CN112375723A - 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用涉及生物工程技术领域。本发明提供了一种生产马来酸的工程菌，包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、水杨酸‑5‑羟化酶、马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸裂解酶的基因。上述工程菌还包括在所述宿主内过表达编码莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶、转酮酶A的基因来实现马来酸的增产。本发明还提供一种上述生产马来酸的工程菌的构建方法和应用。利用上述生产马来酸的工程菌，以葡萄糖和/或甘油等碳源来生产马来酸，实现了马来酸的从头合成。

Description

生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
马来酸又名顺丁烯二酸，外观为单斜晶系无色结晶。它在食品、医药、化妆品、材料等方面有着较广泛的应用。目前它的主要用途是合成不饱和聚酯树脂，另外，它还可以作为原料生产酒石酸、琥珀酸、富马酸等化合物，同时，它还可以作为食品调味剂，广泛地被用作饮料的酸味剂。
马来酸有着广阔的市场前景。马来酸加热到135℃即可得到马来酸酐，在 2007年，马来酸酐的全球市场就已经达到了1807000吨，而根据预测，在2023 年，马来酸酐的全球市场将达到220万吨。
目前马来酸的工业生产100％采用化学法，主要是正丁烷氧化法、芳香苯氧化法和不饱和烯烃氧化法等，采用的原料都是不可再生能源，且化学法生产不可避免地会造成一定程度的环境污染问题。
发明内容
有鉴于此，本发明确有必要提供一种生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。
所以，本发明的第一个目的是从大量生物或微生物体内能够合成马来酸的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现马来酸的异源合成。为此，本发明优选了来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的酶的相关基因，通过这些酶的表达，利用简单碳源实现了马来酸的生物合成。
本发明的第二个目的在于提供高产马来酸的宿主，通过向原始或改造过的细菌、真菌、酵母中导入一条高效生产马来酸的途径来生物合成马来酸。
本发明的第三个目的在于通过抑制竞争途径、模块优化等一系列代谢调控方式来提高马来酸的产量。实验结果表明，在正常条件下，代谢工程改造菌利用葡萄糖、甘油等简单碳源来生产马来酸，能达到53±6mg/L的产量，而在经过优化后，利用简单碳源的代谢工程菌能达到2.35±0.02g/L的最终产量。
本发明涉及异源生物合成马来酸的代谢途径，通过增强上游分支酸合成途径酶的表达，优选来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的外源酶，选用原始或改造过的细菌、酵母、真菌作为宿主细胞，成功实现了马来酸的生产。
为了实现上述目的，本发明提供一种生产马来酸的工程菌，包括：在宿主内共表达编码异分支酸合成酶(EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)、水杨酸5-羟化酶(NagAaGHAb)、马来酰丙酮酸异构酶(Mps)和马来酰丙酮酸裂解酶(Hbzf)的基因。
其中，所述宿主为细菌、酵母或真菌，其中，所述细菌或真菌为原始的或改造过的。优选地，所述宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母或黑曲霉。
基于上述生产马来酸的工程菌，还包括在所述宿主内过表达编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶(tktA)、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶 (AroGfbr)的基因。
基于上述生产马来酸的工程菌，还包括在所述宿主内同时敲除了编码 pheA、tyrA、pykA和pykF的基因
基于上述生产马来酸的工程菌，还包括在所述宿主基因组内整合了编码 EntC和PchB的基因
本发明还提供了一种上述生产马来酸的工程菌的构建方法，包括步骤：
重组表达质粒将编码异分支酸合成酶(EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶 (PchB)、水杨酸-5-羟化酶(NagAaGHAb)、马来酰丙酮酸异构酶(Mps)和马来酰丙酮酸裂解酶(Hbzf)的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；
构建工程菌将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到生产马来酸的工程菌。
其中，所述表达质粒可以为pZE12-luc、pCS27。
基于上述生产马来酸的工程菌的构建方法，还包括采用Red重组的方法敲除pheA、tyrA、pykA和pykF基因，采用Red重组的方法在宿主菌基因组内源整合编码EntC和PchB的基因，替换AroG基因启动子为T7启动子，获得敲除pheA、tyrA、pykA和pykF基因，内源整合EntC和PchB基因的工程菌株。
基于上述生产马来酸的工程菌的构建方法，还包括采用低拷贝质粒共表达编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶(tktA)、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(AroGfbr)的基因。
