因、编码苯甲酸/水杨酸所甲基转移酶的基因，成功构建并获得一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，利用该基因工程菌生产对羟基苯甲酸甲酯转化率高，经济性好，易于工业化生产，由此获得本发明。
因此，本发明提供了一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，其为表达了对羟基苯甲酸甲酯合成路径中的基因的重组宿主菌。
本发明中生物合成对羟基苯甲酸甲酯的反应机理如图1所示，基于图1可以理解，所述对羟基苯甲酸甲酯合成路径中的基因包括码编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因和编码苯甲酸/水杨酸所甲基转移酶的基因。
基于上述容易理解，本发明所涉及的产地羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌为包含编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因和编码苯甲酸/水杨酸所甲基转移酶的基因的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因为来源于大肠杆菌(菌株K12)的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic或来源于大肠杆菌(菌株K12)且经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic。
在本发明的一些优选的实施例中，所述编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因为来源于大肠杆菌(菌株K12)且经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于大肠杆菌(菌株K12)的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic(GenBank:AAA24716.1)的核酸序列如SEQ No.1所示。
在本发明的另一些具体实施例中，所述来源于大肠杆菌(菌株K12)且经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic的核酸序列如SEQ No.2所示。
在本发明的另一些实施例中，所述编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因选自来源于澳大利亚烟草的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt或来源于澳大利亚烟草且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt、来源于拟南芥的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1或来源于拟南芥且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1、来源于矮牵牛的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2或来源于矮牵牛的且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2。
在本发明的一些优选的实施例中，所述编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因为来源于澳大利亚烟草且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于澳大利亚烟草的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt(GenBank:CAF31508.1)的核苷酸序列如SEQ No.3所示。
在本发明的另一些具体实施例中，所述来源于澳大利亚烟草且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt的核苷酸序列如SEQ No.4所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于拟南芥的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因BSMT1(GenBank：AAP57210.1)的核苷酸序列如SEQ No.5所示。
在本发明的另一些具体实施例中，所述来源于拟南芥且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因BSMT1的核苷酸序列如SEQ No.6所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于矮牵牛的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因BSMT2(GenBank：AAO45013.1)的核苷酸序列如SEQ No.7所示。
在本发明的另一些具体实施例中，所述矮牵牛的且经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因BSMT2的核苷酸序列如SEQ No.8所示。
本发明实施方式所涉及的产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌为能表达编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因、编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因。
本发明中，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为酿酒酵母。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述宿主菌为酿酒酵母BY4741。
本发明中对表达质粒的种类没有特殊要求，可根据宿主的选择进行相应的调整，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因和表达载体经过酶切处理后连接，之后不再赘述。
