JP4669613B2 - 生物学的触媒によるシキミ酸の合成 - Google Patents
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Description
【０００１】
＜後援＞
本発明についての研究は、一部、米国農務省第９５−３７５００−１９３０号及び米国国立科学財団第ＣＨＥ９６３３６８号補正００２の支援を受けている。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する場合がある。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、シキミ酸の生産に関するものであり、特に炭素源の生物学的変換によって、シキミ酸を生産する方法に関するものである。
【０００３】
＜発明の背景＞
シキミ酸は、高度に機能化された六個のメンバーからなる環状炭素と多数の非対称中心を持つ魅力的なキラルなシントンである。芳香族アミノ酸の代謝中間体であるシキミ酸は、インフルエンザの治療に効果的なニューラミニダーゼ阻害剤の合成における必須のキラルな出発材料である。Kim, C.U. et al. J.Am.Chem.Soc. 119:681 (1997);Rohloff, J.C. et al., J.Org.Chem. 63: 4545 (1998)。芳香族だけでなく、キラルな化学物質もまた、シキミ酸から合成され得る。例えば、酸が触媒するシキミ酸の脱水化によって、ｐ−ヒドロキシ安息香酸が生じる（Eykmann, J.F., Ber.Dtch.Chem.Ges., 24: 1278 (1891)）。ｐ−ヒドロキシ安息香酸は、年間７×１０６ｋｇの製造量があり、液体結晶ポリマー合成に使われるパラオキシ安息香酸エステル類とモノマーに対して、キーとなる前駆体である。シキミ酸は、最近、分子の大きな組み合わせライブラリーの合成にとっての出発点としてもまた、使われている。Tan, D.S., et al., J.Am.Chem.Soc. 120: 8565 (1998)。
【０００４】
シキミ酸は植物から、時間がかかる多段階の単離手段によって得られる。残念なことに、植物のオオウイキョウ（Illicium）の果実からのシキミ酸の単離（Haslem,E., Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites, Wiley & Sons, New York, pp40-42 (1993)）は、キログラム単位の合成における使用を除外している。
【０００５】
従って、多量のシキミ酸を製造する方法を提供することは望ましいだろう。もし、そんな方法が、安い出発材料を用いて、費用に対し効率がよかったら、それもまた望ましいだろう。その方法が無害の化合物を用い、環境に優しかったら、さらに望ましいだろう。
【０００６】
＜発明の概要＞
炭素源からシキミ酸を製造するための生物工学的合成スキームが提供されている。ある態様では、本発明の生物学的変換は、微生物によって触媒される炭素源のシキミ酸への変換を含む。図１の合成スキームで示されているように、本発明の微生物によって触媒される変換ステップは、組換え微生物によって提供される四つの酵素を必要とする。ある好ましい態様では、組換え微生物は、３−デヒドロシキミ酸をシキミ酸に還元し、芳香族アミノ酸生合成経路に沿ってシキミ酸をさらに変換することを阻害するように設計されている大腸菌である。
【０００７】
ここで提供されるシキミ酸の生物触媒的合成方法は、環境に優しく、経済的に魅力的で、出発材料として豊富に再生可能な原料を使用していると思われる。
【０００８】
本発明の更なる目的、利点、特徴は、添付された図とともに、以下の記述と添付の請求項から明らかになるだろう。
【０００９】
＜好適実施例の詳細な説明＞
ここでは、炭素源からシキミ酸を生産する生物工学的合成スキームが提供されている。合成スキームに基づいた炭素源からシキミ酸を生産する方法もまた、提供されている。
【００１０】
ある態様では、組換え微生物によって炭素源がシキミ酸に変換される方法が提供されている。微生物の一般的な芳香族アミノ酸生合成経路の操作によって、組換え微生物が炭素源の存在下で培養されたとき、かなりの量のシキミ酸を生産する。炭素源は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）に変換され、引き続いて、３−デヒドロキニン酸シンターゼによって、３−デヒドロキニン酸（ＤＨＱ）に変換され、それから３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼによって脱水化され、デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）になる（ｃ、図１）。３−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸脱水素酵素によってシキミ酸に変換される（ｄ、図１）。シキミ酸代謝は、シキミ酸キナーゼ活性を妨害したり阻害したりすることによって妨げられ（ｅ、ｆ、図１）、こうしてかなりの量のシキミ酸を蓄積させる。好ましい態様では、微生物はシキミ酸取り込みにおける変異（shiA）のため、培地からシキミ酸を再吸収することができないだろう。こうして、いったん形成されれば、シキミ酸はキニン酸や経路上の他の分子に変換され得ない。
【００１１】
本発明の生物学的変換方法は、炭素源からシキミ酸への最大限の変換を提供するため、時間、温度、ｐＨ、栄養源の種類、濃度の条件や、通気条件、及び制御された酸素濃度の下で、なされた。実施例で詳細に説明するが、好ましい態様では、バッチ式発酵器（fed-batch fermentor）が炭素源からシキミ酸に変換するのに使われ、その後イオン交換クロマトグラフィーによって発酵培地からシキミ酸が単離された。バッチ式発酵器の過程とクロマトグラフィーの技術は、当業者には既知である。
【００１２】
ここで用いる場合、「炭素源」という語句は、キシロース、アラビノース、グリセロール、グルコースと、クレブス回路の中間体（即ち、ジカルボン酸）を、単体で、あるいは複数で含むが、それらに制限されない炭素源由来のバイオマスを意味する。好ましい態様では、炭素源はグルコースである。炭素源は、以下の例に制限されるわけでないが、トウモロコシ、テンサイ、サトウキビのような再生可能な原料に由来してもよい。
【００１３】