本发明还提供一种生产马来酸的工程菌的应用，其中，按照体积比2％的接种量，将上述工程菌接种到培养基中，并加入诱导剂，在30℃进行发酵处理，制得马来酸；所述培养基中的碳源为葡萄糖、甘油或两者的组合。
基于上述，所述培养基包括：2g·L-1MOPS(3-吗啉丙磺酸)，5g·L-1葡萄糖，30g·L-1甘油，7g·L-1酵母粉，3g·L-1蛋白胨，17.1g·L-1Na2HPO4·12H20， 0.5g·L-1NaCl，3g·L- 1KH2PO4，1g·L-1NH4Cl，245mg·L-1MgSO4，15mg·L-1 CaCl2，其余部分用去离子水补充。优选地，葡萄糖和甘油的比例为(1～3):1，更优选地，葡萄糖和甘油的比例为2:1。
因此，如图1所示，本发明提供的上述生产马来酸的工程菌在以葡萄糖和/或甘油为碳源的发酵培养过程中，其中的葡萄糖和/或甘油经过生物酶解并在异分支酸合成酶(EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)和水杨酸5-羟化酶(NagAaGHAb)的作用下，转化为2,5-二羟基苯甲酸(缩写2,5-DHBA)， 2,5-DHBA在马来酰丙酮酸异构酶(maleylpyruvateisomerase)的作用下转化为马来酰丙酮酸(MP)，MP在马来酰丙酮酸裂解酶(Maleylpyruvate lyase) 的作用下转化为马来酸(Maleate)，从而实现由葡萄糖和/或甘油从头合成马来酸。
进一步，本发明提供的上述生产马来酸的工程菌通过中拷贝质粒过表达编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶(tktA)、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(AroGfbr)，实现通过加强上游中间产物生成的方式提高利用上述工程菌生产马来酸的产量；
进一步，本发明提供的上述生产马来酸的工程菌中敲除了利用分支酸的竞争途径中的pheA和tyrA，整合了EntC和PchB的基因，通过抑制竞争途径并加强自身途径的方法提高上述工程菌生产马来酸的产量。
进一步，本发明提供的上述生产马来酸的工程菌中敲除了利用PEP的竞争途径中的pykA和pykF，通过进一步抑制竞争途径并加强自身途径的方法提高上述工程菌生产马来酸的产量；最终达到2.3g/L的马来酸重产量。
因此，通过筛选出在体外具有活性的酶，获得本发明提供的上述生产马来酸的工程菌；以该工程菌为基础，设计出如图1所示的马来酸的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现以葡萄糖、甘油等简单碳源为原料采用生物方法高效合成马来酸。
附图说明
图1是本发明提供的生物合成马来酸的路径图。
图2是本发明实施例3提供的工程菌BW1生产马来酸的发酵结果图。
图3是实施例3提供的菌株发酵产物及马来酸标品的HPLC检测结果图。
图4是本发明实施例4提供的工程菌BW2生产马来酸的发酵结果图。
图5是本发明实施例5提供的工程菌BW3生产马来酸的发酵结果图。
图6是实施例6提供的工程菌BW4生产马来酸的发酵结果图。
图7是实施例7提供的工程菌BW5生产马来酸的发酵结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，之后不再赘述。
以下实施实施例中，大肠杆菌菌株BW25113,DH5α和BL21(DE3)均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中DH5α用于载体构建，BL21(DE3) 用于蛋白表达，BW25113作为发酵用菌株。其中，各实施例中采用的质粒和菌株见后续表1所示。
实施例1
重组质粒pZE-NagAaGHAb，pCS-EP-Mps-Hbzf
本实施例提供的重组质粒pZE-NagAaGHAb，主要是将基因 NagAaGHAb连接至大肠杆菌表达载体pZE12-luc获得。pCS-EP-Mps-Hbzf 主要是将基因EntC、PchB、Mps、Hbzf连接至大肠杆菌表达载体pCS27获得。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的编码异分支酸合成酶(EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)、水杨酸-5-羟化酶(NagAaGHAb)、马来酰丙酮酸异构酶 (Mps)和马来酰丙酮酸裂解酶(Hbzf)的基因。通过将编码异分支酸合成酶 (EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)、水杨酸-5-羟化酶(NagAaGHAb)、马来酰丙酮酸异构酶(Mps)和马来酰丙酮酸裂解酶(Hbzf)的目的基因进行PCR扩增获得目的片段后，接着用片段中对应的限制性内切酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pZE12-luc 和pCS27上，获得pZE-NagAaGHAb，pCS-EP-Mps-Hbzf重组质粒。
实施例2
生产马来酸的工程菌：重组大肠杆菌BW1
本发明提供的生产马来酸的工程菌对用于构建表达质粒的宿主菌株种类没有特殊要求，本发明实施例采用了BW25113(F’)菌株作为构建质粒的初始宿主。