在一些具体优选的实施例中，大肠杆菌菌株Trans10(购买自全式金生物科技有限公司)用于载体构建，酿酒酵母BY4741(本实验室保存)则作为发酵菌株。
在一些具体优选例子中，利用密码子优化后的基因Ubic、Bsmt、Bsmt1、Bsmt2构建基因工程菌，密码子优化后的Ubic、Bsmt、Bsmt1、Bsmt2基因序列如SEQ No.2、4、6、8所示用于构建重组质粒的相关引物如表1所示。
表1构建重组质粒的相关引物
本发明利用上述实施方式调控碳代谢流向，从而达到调控对羟基苯甲酸甲酯合成的目的，并获得一种的产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌；
本发明采用酿酒酵母为宿主细胞，通过导入编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因、编码苯甲酸羧甲基转移酶的基因，成功构建了一种的新的产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌。
本发明所涉及的如本发明上述的基因工程菌在生产对羟基苯甲酸甲酯的应用，可以理解为利用本发明上述的基因工程菌生产对羟基苯甲酸甲酯的方法。
根据本发明，所述应用包括将产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得对羟基苯甲酸甲酯。
在本发明的一些实施例中，将产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌接入发酵培养基进行发酵培养包括：将产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌接入发酵培养基，200rpm下进行发酵培养，发酵温度为30℃，培养120小时，获得发酵培养液；
在本发明的一些实施方式中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
步骤S1，向发酵培养液加入等量乙酸乙酯，进行第Ⅰ次离心分离，获得第Ⅰ上清液；
步骤S2，将上层有机相取出，旋蒸后加入甲醇，进行第Ⅱ次离心分离，获得第Ⅱ上清液；
步骤S3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液，获得对羟基苯甲酸甲酯。
本发明中对于发酵培养基没有特别的限定，只要是用于酿酒酵母的发酵培养基即可，优选地，SC-Ura的培养基配方为Yeast Nitrogen base(YNB)1.7g/L，硫酸铵5g/L，氨基酸混合物(缺Ura，His，Leu)1.655g/L，His 0.086g/L，Leu 0.173g/L，20％葡萄糖溶液；其中氨基酸混合物(缺Ura，His，Leu)的成分如下表2所示。
表2氨基酸混合物
Ⅲ、实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。实施例1：
本实施例中所用到的引物如前文中表1所示。
委托华大基因对来源于大肠杆菌编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic(GenBank:AAA24716.1，密码子优化后的核酸序列为SEQ No.2所示)，来源于澳大利亚烟草的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt(GenBank:CAF31508.1，密码子优化后的核苷酸序列如SEQ No.4所示)，来源于拟南芥的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1(GenBank：AAP57210.1，密码子优化后的核苷酸序列如SEQ No.6所示，来源于矮牵牛的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2(GenBank：AAO45013.1，密码子优化后的核苷酸序列如SEQNo.8所示)进行全基因合成，分别获得携带有Ubic基因、Bsmt基因、Bsmt1和Bsmt2基因的pUC57质粒(pUC57-Ubic、pUC57-Bsmt、pUC57-Bsmt1、pUC57-Bsmt2),此处所述的所有基因均为密码子优化后的基因)。分别利用Ubic-F/Ubic-R、Bsmt-F/Bsmt-R、Bsmt1/Bsmt1-R和Bsmt2-F/Bsmt2-R作为引物，以pUC57-Ubic、pUC57-Bsmt、pUC57-Bsmt1和pUC57-Bsmt2作为模板，进行目的基因Ubic、Bsmt、Bsmt1和Bsmt2的扩增。接着用相应的限制性内切酶对载体进行酶切，将酶切后的片段进行切胶回收，之后通过Gibson连接的方法将Ubic目的基因分别与Bsmt、Bsmt1和Bsmt2目的基因构建到酿酒酵母-大肠杆菌表达载体PSPGM1中，获得质粒PSP-1、PSP-2、PSP-3(见表3)。
表3实验所用质粒和菌株
实施例2：
制备酿酒酵母BY4741的感受态，方法如下：
(1)用50ml管，挑取单克隆培养酿酒酵母到撑有5mlYPD的管中，30℃，200rpm，过夜摇菌。
(2)用250ml摇瓶，将过夜菌液转接到50mlYPD中，稀释至OD600值至0.3，然后30℃下复苏5h，直到OD600长到1.6(不要超过1.6)。
(3)收集酵母至50ml管中，在4℃，3000rpm下，离心3min。
(4)用20ml无菌水洗细胞。
(5)用20ml山梨醇洗细胞。
(6)用16ml 1M山梨醇，2ml 10xTE,2ml 1M LioAc重悬细胞。
(7)放入摇床，30℃，200rpm，摇30min。
(8)加入200μl 1M DTT，放入摇床，30℃，200rpm，摇15min。
(9)收集酵母细胞，在4℃，3000rpm下，离心3min。
(10)用20ml山梨醇洗两次。
(11)离心后尽量将所有液体移除，用400μl山梨醇重悬细胞，在冰上分装感受态。分装后置于-80℃冰箱中进行保存。
2、利用电转的方法将构建好的载体转入酿酒酵母感受态中。电转的过程：
(1)将50ul悬浮酵母细胞和已制备的DNA(100ng*2)轻轻混合在预冷的电孔试管(0.2cm间隙，绿色盖)中。
(2)在电转仪中选择程序2，电压为1.5kV,电转后，立即加入1mL山梨糖醇。
(3)将电转后的细胞转移到6mL的1:1混合1M山梨醇和YPD到50mL离心管中。
(4)将离心管中的混合物放置在30℃摇床中复苏1小时。
(5)离心收集细胞，用1ml水重悬，吸取100在SD-ura平板涂布。