他の態様では、本発明の方法で使用されている微生物は大腸菌である。好ましい態様では、大腸菌は、serA遺伝子座に挿入されたaroBカセットを含み、aroLとaroKの遺伝子座が破壊されている（e、f、図１）。この組換え大腸菌は、さらに、aroFFBR、aroE、serA遺伝子のインサートを持つプラスミドを含んでもよい。aroLとaroKにコードされるシキミ酸キナーゼのアイソザイムを欠くため、シキミ酸は蓄積するが、一方aroBの２番目のコピーが３−デヒドロキネートシンターゼの触媒活性を増加させる。Dell, K.A. et al., J.Am.Chem.Soc. 115: 11581 (1993)。好ましい態様では、組換え大腸菌は、aroFFBR、serA、aroEのインサートを持つプラスミドpKD12.112を含む。AroFFBR遺伝子のインサートは、芳香族アミノ酸やほかの芳香族分子によるフィードバック阻害に耐性の変異型３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼアイソザイム（a、図１）をコードする。このフィードバック阻害は、共通の芳香族アミノ酸の生合成経路に入る炭素の流れを増加させる。aroEの発現の結果生じるシキミ酸脱水素酵素の活性増幅がシキミ酸による酵素のフィードバック阻害を相補する。Pittard, J. et al., J.bacterial. 92: 1070 (1966); Brown, K.D. et al., Biochim. Biophys. Acta. 428: 550 (1976)。Ｌ−セリン生合成に必要な大腸菌ゲノム上のserA遺伝子座における変異のため、最少培地における増殖とプラスミド維持は、プラスミド上のserAの発現後に起きる。このように、プラスミド上serAインサートによって、微生物を識別して、最少培地での微生物の増殖を可能にする。
【００１４】
別の態様では、大腸菌はプラスミドpKD12.138を含む。このプラスミドは、pKD12.112由来で、同じ遺伝子インサートだけでなく、トランスケトラーゼをコードするtrkA遺伝子のインサートを持つ。トランスケトラーゼは、細胞中では通常ほとんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン酸である、Ｄ−エリスロース−４−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの過剰発現は、フォスフォエノールピルビン酸と引き続き縮合して、芳香族アミノ酸生合成の最初に関係する中間体である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸を形成するために、付加的なＤ−エリスロース−４−リン酸を提供する。
【００１５】
別の態様では、aroFFBR、serA、及び／又はaroE遺伝子が、直接宿主細胞のゲノムに挿入されている。これなら、プラスミドはそのような微生物からのシキミ酸生産には必要ないだろう。
【００１６】
本発明の上記のような好ましい組換え大腸菌の例である、大腸菌SP1.1/pKD12.112、SP2.1/pKD12.112、SP1.1/pKD12.138及びSP2.1/pKD12.138は実施例１において記述されているが、ブダペスト条約の合意に基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；12301 パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド 20582）に寄託され、それぞれ、ATCC指定番号98905，98903，207055，207054が与えられた。委託物は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託所で、３０年間、あるいは最後の要求以降５年間、あるいは特許の有効期間のうち、いずれか最長のものの間、維持され、寄託物が、その間になくなったり、生存できなくなっても、補充される。この出願に特許が付与されると、寄託物のサンプルは公に利用可能となり、寄託物の入手に課せられた全ての制限は取り除かれるであろう。
【００１７】
以下の表は、グルコースをキニン酸に変換するために必要な４種類の酵素、それらをコードする遺伝子、本発明の典型的な組換え微生物における遺伝子の起源を開示している。
【００１８】
【表１】
【００１９】
この中で、大腸菌が本発明の方法を行うための微生物として特に述べられているが、文献に引用されており、当業者に知られている一般的なタイプの微生物で、その微生物が、望ましい変換、即ち、炭素源をシキミ酸への変換をもたらすことができるように改変され得るなら、どんなものでも使用され得る。このように、多くのタイプのカビ、細菌、酵母が、本発明の方法で、うまく機能するであろうということが予見される。そのような微生物は、本発明の合成スキームの一つの構成要素から、他の構成要素に変換する特徴的で必要な能力をもち、例えば、選択、変異、及び／又は遺伝学的形質転換過程を通じて、さらに開発されるかもしれない。そのような開発方法は、熟練した研究者にはよく知られている。
【００２０】
本発明の生物学的変換方法を行うため、炭素源を含む溶液が組換え微生物に接触し、炭素源を望ましい構成要素、即ちシキミ酸に変換するのを促進するため、適当な条件の下で維持される生物学的変換混合物を形成する。好ましい態様では、生物学的変換混合物は、約３０℃から約３７℃の温度で、約6.5から約7.5のｐＨで維持される。生物学的混合物は、無機塩、バッファー、コファクター、栄養物質などの、組換え微生物の生存を促進するのに必要な他の物質も含むのが好ましい。生物学的変換混合物は、グルコースが制限された条件で、定常状態で維持されるのが好ましい。好ましい態様では、グルコースを付加する速度は、溶解した酸素の濃度のレベルで決定される。発酵過程の間ずっと、好ましい定常状態は、約１００から約２００μmolのグルコースか、約５％から約３５％の空気飽和の時の溶解した酸素濃度である。
【００２１】
微生物の生存の維持のためのもっと一般的な必要物や、特異的な微生物の生存の維持のための特異的な必要物は、文献に書かれているようによく知られていて、さもなくば、当業者には容易に決めることができるであろう。シキミ酸は、それから当業者には知られた方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）で、生物学的変換混合物から回収され、さらに再結晶化によって精製し得る。
【００２２】
本発明の組換え微生物の培養によって、シキミ酸だけではなく、発酵培地の中にキニン酸もまた、生産されうる。もし、キニン酸の濃度があまりに高い場合、キニン酸から分離してシキミ酸を精製するのは困難である。好ましい態様では、発酵器中のシキミ酸のキニン酸に対する割合は、シキミ酸がキニン酸から分離して精製できるくらいである。好ましくは、モル比は約９以上であるだろう。もっと好ましくは、モル比は約２０以上で、もっとも好ましくは、モル比は４０以上であるだろう。
【００２３】
ある態様において、発酵器中のキニン酸に対するシキミ酸のモル比は、発酵培地中の炭素源の濃度を制御することによって制御される。理論に拘束されようとは思わないが、低い炭素源の濃度では、発酵培地の中のシキミ酸は代わりの炭素源として細胞に再び取り込まれ、キニン酸に変換し、そして発酵培地に再び分泌されると考えられている。発酵中の炭素源の濃度の上昇は、シキミ酸のこの取り込みを阻害し、混入しているキニン酸を減少させたり、あるいは排除したりする。制限的でない例として、Ｋｃ値を０．１から０．８に上昇させることによって、グルコース濃度を上昇させ、このためSP1.1/pKD12.112の発酵中に６５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を加える速度を増加させると、シキミ酸のキニン酸に対するモル比は３．０から１２．０に増加する。