首先挑取新鲜的BW25113(F’)菌落接种到4mL LB培养基中，37℃培养 8～12h后，取1mL接种到100mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6 时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10mL预冷至4℃的 10％甘油溶液(质量比，下同)洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入300μL 10％甘油溶液重悬细胞，制得感受态细胞。取90μL感受态加入2μL重组质粒pZE-NagAaGHAb， 4μL重组质粒pCS-EP-Mps-Hbzf，冰上放置两分钟，电转后加入600μL LB 培养基，洗出电转后细胞，37℃复苏1h，涂布到氨苄和卡那抗性平板，于 37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有氨苄和卡那抗性的4mL LB培养基中37℃培养8～10h，即可获得生产马来酸的工程菌：含有重组质粒pZE-NagAaGHAb，pCS-EP-Mps-Hbzf的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌BW1表示。
实施例3
重组大肠杆菌BW1的应用：通过发酵培养生产马来酸
在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW1工程单菌落接种到4mL含有氨苄和卡那的LB试管中，37℃培养8h后，转入含有氨苄和卡那的50mL培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为体积比2％，发酵温度30℃或37℃，转速200rpm。其中，所述培养基：2g·L-1MOPS，20g·L-1葡萄糖，10g·L-1甘油，5g·L-1酵母粉，6g·L-1NaHPO4，0.5g·L-1NaCl，3g·L-1KH2PO4，2g·L-1 NH4Cl，246.5mg·L-1MgSO4，14.7mg·L-1CaCl2，并加入氨苄青霉素和卡那霉素。
发酵初始加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，发酵每隔12h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物马来酸的产量，结果如图2所示。
采用HPLC分析方法对目标产物马来酸进行检测，检测条件如下：
色谱柱：分离柱：Diamonsil C18，ID 5μm，250×4.6mm；
流动相：A为甲醇，B为50mM磷酸溶液，柱温40℃，流速1mL/min 检测波长为210nm。梯度洗脱程序如下表所示：
Figure BDA0002728891630000061
Figure BDA0002728891630000071
取样品上述发酵液700μL，过滤膜，取过膜后液体采用上述方法进行 HPLC分析，分析结果如图3中的图3B所示。采用上述方法取含有马来酸的标品水溶液进行HPLC分析，分析结果如图3中的图3A所示，图3A为标准图。从图3A中可以看出：马来酸的特征峰保留时间为5.1min(5.135min)左右；从图3B中可以看出在5.1min(5.111min)左右也有一个特征峰，由此可以判断图3B中保留时间为5.111min的特征峰为马来酸，因此，本实施例提供的方法可以制备出马来酸。
实施例4
生产马来酸的工程菌-重组大肠杆菌BW2及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW3通过加强上游中间代谢产物生产获得。具体地，优选来源于大肠杆菌，编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶(tktA)、 3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(AroGfbr)的基因，将其整合入上述中拷贝质粒 pCS-EP-Hbzf-Mps中，形成质粒pCS-APTA-EP-Hbzf-Mps。将构建好的质粒与 pZE-NagAaGHAb一同电转入大肠杆菌BW25113中，形成重组大肠杆菌菌株 BW2。
重组大肠杆菌BW2的应用：参照实施例3，将上述重组大肠杆菌菌株BW2 在所述培养基中，在发酵每隔12h取样1mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图4所示。
实施例5
生产马来酸的工程菌-重组大肠杆菌BW3及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW3通过在BW2基础上强化水杨酸合成途径获得，具体地，通过对BW3菌株的产物合成情况以及代谢分析后决定内源整合编码异分支酸合成酶(EntC)、异分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)和T7RNA聚合酶 (T7RNAp)的基因，获得重组大肠杆菌菌株BW3。
具体地，首先挑取新鲜的BW25113菌落接种到4mL LB培养基中，37℃培养8～12h后，取1mL接种到100mL LB培养基中，37℃培养至OD600 长到0.6时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10mL预冷至4℃的10％甘油溶液洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入300μL 10％甘油溶液重悬细胞，制得感受态细胞。取90μL感受态加入2μL pKD46质粒，冰上放置两分钟，电转后加入600μL LB培养基，洗出电转后细胞，30℃复苏1h，涂布到氨苄抗性平板。之后以pKD4质粒PCR扩增得到带有同源臂的卡那片段，以pZE-T7RNAp 质粒为模板，PCR扩增得到带有同源臂的T7RNAp片段，最后通过Overlap PCR手段将带有同源臂的卡那片段与带有同源的T7RNAp片段进行连接，回收进行纯化。