制备成生产对羟基苯甲酸甲酯的菌株BY-1、BY-1、BY-3(见表3)。
实施例3：
(1)产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌株的摇瓶培养
在生产对羟基苯甲酸甲酯的菌株BY-1、BY-2、BY-3的平板上挑取单菌落纯化，两天后，接到5mL的液体SC-ura培养基中，30℃下培养12h，之后将种子液按初始菌液OD为0.01转接到30mL的SC-Ura培养基(YNB1.7g/L，硫酸铵5g/L，氨基酸混合物1.655g/L，His 0.086g/L，Leu 0.173g/L，20％葡萄糖溶液，116℃灭菌25min)中，转速为200rpm，培养时间为120h。
(2)生物量测定
取发酵液加入适量无菌蒸馏水稀释至OD600位于0.2-0.8之间，取200μL稀释后的发酵液至于96孔板中，利用酶标仪(Multiskan Spectrum，Thermo)在600nm波长下进行吸光度测定。
(3)样品处理与检测
将上述发酵液每隔24小时取500微升发酵液样品，向发酵培养液加入等量乙酸乙酯，12000rpm，离心15分钟，将上层有机相取出，旋蒸后加入甲醇，进行第2次离心分离，获得上清液，用0.22μm的有机相滤膜过滤第2次上清液进入液相小瓶。之后利用气相色谱-质谱联用(7890B-5977A，Agilent Technologies)进行产物鉴定，利用液相色谱-质谱联用(QTRAP 5500，AB SCIEX)或者高效液相色谱仪(UltiMate 3000，Thermo)进行定量检测，最终检测结果如图2和图3所示。根据GC-MS质谱与图谱的检索分析，可以确定已成功在酿酒酵母菌株中合成对羟基苯甲酸甲酯。根据重组菌株发酵结果图明显发现，在不引入丙酮酸裂合酶和苯甲酸羧甲基转移酶的对照菌株，没有检测到目标产物的生成，说明原始酿酒酵母BY4741不具有生物合成对羟基苯甲酸甲酯的内源合成途径。引入来源于澳大利亚烟草Bsmt的菌株BY-1产量要高于来源于拟南芥Bsmt1和矮牵牛Bsmt2所产生对羟基苯甲酸甲酯的含量，产量大约达到3.9mg/L，这也是在现有的生物合成技术中，首次在酿酒酵母中生物合成对羟基苯甲酸甲酯。
应当注意的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌及其应用
<130> RB2200811-FF
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> （编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic）
<400> 1
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<213> （经过密码子优化的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic）
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cgttctgaag aaattgtctc taatggacgt atggttctca ccttcatcgg aagaaacact 720
cttaacgatc cattgtatag agattgttgt cacttttgga cattgctatc aaactctctc 780
cgtgacctag tctttgaggg tcttgtgagt gagtcaaagc tggacgcatt caacatgccg 840
ttttatgatc cgaacgtaca agaactcaaa gaagtgatac aaaaagaggg ctcttttgaa 900
atcaatgaat tggagtcaca tggatttgat cttggtcact actacgaaga agatgacttt 960
gaagcaggac gcaatgaagc taatggcata agagctgtta gtgaaccaat gctcattgct 1020
cattttggag aagaaattat cgataccttg ttcgataagt atgcatacca tgtgactcaa 1080
catgccaact gcaggaacaa aacgactgtc agtcttgtcg tttccttgac taagaagtaa 1140
<210> 6
<211> 1140
<212> DNA
<213> （经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1）
<400> 6
atggatccaa gattcattaa cactattcca tctttgagat atgatgatga taaatgtgat 60
gatgaatacg ctttcgttaa ggctttgtgt atgtctggtg gtgacggtgc taattcttac 120
tctgctaatt ctagattgca aaagaaggtt ttgtctatgg ctaagccagt tttagttaga 180
aacactgaag aaatgatgat gaacttagat ttcccaacat acattaaggt cgctgaatta 240
ggttgttctt ccggtcaaaa ctctttctta gctatctttg aaattattaa cactattaac 300
gttttgtgtc aacacgttaa taagaactct cctgaaattg attgttgttt gaatgacttg 360
ccagaaaatg attttaatac cacttttaaa ttcgttccat tctttaacaa ggaattgatg 420
attactaaca agagttcttg ttttgtttac ggtgccccag gttccttcta ctctcgtttg 480
ttctctagaa actctttgca cttgattcat tcttcatacg ctttgcactg gttatctaag 540
gttccagaaa agttggaaaa caacaagggt aatttgtaca ttacttcatc ttctccacaa 600
tctgcttaca aggcttactt gaatcaattc caaaaagatt tcactatgtt cttgagattg 660
agatctgaag aaattgtttc taacggtaga atggttttaa ctttcattgg tagaaacact 720