【００２４】
別の態様において、シキミ酸のキニン酸に対するモル比は、代謝できない（加水分解できない）グルコース・アナログを発酵培地に加えることによって、制御される。好ましくは、グルコース・アナログは、約０．１ｍＭと約１０ｍＭの間の濃度で存在するメチルグルコピラノシドである。より好ましくは、メチルグルコピラノシドは、メチル−α―グルコピラノシドかメチル−β―グルコピラノシドか、それらの混合物であってもよい。これらのアナログは加水分解できないので、発酵の最初に加えられるだけでよい。
【００２５】
本発明から生じる利点をもっと完全に立証するため、以下の例が開示される。以下は、例示のためだけであり、発明の範囲を制限するものとして意図されていない。
【００２６】
＜実施例１＞
プラスミド及び宿主菌の作出
二つの異なる大腸菌株に由来する、シキミ酸生合成のために作出された二つの宿主株である。大腸菌SP1.1は、野生型W3110とはただ一つの変異で異なる株であるRB791から作出された。二つ目のシキミ酸の生産菌である大腸菌SP2.1は、特徴が知られたいくつかの変異と、いくつかはわからないが、特徴が解析されていない変異とをもっている菌株から作出された。SP2.1は、本来、デヒドロキニン酸デヒドラターゼをコードするaroD遺伝子における突然変異を得るため、化学的突然変異誘発法を数回繰り返すことにより選択された、単離菌株であるAB2848から作出された。シキミ酸生合成のために二つの生物を作出したことにより、異なるゲノムのバックグラウンドにおいて、様々な培養条件の効果を評価することができた。
【００２７】
SP1.1の作出は、相同組換えにより、RB791のserA遺伝子座にaroBを挿入することからはじまった。このことによって、新たにはじまるセリン合成に必要な酵素であるグリセリン酸燐酸脱水素酵素の発現が不活性化される一方、上昇したデヒドロキニン酸シンターゼの活性をもつ大腸菌を生じた。ひきつづき、大腸菌AL0807からaroL478::Tn10及びaroK17::CmRを、P1を用いて形質導入することにより、シキミ酸キナーゼの両方のアイソザイムが不活性化されたSP1.1を得た。SP2.1の作出は同様に行われたが、生物にデヒドロキニン酸デヒドラターゼを再び導入する余分なステップの必要があった。AB2848のserA遺伝子座にaroBを挿入した後で、機能するaroDのコピーをP1を用いて形質導入することにより、芳香族アミノ酸の生合成はできるが、セリンの生合成はできない生物を得た。ひきつづき、大腸菌AL0807からaroL478::Tn10及びaroK17::CmRをP1を用いて形質導入することにより、SP2.1を得た。
【００２８】
プラスミドpKD12.112は、pSU18を基にしたベクターで（１細胞あたり、およそ１５ないし２０コピー）、フィードバックに耐性の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（aroFFBR）、シキミ酸脱水素酵素（aroE）、グリセリン酸リン酸脱水素酵素（serA）、及びβ−ラクタマーゼ（ApR）をコードする遺伝子を含む。aroFFBR、serA、及びβ−ラクタマーゼの発現は、それぞれの固有のプロモーターからはじまるが、aroEの発現は、固有のプロモーター（ParoE）と強力なハイブリッドのプロモーターtac（Ptac）の両方から起こる。フィードバック耐性のアイソザイム３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼの発現が増強したため、シキミ酸生合成に直接入る代謝系の割合が増える一方、シキミ酸脱水素酵素の発現が増強したため、この酵素のシキミ酸による阻害効果は減少し、これにより副産物のデヒドロシキミ酸の形成は減少する。PKD12.112上にserAが含まれることによって、宿主株のSP1.1及びSP2.1は、セリンの添加のない培地において、プラスミドを維持することになる。最後に、β−ラクタマーゼを含むことによって、SP1.1とSP2.1において、プラスミドの維持に対して選択的圧力をかける方法が、付加的に与えられる。しかしながら、発酵用の接種菌の準備の間、アンピシリンに対する抵抗性は、ただ二次的な選択的圧力としてのみ使用された。発酵培養には、アンピシリンは決して加えられなかった。
【００２９】
プラスミドpKD12.138は、トランスケトラーゼをコードするtktAを挿入することによって、pKD12.112から調製された。トランスケトラーゼは、通常細胞中ではほとんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン酸である、Ｄ−エリトロース−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの過剰発現は、シキミ酸の形成速度及び最終タイターの両方を改善する。
【００３０】
＜実施例２＞
グルコースからシキミ酸の合成
Ｉ．結果
SP1.1/pKD12.112をＫｃ＝0.1で４２時間培養し、結果として、２７．２ｇ／Ｌのシキミ酸、１２．６ｇ／Ｌのキニン酸、４．４ｇ／Ｌの３−デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）が得られたＤＨＳの蓄積は、予想されていた、シキミ酸によるシキミ酸脱水素酵素のフィードバック阻害を反映していた。Draths, K.M. et al, J.Am.Chem.Soc. 114: 9726 (1992)。これに対し、３−デヒドロキニン酸とキニン酸の変換を触媒するキニン酸脱水素酵素が大腸菌に存在しないことを考えると、キニン酸生合成は驚くべき事であった。ＤＨＳは発酵培地を加熱することによって容易に除去され、漂白の間活性炭によって吸収されるプロトカテキュ酸に変換する。残念なことに、キニン酸の混入は、結晶化によってシキミ酸から分離して精製されることができたものより過剰だった。
【００３１】
３−デヒドロキニン酸の細胞内濃度を最小限にすることは、大腸菌SP1.1/pKD12.112によって合成されるシキミ酸中のキニン酸混入を減らすための合理的な方法であるように見えた。それゆえ、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼをコードするAroD遺伝子を、aroE、aroFFBR、serAと共に、プラスミドpKD12.152Aに位置させた。しかしながら、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼの付随する過剰発現は、SP1.1/pKD12.112に対して用いられたものと同じバッチ式発酵器の条件で、SP1.1/pKD12.152Aによって合成されるシキミ酸におけるキニン酸の混入レベルを低下させなかった。理論に拘束されようとは思わないが、これらの結果は、キニン酸形成が、新たに始まる生合成から生じるのではなく、最初に合成されたシキミ酸の平衡から生じるのかもしれないということを示唆する。
【００３２】