挑取单菌落接入氨苄抗性试管8～12h后，转接100mL LB摇瓶 30℃培养；OD600长到0.2后，添加终浓度为100mM的阿拉伯糖诱导；待摇瓶中的OD600长到0.6时，开始制备电转感受态细胞，取90μL感受态加入5 μL带同源臂的PCR片段，电转后，37℃复苏90min，涂布于卡那抗性平板，过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入卡那抗性的试管中，37℃培养8～12h后进行菌落PCR验证，确保卡那片段替换掉目的基因。最后，向上一步正确的菌转入pCP20载体，涂布于氨苄和氯霉素混合的抗性平板中， 30℃过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入氨苄和氯霉素混合的抗性的试管中30℃培养8～12h，后转接到无抗性的LB试管中，42℃培养 24h消除卡那抗性，再划线到无抗性平板，挑取单菌落接种到无抗性LB试管中，再分别转接到无抗性，氨苄抗性，卡那抗性和氨苄和氯霉素混合的抗性试管中，用以验证pKD46、pCP20是否丢失，卡那抗性是否消除。确定在以上两种抗性中均不生长后，保存于冻存管，并进一步菌落PCR验证。此过程得到菌株BW PLlacO1-T7RNAp::pta/ackA，该菌株中整合了T7RNA聚合酶基因。
采用与上述同样的Red重组方法，以BW PLlacO1-T7RNAp::pta/ackA为出发菌株，以实施例1中构建的pCS-EP-Hbzf-Mps为模板继续整合EntC基因和 PchB基因，得到重组大肠杆菌菌株BW PT7-EP::tnaA。之后将实施例4构建好的重组质粒pCS-APTA-EP-Hbzf-Mps和实施例1构建好的pZE-NagAaGHAb 的重组质粒参照实施例2提供的方法转入大肠杆菌BWPT7-EP::tnaA中，获得生产马来酸的重组大肠杆菌BW3。
重组大肠杆菌BW3的应用：参照实施例3，将上述重组大肠杆菌菌株BW3 在所述培养基中，在发酵每隔12h取样1mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图5所示。
实施例6
生产马来酸的工程菌：重组大肠杆菌BW4及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW4通过敲除上游竞争途径获得，具体地，在经过系统的筛选后决定敲除来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的芳香族氨基酸合成路径中会与水杨酸生产途径进行反应物竞争的pheA和tyrA。本发明提供采用 Red重组技术从宿主菌BW3中上敲除pheA和tyrA基因，获得重组大肠杆菌 BW4。
具体地，首先挑取新鲜的BW PT7-EP::tnaA菌落接种到4mL LB培养基中， 37℃培养8～12h后，取1mL接种到100mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10mL 10％预冷的甘油洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入300μL 10％甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取 90μL感受态加入2μL pKD46质粒，冰上放置两分钟，电转后加入600μL LB 培养基，洗出电转后细胞，30℃复苏1h，涂布到氨苄抗性平板。之后以pKD4 质粒为模板，PCR扩增得到带有同源臂的敲除片段，回收进行纯化。挑取单菌落接入氨苄抗性试管8～12h后，转接100mL LB摇瓶30℃培养；OD600长到0.2后，添加终浓度为100mM的阿拉伯糖诱导；待摇瓶中的OD600D长到0.6时，开始制备电转感受态细胞，取90μL感受态加入5μL带同源臂的 PCR片段，电转后，37℃复苏90min，涂布于卡那抗性平板，过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入卡那抗性的试管中，37℃培养8～12h 后进行菌落PCR验证，确保kan片段替换掉目的基因。最后，向上一步正确的菌转入pCP20载体，涂布于氨苄和氯霉素混合的抗性平板中，30℃过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入氨苄和氯霉素混合的抗性的试管中30℃培养8～12h，后转接到无抗性的LB试管中，42℃培养24h左右进行消除卡那抗性，再划线到无抗性平板，挑取单菌落接种到无抗性LB试管中，再分别转接到无抗性，氨苄抗性，卡那抗性和氨苄和氯霉素混合的抗性试管中，用以验证pKD46、pCP20是否丢失，卡那抗性是否消除。确定在以上两种抗性中均不生长后，保存于冻存管，并进一步菌落PCR验证。此过程得到菌株BWΔpheA，该菌株中敲除了pheA基因。
采用与上述同样的Red同源重组法，以菌株BW PT7-EP::tnaAΔpheA为出发菌株，继续敲除tyrA基因，得到大肠杆菌菌株BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrA。之后将实施例4构建好的重组质粒pCS-APTA-EP-Hbzf-Mps和实施例1构建好的pZE-NagAaGHAb的重组质粒参照实施例2提供的方法转入大肠杆菌BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrA中，获得生产马来酸的工程菌：重组大肠杆菌BW3。
重组大肠杆菌BW3的应用：参照实施例3，将上述重组大肠杆菌菌株BW3 在所述培养基中，在发酵每隔12h取样1mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图6所示。