ttaaacgacc cattgtacag agattgttgt catttttgga ctttgttgtc taactctttg 780
agagatttgg tttttgaagg tttggtttct gaatctaagt tggatgcttt taacatgcca 840
ttctacgatc caaacgttca agaattgaag gaagttatcc aaaaagaagg ttcttttgaa 900
attaacgaat tagaatctca tggttttgat ttgggtcact actacgaaga agatgatttc 960
gaagctggta gaaacgaagc taacggtatt agagctgtct ctgaaccaat gttgattgcc 1020
catttcggtg aagaaattat tgatactttg ttcgacaagt acgcttatca tgttactcaa 1080
catgctaact gtagaaacaa gaccactgtt tctttggttg tttctttgac taagaagtaa 1140
<210> 7
<211> 1074
<212> DNA
<213> （编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2）
<400> 7
atggaagttg ttgaagttct tcacatgaat ggaggaaatg gagacagtag ctatgcaaac 60
aattctttgg ttcagcaaaa ggtgattctc atgacaaagc caataactga gcaagccatg 120
attgatctct acagcagcct ctttccagaa accttatgca ttgcagattt gggttgttct 180
ttgggagcta acactttctt ggtggtctca cagcttgtta aaatagtaga aaaagaacga 240
aaaaagcatg gttttaagtc tccagagttt tattttcact tcaatgatct tcctggcaat 300
gattttaata cactttttca gtcactgggg gcatttcaag aagatttgag aaagcatata 360
ggggaaagct ttggtccatg ttttttcagt ggagtgcctg gttcatttta tactagactt 420
ttcccttcca aaagtttaca ttttgtttac tcctcctaca gtctcatgtg gctatctcag 480
gtgcctaatg ggattgaaaa taacaaggga aacatttaca tggcaagaac aagccctcta 540
agtgttatta aagcatacta caagcaatat gaaatagatt tttcaaattt tctcaagtac 600
cgttcagagg aattgatgaa aggtggaaag atggtgttaa cactcctagg tagagaaagt 660
gaggatccta ctagcaaaga atgctgttac atttgggagc ttctagccat ggccctcaat 720
aagttggttg aagagggatt gataaaagaa gagaaagtag atgcattcaa tattcctcaa 780
tacacaccat caccagcaga agtaaagtac atagttgaga aggaaggatc attcaccatt 840
aatcgcttgg aaacatcaag agttcattgg aatgcttcta ataatgagaa gaatggtggt 900
tacaatgtgt caaggtgcat gagagctgtg gctgagcctt tgcttgtcag ccactttgac 960
aaggaattga tggatttagt gttccacaag tacgaagaga ttatttctga ttgcatgtcc 1020
aaagagaaga ccgagtttat aaatgtcatt gtctctttga ccaaaataaa ttga 1074
<210> 8
<211> 1074
<212> DNA
<213> （经过密码子优化的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt2）
<400> 8
atggaagttg ttgaggtctt gcatatgaat ggtggtaatg gtgattcttc ttatgctaat 60
aattctttgg tgcagcagaa ggtcattttg atgactaagc caattactga gcaggctatg 120
attgacttgt attcttcttt gtttccagag actttgtgca ttgctgattt gggttgttct 180
ttgggtgcta atactttctt ggttgtctct cagttggtta agattgtcga aaaggaaagg 240
aaaaagcacg gttttaaatc tccagagttc tatttccatt tcaacgattt gccaggtaac 300
gattttaata ctttgttcca gtctttgggt gctttccagg aagatttgag aaaacatatt 360
ggtgagtctt tcggtccatg tttcttttct ggtgtcccag gttcttttta tactagattg 420
tttccatcta agtctttgca cttcgtctat tcttcttatt ctttgatgtg gttgtctcag 480
gttccaaatg gtattgaaaa taacaagggt aacatttaca tggctaggac ttctccattg 540
tctgtcatta aagcttacta taagcagtac gagattgact tttctaactt cttgaagtat 600
aggtccgagg agttgatgaa aggtggtaaa atggttttga ctttgttggg tagagaatcc 660
gaagatccaa cttctaaaga atgctgttac atttgggaat tgttggccat ggctttgaat 720