キニン酸とシキミ酸の平衡は、以前Klebsiella pneumoniaeの無細胞抽出物中で、調べられた。Mitsuhashi, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 15: 268 (1954)。大腸菌SP1.1/pKD12.112におけるキニン酸形成に関連して、一般的な経路は、生体条件内で（in vivo）正常な生合成の方向の逆に作用することもできなければならない。この可能性をテストするため、２４時間後に発酵器から集菌したSP1.1/pKD12.112細胞を洗い、シキミ酸を含む新しい最少培地に再び懸濁し、それから振とうした。キニン酸（黒塗りの棒、図２）及び３−デヒドロシキミ酸（斜線の棒、図２）の形成は、SP1.1/pKD12.112が最初合成されたシキミ酸からキニン酸の形成が触媒されることを示している。
【００３３】
観察された平衡化の間に、培地から微生物の細胞質に輸送されたシキミ酸の、可能な役割によって、キニン酸混入を最小限にするための対策が示された。大腸菌におけるシキミ酸輸送（Pittard. J. et a;. J. Bacteriol. 92:1070 (1966); Brown, K. D. et al., Biochim. Biophys. Acta 428: 550 (1976)）は、増殖と代謝のための唯一の炭素源としてシキミ酸とキニン酸を触媒する、かつてあった能力の進化的痕跡なのかもしれない。グルコース以外の炭素源を利用すると、しばしば代謝抑制に陥るので、Ｄ−グルコースの利用性が増大すると、シキミ酸の輸送が抑制され、それによってキニン酸の形成が最小限になる。
【００３４】
すべての発酵実験におけるＤ−グルコース添加速度及びこれによるＤ−グルコースの利用性は、比例−積分−微分制御のＫｃによって制御された。例えば、大腸菌SP1.1/pKD12.112によるシキミ酸とキニン酸の混合物の合成（表２）においては、KC=0.1のPID設定値が使われた。PID設定値をKC=0.8まで増やすことによってグルコースの利用性を増加させると、発酵全体を通じて、キニン酸の形成の劇的な減少という結果が得られた。４２時間の培養の後、大腸菌SP1.1/pKD12.112は２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸、４．６ｇ／ＬのＤＨＳ、ただ１．９ｇ／Ｌしかないキニン酸が合成された。同様な条件の下で、SP2.1/pKD12.112は３７ｇ／Ｌのシキミ酸、２．１ｇ／Ｌのキニン酸、４．２ｇ／ＬのＤＨＳを合成した。シキミ酸の合成されたタイターの減少は、大腸菌によるＬ−フェニルアラニンの濃度と収量に対する、Ｄ−グルコース利用性の増大の既知の影響と矛盾がない。Konstantinov. K. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 70:253 (1990); Konstantinov, K. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 71: 350(1991)。もっと重要なことは、２．４：１（KC=0.1）ないし１１．８：１（KC=0.8）のシキミ酸対キニン酸のモル比の改善によって、キニン酸は、シキミ酸の結晶化の間に完全に除去されうる。
【００３５】
【表２】
【００３６】
さらに行われた発酵実験でも、同様のシキミ酸の収量及びシキミ酸：キニン酸の割合が得られた。グルコース添加に対する比例−積分−微分制御の利得（KC）が０．１に設定されたとき、SP1.1/pKD12.112及びSP2.1/pKD12.112は両方ともシキミ酸とキニン酸の許容できない混合物を合成した。SP1.1/pKD12.112はシキミ酸のキニン酸に対するモル比が３．０に達する一方、SP2.1/pKD12.112はモル比が５．０に達した（表３）。モル比がこの範囲にある培地から純粋なシキミ酸を得る試みは、成功しなかった。副産物の合成は、シキミ酸タイターの損失を示したが、ＤＨＳは精製中容易にシキミ酸から分離できる。純粋なシキミ酸を得るのに、ＤＨＳ形成は障害ではなかった。
【００３７】
【表３】
【００３８】
グルコース添加を制御する利得を０．１から０．８に増加したとき、シキミ酸のキニン酸に対するモル比のかなりの増加が観察された。KCを０．８に増加すると、溶解酸素濃度が設定値からはずれたとき、グルコース・ポンプによるより強い反応が生じた。KCを０．８に設定して、４２時間培養後、SP1,1/pKD12.112は、２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸及びただ１．９ｇ／Ｌのキニン酸だけを合成し、モル比は１２に達した（表３）。匹敵する完全がSP2.1/pKD12.112に対しても見られ、４２時間後、３６．６ｇ／Ｌのシキミ酸と２．２ｇ／Ｌのキニン酸を合成することにより、モル比は１８に達した（表３）。そのモル比が約９を越えると、培地中のキニン酸から分離してシキミ酸を容易に精製できる。
【００３９】
KCを増加させると、効果的にキニン酸形成を抑制できるが、これらの実験を制御するのは、極端に難しい。溶解酸素レベルは、グルコース添加レベルにおける振動の直接的な結果として、振動する。これらの実験は、大量の、不必要なグルコースの添加を避けるため、実験開始後約３６時間後から緻密にモニターしなければならない。実験は、４２時間まで機械的に、慎重に管理されたが、４２時間経つと、実験は終了された。培地内での一定のグルコース濃度を増加させると、SP1.1/pKD12.112に対しては、シキミ酸生産速度にかなりの影響があった。SP1.1/pKD12.112は、利得が低い値に設定されたときは、４２時間後に３３ｇ／Ｌのシキミ酸を合成したのに対し、より高い利得では、同時刻に２０．２ｇ／Ｌ合成した。しかしながら、SP2.1/pKD12.112に対しては、生産速度に対する効果は見られなかった。
【００４０】
キニン酸形成を抑制するために、Kcを増やすのと別の方法は、加水分解されないグルコースアナログを培地に加えることであった。メチルα−Ｄ−グルコピラノシド（ＭαＤＧ）が菌の接種の時に発酵培地に加えられ、発酵がそれ以上の調整なしに始められた。１ｍＭのＭαＤＧをSP1.1/pKD12.112の発酵に加えた結果、４０．３ｇ／Ｌのシキミ酸合成が生じた（表３）。キニン酸は検出されなかった。いくつかの濃度が調べられたが、１ｍＭのＭαＤＧが、キニン酸形成を完全に抑制できた最小の濃度であった。ＭαＤＧをSP2.1/pKD12.112の培養に加えた結果も、キニン酸の抑制が生じた。０．５ｍＭのＭαＤＧの存在下で４８時間培養した後、SP2.1/pKD12.112（表３）は３９．６ｇ／Ｌのシキミ酸および、４．１ｇ／Ｌのキニン酸を合成した結果、モル比は１１になった。より高濃度のＭαＤＧは、キニン酸抑制において、それ以上の改善は示さなかった。
【００４１】