实施例7
生产马来酸的工程菌：重组大肠杆菌BW5及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW5通过在BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrA的基础上进一步敲除上游途径和增强自身途径获得。通过对BW4的产物合成情况分析，决定敲除来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成路径中会与PEP生产途径进行反应物竞争的pykA和pykF，形成重组大肠杆菌菌株BW5。
具体地，参照实施例5，以BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrA为出发菌株，通过Red重组手段对pykA，pykF进行敲除，获得重组大肠杆菌菌株BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrAΔpykAΔpykF。形成马来酸生产工程菌：重组大肠杆菌菌株BW PT7-EP::tnaAΔpheAΔtyrAΔpykAΔpykF。之后将实施例4构建好的重组质粒pCS-APTA-EP-Hbzf-Mps和实施例1构建好的pZE-NagAaGHAb的重组质粒参照实施例2提供的方法转入大肠杆菌BW PT7-EP::tnaA ΔpheAΔtyrAΔpykAΔpykF中，获得生产马来酸的重组大肠杆菌BW5。
重组大肠杆菌BW5的应用：所述培养基为：2g·L-1MOPS(3-吗啉丙磺酸)， 5g·L-1葡萄糖，30g·L-1甘油，7g·L-1酵母粉，3g·L-1蛋白胨，17.1g·L-1 Na2HPO4·12H20，0.5g·L-1NaCl，3g·L-1KH2PO4，1g·L-1NH4Cl，245mg·L-1 MgSO4，15mg·L-1CaCl2，其余部分用去离子水补充，具体发酵培养参照实施例3。将上述重组大肠杆菌菌株BW5在所述培养基中，在发酵每隔12h取样 1mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图7所示。
表1本发明各实施例中使用的质粒和菌株列表
Figure BDA0002728891630000121
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (9)

1.一种生产马来酸的工程菌，其特征在于：包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、水杨酸-5-羟化酶、马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸裂解酶的基因。
2.根据权利要求1所述的生产马来酸的工程菌，其特征在于：还包括在所述宿主内同时敲除了编码pheA、tyrA、pykA和pykF的基因，在基因组内源整合了编码EntC和PchB的基因并用T7启动子控制表达。
3.根据权利要求1或2所述的生产马来酸的工程菌，其特征在于：还包括在所述宿主内过表达编码莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶和转酮酶A的基因。
4.构建如权利要求1所述的生产马来酸的工程菌的方法，其特征在于，包括步骤：
重组表达质粒
将编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、水杨酸5-羟化酶、马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸水解酶的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；
构建工程菌
将所述重组质粒载体转化到宿主中，得到生产马来酸的工程菌。
5.根据权利要求4所述的生产马来酸的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用Red重组的方法敲除pheA、tyrA、pykA和pykF基因，获得敲除pheA、tyrA、pykA和pykF基因的工程菌株。
6.根据权利要求5所述的生产马来酸的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用中拷贝质粒共表达编码莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶、转酮酶A的基因。
7.根据权利要求4所述的生产马来酸的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用高拷贝质粒表达水杨酸-5-羟化酶的基因，利用中拷贝质粒表达马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸水解酶的基因。
8.一种生产马来酸的工程菌的应用，其特征在于：按照体积比1％～2％的接种量，将权利要求1～3任一项所述的生产马来酸的工程菌接种到培养基中，并在菌株OD达到0.6时加入0.5mM诱导剂，在30℃进行发酵处理，制得马来酸；所述培养基中的碳源为葡萄糖、甘油或两者的组合。
9.根据权利要求8所述的生产马来酸的工程菌的应用，其特征在于：所述培养基包括2g·L-1MOPS(3-吗啉丙磺酸)，5g·L-1葡萄糖，30g·L-1甘油，7g·L-1酵母粉，3g·L-1蛋白胨，17.1g·L-1Na2HPO4·12H20，0.5g·L-1NaCl，3g·L-1KH2PO4，1g·L-1NH4Cl，245mg·L- 1MgSO4，15mg·L-1CaCl2，其余部分用去离子水补充。
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