aaattggtcg aagaaggttt gattaaggag gaaaaagtcg acgcttttaa tattccccaa 780
tatactccct ctccagctga agttaaatat attgtcgaaa aggagggttc tttcactatt 840
aataggttgg aaacttctag agtccactgg aatgcttcta ataacgagaa aaatggtggt 900
tacaacgtat ctaggtgcat gagagctgtt gctgaaccat tgttggtttc tcattttgat 960
aaagagttga tggacttggt cttccacaag tatgaggaaa ttatttctga ctgcatgtct 1020
aaggagaaaa ccgaatttat taatgtcatt gtctctttga ctaagattaa ctga 1074
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> （引物Ubic-F）
<400> 9
atgtctcatc cagctttgac tc 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> （引物Ubic-R）
<400> 10
ttagtacaat ggagaagctg gcaag 25
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-F）
<400> 11
aaggaaaaaa gcggccgcat ggaagttgct aaggttttgc 40
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-R）
<400> 12
ccttaattaa ttagttagtc ttagtcaagg agacaac 37
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-1-F）
<400> 13
cgggatccat ggaagttgct aaggttttgc a 31
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-1-R）
<400> 14
ccgctcgagt tagttagtct tagtcaagga gacaacaacg 40
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-2-F）
<400> 15
tctggcgaag aattgttaat taatcagtta atcttagtca aagagacaat g 51
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> （引物Bsmt-2-R）
<400> 16
tctaagtttt aattacaagc ggccgcatgg aagttgttga ggtcttg 47
Claims (5)
1.一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌，其为携带有PSP-1质粒的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4141菌株BY-1、携带有PSP-2质粒的酿酒酵母BY4141菌株BY-2和携带有PSP-3质粒的酿酒酵母BY4141菌株BY-3；
其中，PSP-1质粒携带密码子优化后的序列如SEQ ID NO.2所示的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic和密码子优化后的序列如SEQ ID NO.4所示的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt；
PSP-2质粒携带密码子优化后的序列如SEQ ID NO.2所示的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic和密码子优化后的序列如SEQ ID NO.6所示的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1；
PSP-3质粒携带密码子优化后的序列如SEQ ID NO.2所示的编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因Ubic和密码子优化后的序列如SEQ ID NO.8所示的编码苯甲酸/水杨酸羧甲基转移酶的基因Bsmt1。
2.如权利要求1所述的基因工程菌在生产对羟基苯甲酸甲酯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括将产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得对羟基苯甲酸甲酯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为：发酵培养时间为120小时，发酵温度为30℃。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，对所获得的发酵培养液进行分离纯化，所述分离纯化步骤包括：
步骤S1，向发酵培养液中加入等量乙酸乙酯，进行第一次离心分离，获得第一上清液；
步骤S2，将上层有机相取出，旋蒸后加入甲醇，进行第二次离心分离，获得第二上清液；
步骤S3，用0.22 μm的有机相滤膜过滤第二上清液，获得对羟基苯甲酸甲酯。
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| CN112375723A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-02-19 | 北京化工大学 | 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用 |
| CN112646761A (zh) * | 2019-10-12 | 2021-04-13 | 北京化工大学 | 生产β-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用 |
-
2022
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