相当の妥協をするような条件ではなく、十分にキニン酸形成を抑制する条件を確立し、トランスケトラーゼの過剰発現を用いてシキミ酸のタイターを増やすほうに注意が向けられた。１ｍＭのＭαＤＧの存在下で培養されたとき、SP1.1/pKD12.138は、５１．１ｇ／Ｌのシキミ酸及び４．３ｇ／Ｌのキニン酸を合成し、１３を越すモル比が得られた（表３）。トランスケトラーゼを発現させた結果、シキミ酸を単離できるシキミ酸のキニン酸に対するモル比を維持しながら、シキミ酸のタイターが２５％増加した。ＤＨＳ副産物の濃度はまた８．８ｇ／Ｌに増加したが、それはシキミ酸抑制に耐性のシキミ酸脱水素酵素を得るための余分な刺激となった。SP1.2/pKD12.138が標準的な条件で培養された時、発酵は決して相変化のポイントまで達しなかった。３３℃では、SP2.1/pKD12.138の増殖は遅く、かなりの酢酸の生産が生じた。この状態を防ぐため、培養温度を少し上昇させると増殖速度が上昇するようである。
【００４２】
ここで述べたように、微生物によるシキミ酸の合成は、シキミ酸合成ユーティリティの制限となっている植物源からこの水素化芳香物の単離に、とって代わるかもしれない。同時に、シキミ酸の利用性の増加は、この水素化芳香族のより幅広い利用を予見しているのかもしれない。シキミ酸の微生物合成に対する理論上の最大収量は、Ｄ−グルコースからの４３％である。Draths, K. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 2395 (1995)。微生物の生物学的触媒に対してこの水素化芳香物の毒性が明らかにないことと共に、これまでのシキミ酸の微生物合成で達成された収率（１４〜２２％）と比較すると、収率とタイターの規模の拡大は可能であることが示唆される。
【００４３】
II．方法
＝全般＝
溶質濃度の１Ｈ ＮＭＲ定量のため、溶液は陰圧の下で乾燥するまで濃縮され、重水を加えてもう一度乾燥するまで濃縮され、それから既知の濃度の３−（トリメチルシリル）−２，２，３，３四ジュウテリオプロピオン酸（ＴＳＰ）のナトリウム塩（ランカスター・シンセシス社から購入）を含む重水に、再び溶解された。濃度は、各化合物に対応する数字を、１Ｈ ＮＭＲにおけるＴＳＰ（δ＝０．００ｐｐｍ）に対応した数字と比較することにより、決定された。全ての１Ｈ ＮＭＲスペクトラムは、ヴァリアンＶＸＲ−３００ ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメーター（３００ＭＨｚ）で記録された。
【００４４】
＝培地＝
全ての培地は、蒸留し、脱イオン化した水で調製した。Ｍ９塩（１Ｌ）は、Ｎａ２ＨＰＯ４（６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ）を含む。Ｍ９最少培地（１Ｌ）は、Ｄ−グルコース（１０ｇ）、ＭｇＳＯ４（０．１２ｇ）、チアミン（塩酸塩）（０．００１ｇ）、Ｌ−フェニルアラニン（０．０４０ｇ）、Ｌ−チロシン（０．０４０ｇ）、Ｌ−トリプトファン（０．０４０ｇ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸カリウム（０．０１０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）を含んだＭ９塩１Ｌから成る。示されたところには、アンピシリン（０．０５ｇ／Ｌ）を加えた。Ｍ９塩、ＭｇＳＯ４、グルコースは、個々にオートクレーブし、その後で混合した。芳香族アミノ酸、芳香族ビタミン、アンピシリンは、０．２２μｍ膜で滅菌した。
【００４５】
発酵培地（１Ｌ）は、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）（０．３ｇ）、クエン酸一水和物（２．１ｇ）、Ｌ−フェニルアラニン（０．７ｇ）、Ｌ−チロシン（０．７ｇ）、Ｌ−トリプトファン（０．３５ｇ）、濃硫酸（１．２ｍＬ）を含む。発酵培地は、オートクレーブする前に濃アンモニア溶液を加えて、ｐＨ７．０に調整する。以下の補助物質は、発酵を始める直前に加えられた。Ｄ−グルコース（２０ｇ）、ＭｇＳＯ４（０．２４ｇ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸カリウム（０．０１０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、（ＮＨ４）６（Ｍｏ７Ｏ２４）５・４Ｈ２Ｏ（０．００３７ｇ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００２９ｇ），Ｈ３ＢＯ３（０．０２４７ｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．００２５ｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．０１５８ｇ）を含んだ微量金属。Ｄ−グルコースとＭｇＳＯ４は、別にオートクレーブされ、芳香族ビタミンと微量金属は、０．２２μｍ膜で滅菌された。
【００４６】
＝発酵＝
発酵には、２．０Ｌの作業容積を持つビー・ブラウンＭ２培養器が用いられた。ユーティリティは、ＤＣＵ−１によって管理されたビー・ブラウン・バイオスタット・ＭＤによって供給された。データを得るには、ビー・ブラウンのＭＦＣＳ／Ｗｉｎソフトウエアが装備されたデル オプティプレックスＧｓ＋ ５１６６Ｍパーソナルコンピューターが利用された。温度、ｐＨ、グルコースの添加は、ＰＩＤ制御ループでコントロールされた。温度は、３３℃に保たれた。ｐＨは、濃ＮＨ４ＯＨか２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって、７．０に維持された。溶解した酸素（Ｄ．Ｏ．）は、インゴールドＡタイプＯ２浸透膜を備えたメトラー・トレド社の１２ｍｍ滅菌可能Ｏ２センサーを使って、測定された。Ｄ．Ｏ．は、１０％空気飽和で維持された。
【００４７】
接種材料は、アンピシリンを含むＭ９培地５ｍＬに単一コロニーを植えることによって始められた。接種された培地を、３７℃で、２５０ｒｐｍ、２４時間振盪培養し、引き続いて、アンピシリンを含んだＭ９培地１００ｍＬに加えた。３７℃、２５０ｒｐｍでさらに１２時間増殖後、接種材料は発酵器に移される準備が整った。発酵培地の最初のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌであった。実施している間、１０％の空気飽和でＤ．Ｏ．レベルを維持するために、三つの段階になった方法が使われた。最初０．０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎにセットした空気の流れで、インペラーの速度を、最初の設定値である５０ｒｐｍから最大プリセット値９４０ｒｐｍへと増やすことにより、Ｄ．Ｏ．濃度は維持された。それから、９４０ｒｐｍでインペラーを一定にし、質量流量制御器によって空気の流れの速度を０．０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎから最大プリセット値１．０Ｌ／Ｌ／ｍｉｎに増加させることにより、Ｄ．Ｏ．レベルを維持した。最後に、一定のインペラーのスピードと、一定の空気の流れの速度で、Ｄ．Ｏ．レベルは、酸素センサーによって制御されるグルコースの添加による発酵の残り時間に、１０％空気飽和で維持された。このステージの最初に、Ｄ．Ｏ．レベルはメディウム中の残った最初のグルコースのために、１０％空気飽和以下に落ちた。これは、グルコース（６５％ｗ／ｖ）の添加が始まる前、約一時間続いた。ＰＩＤ制御パラメーターは、微分制御（τＤ）に対しては、０．０（off）に、積分制御（τＩ）にたいしては、９９９．９ｓ（最小制御動作）にセットされた。Ｘｐは、０．１のKCを得るためには９５０％に設定され、０．８のKCを得るためには１２５％に設定された。
【００４８】
発酵培地のサンプル（１０ｍＬ）は、６時間おきに採られた。細胞密度は、水で発酵培地を薄めて、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を計ることによって、決定された。細胞の乾燥重量（ｇ／Ｌ）は、変換係数０．４３ｇ／Ｌ／ＯＤ６００を用いて得られた。残った発酵培地は、細胞のない培地を得るため、ベックマン社微量遠心装置を用いて、４分間遠心した。細胞のない培地中の溶質の濃度は、１Ｈ ＮＭＲによって決定された。
【００４９】
＝発酵培地からシキミ酸の精製＝
発酵培地（１１００〜１２００ｍｌ）を１４０００ｇで２０分間遠心し、細胞が捨てられた。結果として得られた上澄みが４時間還流され、室温まで冷やされ、ｐＨは濃硫酸を加えることにより、２．５に調整された。１４０００ｇで２０分間、遠心した後で、透明な黄色い液体が、細胞の残渣を残して注ぎ出され、濃アンモニア水を加えることで、ｐＨ６．９に調整された。溶液は、ダルコＫＢ−Ｂ活性炭５ｇと混ぜ合わされ、５０ｒｐｍで１〜２時間かき混ぜられ、それからワットマン５の濾紙で濾過された。濾されたものは、さらに水２５０ｍｌで洗われた。一つにされた濾過液は、それから二番目の活性炭と同じやり方で処理された。
【００５０】
溶液を活性炭で処理した後、濃い色は処理前より薄くなっていたが、溶液は無色ではなかった。活性炭での処理の後、溶液は少し灰色であった。氷酢酸を最終濃度１５％になるように加えると、透明な黄色い液体になり、その後４℃でＡＧ１−ｘ８（酢酸型、５ｃｍ×２０ｃｍ）を通して溶出させた。さらに液体の１５％酢酸４００ｍｌで溶出させた後、一つにした溶出液を、４℃でダウエックス５０（水素イオン型、５ｃｍ×２０ｃｍ）のカラムに通し、液体の２５％酢酸４００ｍｌでカラムを洗った。カチオン交換カラムを通った溶出液が混ぜ合わされ沸騰させることで、１５０ｍＬまで濃縮し、回転式エバポレーターで乾燥するまで濃縮すると、堅くて白い固体が残された（この段階までで、８３％の回収率）。エタノールと酢酸エチルとの混合液によって再結晶化すると、細かく白い粉として、シキミ酸が得られた（精製していない発酵培地で定量したシキミ酸を基準として、６１％の回収率）。
【００５１】
以上の議論は、本発明の例となる態様を開示し、記述しただけにすぎない。当業者は、そういった議論や添付された図や請求項から、以下の請求項に提示されているような発明の精神と範囲を離れないで、様々な変更、修正、変形がなされ得るだろう事は、容易に認識できるだろう。
【００５２】
ここで引用された全ての参考文献は、完全に記載されているのと同様に援用されている。加えて、１９９９年１月２９日に提出された米国特許出願第０９／２４０，４４１号「キニン酸の生物触媒による合成」もまた、明示的に援用されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シキミ酸を製造するための本発明の生物工学的合成スキームの図式である。
【図２】 SP1.1/pKD12.112によって触媒されたシキミ酸とキニン酸との平衡関係を示しているグラフである。
＜後援＞
本発明についての研究は、一部、米国農務省第９５−３７５００−１９３０号及び米国国立科学財団第ＣＨＥ９６３３６８号補正００２の支援を受けている。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する場合がある。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、シキミ酸の生産に関するものであり、特に炭素源の生物学的変換によって、シキミ酸を生産する方法に関するものである。
【０００３】
＜発明の背景＞
シキミ酸は、高度に機能化された六個のメンバーからなる環状炭素と多数の非対称中心を持つ魅力的なキラルなシントンである。芳香族アミノ酸の代謝中間体であるシキミ酸は、インフルエンザの治療に効果的なニューラミニダーゼ阻害剤の合成における必須のキラルな出発材料である。Kim, C.U. et al. J.Am.Chem.Soc. 119:681 (1997);Rohloff, J.C. et al., J.Org.Chem. 63: 4545 (1998)。芳香族だけでなく、キラルな化学物質もまた、シキミ酸から合成され得る。例えば、酸が触媒するシキミ酸の脱水化によって、ｐ−ヒドロキシ安息香酸が生じる（Eykmann, J.F., Ber.Dtch.Chem.Ges., 24: 1278 (1891)）。ｐ−ヒドロキシ安息香酸は、年間７×１０６ｋｇの製造量があり、液体結晶ポリマー合成に使われるパラオキシ安息香酸エステル類とモノマーに対して、キーとなる前駆体である。シキミ酸は、最近、分子の大きな組み合わせライブラリーの合成にとっての出発点としてもまた、使われている。Tan, D.S., et al., J.Am.Chem.Soc. 120: 8565 (1998)。
【０００４】
シキミ酸は植物から、時間がかかる多段階の単離手段によって得られる。残念なことに、植物のオオウイキョウ（Illicium）の果実からのシキミ酸の単離（Haslem,E., Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites, Wiley & Sons, New York, pp40-42 (1993)）は、キログラム単位の合成における使用を除外している。
【０００５】
従って、多量のシキミ酸を製造する方法を提供することは望ましいだろう。もし、そんな方法が、安い出発材料を用いて、費用に対し効率がよかったら、それもまた望ましいだろう。その方法が無害の化合物を用い、環境に優しかったら、さらに望ましいだろう。
【０００６】
＜発明の概要＞
炭素源からシキミ酸を製造するための生物工学的合成スキームが提供されている。ある態様では、本発明の生物学的変換は、微生物によって触媒される炭素源のシキミ酸への変換を含む。図１の合成スキームで示されているように、本発明の微生物によって触媒される変換ステップは、組換え微生物によって提供される四つの酵素を必要とする。ある好ましい態様では、組換え微生物は、３−デヒドロシキミ酸をシキミ酸に還元し、芳香族アミノ酸生合成経路に沿ってシキミ酸をさらに変換することを阻害するように設計されている大腸菌である。
【０００７】
ここで提供されるシキミ酸の生物触媒的合成方法は、環境に優しく、経済的に魅力的で、出発材料として豊富に再生可能な原料を使用していると思われる。
【０００８】
本発明の更なる目的、利点、特徴は、添付された図とともに、以下の記述と添付の請求項から明らかになるだろう。
【０００９】
＜好適実施例の詳細な説明＞
ここでは、炭素源からシキミ酸を生産する生物工学的合成スキームが提供されている。合成スキームに基づいた炭素源からシキミ酸を生産する方法もまた、提供されている。
【００１０】
ある態様では、組換え微生物によって炭素源がシキミ酸に変換される方法が提供されている。微生物の一般的な芳香族アミノ酸生合成経路の操作によって、組換え微生物が炭素源の存在下で培養されたとき、かなりの量のシキミ酸を生産する。炭素源は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）に変換され、引き続いて、３−デヒドロキニン酸シンターゼによって、３−デヒドロキニン酸（ＤＨＱ）に変換され、それから３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼによって脱水化され、デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）になる（ｃ、図１）。３−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸脱水素酵素によってシキミ酸に変換される（ｄ、図１）。シキミ酸代謝は、シキミ酸キナーゼ活性を妨害したり阻害したりすることによって妨げられ（ｅ、ｆ、図１）、こうしてかなりの量のシキミ酸を蓄積させる。好ましい態様では、微生物はシキミ酸取り込みにおける変異（shiA）のため、培地からシキミ酸を再吸収することができないだろう。こうして、いったん形成されれば、シキミ酸はキニン酸や経路上の他の分子に変換され得ない。
【００１１】
本発明の生物学的変換方法は、炭素源からシキミ酸への最大限の変換を提供するため、時間、温度、ｐＨ、栄養源の種類、濃度の条件や、通気条件、及び制御された酸素濃度の下で、なされた。実施例で詳細に説明するが、好ましい態様では、バッチ式発酵器（fed-batch fermentor）が炭素源からシキミ酸に変換するのに使われ、その後イオン交換クロマトグラフィーによって発酵培地からシキミ酸が単離された。バッチ式発酵器の過程とクロマトグラフィーの技術は、当業者には既知である。
【００１２】
ここで用いる場合、「炭素源」という語句は、キシロース、アラビノース、グリセロール、グルコースと、クレブス回路の中間体（即ち、ジカルボン酸）を、単体で、あるいは複数で含むが、それらに制限されない炭素源由来のバイオマスを意味する。好ましい態様では、炭素源はグルコースである。炭素源は、以下の例に制限されるわけでないが、トウモロコシ、テンサイ、サトウキビのような再生可能な原料に由来してもよい。
【００１３】
他の態様では、本発明の方法で使用されている微生物は大腸菌である。好ましい態様では、大腸菌は、serA遺伝子座に挿入されたaroBカセットを含み、aroLとaroKの遺伝子座が破壊されている（e、f、図１）。この組換え大腸菌は、さらに、aroFFBR、aroE、serA遺伝子のインサートを持つプラスミドを含んでもよい。aroLとaroKにコードされるシキミ酸キナーゼのアイソザイムを欠くため、シキミ酸は蓄積するが、一方aroBの２番目のコピーが３−デヒドロキネートシンターゼの触媒活性を増加させる。Dell, K.A. et al., J.Am.Chem.Soc. 115: 11581 (1993)。好ましい態様では、組換え大腸菌は、aroFFBR、serA、aroEのインサートを持つプラスミドpKD12.112を含む。AroFFBR遺伝子のインサートは、芳香族アミノ酸やほかの芳香族分子によるフィードバック阻害に耐性の変異型３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼアイソザイム（a、図１）をコードする。このフィードバック阻害は、共通の芳香族アミノ酸の生合成経路に入る炭素の流れを増加させる。aroEの発現の結果生じるシキミ酸脱水素酵素の活性増幅がシキミ酸による酵素のフィードバック阻害を相補する。Pittard, J. et al., J.bacterial. 92: 1070 (1966); Brown, K.D. et al., Biochim. Biophys. Acta. 428: 550 (1976)。Ｌ−セリン生合成に必要な大腸菌ゲノム上のserA遺伝子座における変異のため、最少培地における増殖とプラスミド維持は、プラスミド上のserAの発現後に起きる。このように、プラスミド上serAインサートによって、微生物を識別して、最少培地での微生物の増殖を可能にする。
【００１４】
別の態様では、大腸菌はプラスミドpKD12.138を含む。このプラスミドは、pKD12.112由来で、同じ遺伝子インサートだけでなく、トランスケトラーゼをコードするtrkA遺伝子のインサートを持つ。トランスケトラーゼは、細胞中では通常ほとんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン酸である、Ｄ−エリスロース−４−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの過剰発現は、フォスフォエノールピルビン酸と引き続き縮合して、芳香族アミノ酸生合成の最初に関係する中間体である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸を形成するために、付加的なＤ−エリスロース−４−リン酸を提供する。
【００１５】
別の態様では、aroFFBR、serA、及び／又はaroE遺伝子が、直接宿主細胞のゲノムに挿入されている。これなら、プラスミドはそのような微生物からのシキミ酸生産には必要ないだろう。
【００１６】
本発明の上記のような好ましい組換え大腸菌の例である、大腸菌SP1.1/pKD12.112、SP2.1/pKD12.112、SP1.1/pKD12.138及びSP2.1/pKD12.138は実施例１において記述されているが、ブダペスト条約の合意に基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；12301 パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド 20582）に寄託され、それぞれ、ATCC指定番号98905，98903，207055，207054が与えられた。委託物は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託所で、３０年間、あるいは最後の要求以降５年間、あるいは特許の有効期間のうち、いずれか最長のものの間、維持され、寄託物が、その間になくなったり、生存できなくなっても、補充される。この出願に特許が付与されると、寄託物のサンプルは公に利用可能となり、寄託物の入手に課せられた全ての制限は取り除かれるであろう。
【００１７】
以下の表は、グルコースをキニン酸に変換するために必要な４種類の酵素、それらをコードする遺伝子、本発明の典型的な組換え微生物における遺伝子の起源を開示している。
【００１８】
【表１】
この中で、大腸菌が本発明の方法を行うための微生物として特に述べられているが、文献に引用されており、当業者に知られている一般的なタイプの微生物で、その微生物が、望ましい変換、即ち、炭素源をシキミ酸への変換をもたらすことができるように改変され得るなら、どんなものでも使用され得る。このように、多くのタイプのカビ、細菌、酵母が、本発明の方法で、うまく機能するであろうということが予見される。そのような微生物は、本発明の合成スキームの一つの構成要素から、他の構成要素に変換する特徴的で必要な能力をもち、例えば、選択、変異、及び／又は遺伝学的形質転換過程を通じて、さらに開発されるかもしれない。そのような開発方法は、熟練した研究者にはよく知られている。
【００２０】
本発明の生物学的変換方法を行うため、炭素源を含む溶液が組換え微生物に接触し、炭素源を望ましい構成要素、即ちシキミ酸に変換するのを促進するため、適当な条件の下で維持される生物学的変換混合物を形成する。好ましい態様では、生物学的変換混合物は、約３０℃から約３７℃の温度で、約6.5から約7.5のｐＨで維持される。生物学的混合物は、無機塩、バッファー、コファクター、栄養物質などの、組換え微生物の生存を促進するのに必要な他の物質も含むのが好ましい。生物学的変換混合物は、グルコースが制限された条件で、定常状態で維持されるのが好ましい。好ましい態様では、グルコースを付加する速度は、溶解した酸素の濃度のレベルで決定される。発酵過程の間ずっと、好ましい定常状態は、約１００から約２００μmolのグルコースか、約５％から約３５％の空気飽和の時の溶解した酸素濃度である。
【００２１】
微生物の生存の維持のためのもっと一般的な必要物や、特異的な微生物の生存の維持のための特異的な必要物は、文献に書かれているようによく知られていて、さもなくば、当業者には容易に決めることができるであろう。シキミ酸は、それから当業者には知られた方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）で、生物学的変換混合物から回収され、さらに再結晶化によって精製し得る。
【００２２】
本発明の組換え微生物の培養によって、シキミ酸だけではなく、発酵培地の中にキニン酸もまた、生産されうる。もし、キニン酸の濃度があまりに高い場合、キニン酸から分離してシキミ酸を精製するのは困難である。好ましい態様では、発酵器中のシキミ酸のキニン酸に対する割合は、シキミ酸がキニン酸から分離して精製できるくらいである。好ましくは、モル比は約９以上であるだろう。もっと好ましくは、モル比は約２０以上で、もっとも好ましくは、モル比は４０以上であるだろう。
【００２３】
ある態様において、発酵器中のキニン酸に対するシキミ酸のモル比は、発酵培地中の炭素源の濃度を制御することによって制御される。理論に拘束されようとは思わないが、低い炭素源の濃度では、発酵培地の中のシキミ酸は代わりの炭素源として細胞に再び取り込まれ、キニン酸に変換し、そして発酵培地に再び分泌されると考えられている。発酵中の炭素源の濃度の上昇は、シキミ酸のこの取り込みを阻害し、混入しているキニン酸を減少させたり、あるいは排除したりする。制限的でない例として、Ｋｃ値を０．１から０．８に上昇させることによって、グルコース濃度を上昇させ、このためSP1.1/pKD12.112の発酵中に６５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を加える速度を増加させると、シキミ酸のキニン酸に対するモル比は３．０から１２．０に増加する。
【００２４】
別の態様において、シキミ酸のキニン酸に対するモル比は、代謝できない（加水分解できない）グルコース・アナログを発酵培地に加えることによって、制御される。好ましくは、グルコース・アナログは、約０．１ｍＭと約１０ｍＭの間の濃度で存在するメチルグルコピラノシドである。より好ましくは、メチルグルコピラノシドは、メチル−α―グルコピラノシドかメチル−β―グルコピラノシドか、それらの混合物であってもよい。これらのアナログは加水分解できないので、発酵の最初に加えられるだけでよい。
【００２５】
本発明から生じる利点をもっと完全に立証するため、以下の例が開示される。以下は、例示のためだけであり、発明の範囲を制限するものとして意図されていない。
【００２６】
＜実施例１＞
プラスミド及び宿主菌の作出
二つの異なる大腸菌株に由来する、シキミ酸生合成のために作出された二つの宿主株である。大腸菌SP1.1は、野生型W3110とはただ一つの変異で異なる株であるRB791から作出された。二つ目のシキミ酸の生産菌である大腸菌SP2.1は、特徴が知られたいくつかの変異と、いくつかはわからないが、特徴が解析されていない変異とをもっている菌株から作出された。SP2.1は、本来、デヒドロキニン酸デヒドラターゼをコードするaroD遺伝子における突然変異を得るため、化学的突然変異誘発法を数回繰り返すことにより選択された、単離菌株であるAB2848から作出された。シキミ酸生合成のために二つの生物を作出したことにより、異なるゲノムのバックグラウンドにおいて、様々な培養条件の効果を評価することができた。
【００２７】
SP1.1の作出は、相同組換えにより、RB791のserA遺伝子座にaroBを挿入することからはじまった。このことによって、新たにはじまるセリン合成に必要な酵素であるグリセリン酸燐酸脱水素酵素の発現が不活性化される一方、上昇したデヒドロキニン酸シンターゼの活性をもつ大腸菌を生じた。ひきつづき、大腸菌AL0807からaroL478::Tn10及びaroK17::CmRを、P1を用いて形質導入することにより、シキミ酸キナーゼの両方のアイソザイムが不活性化されたSP1.1を得た。SP2.1の作出は同様に行われたが、生物にデヒドロキニン酸デヒドラターゼを再び導入する余分なステップの必要があった。AB2848のserA遺伝子座にaroBを挿入した後で、機能するaroDのコピーをP1を用いて形質導入することにより、芳香族アミノ酸の生合成はできるが、セリンの生合成はできない生物を得た。ひきつづき、大腸菌AL0807からaroL478::Tn10及びaroK17::CmRをP1を用いて形質導入することにより、SP2.1を得た。
【００２８】
プラスミドpKD12.112は、pSU18を基にしたベクターで（１細胞あたり、およそ１５ないし２０コピー）、フィードバックに耐性の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（aroFFBR）、シキミ酸脱水素酵素（aroE）、グリセリン酸リン酸脱水素酵素（serA）、及びβ−ラクタマーゼ（ApR）をコードする遺伝子を含む。aroFFBR、serA、及びβ−ラクタマーゼの発現は、それぞれの固有のプロモーターからはじまるが、aroEの発現は、固有のプロモーター（ParoE）と強力なハイブリッドのプロモーターtac（Ptac）の両方から起こる。フィードバック耐性のアイソザイム３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼの発現が増強したため、シキミ酸生合成に直接入る代謝系の割合が増える一方、シキミ酸脱水素酵素の発現が増強したため、この酵素のシキミ酸による阻害効果は減少し、これにより副産物のデヒドロシキミ酸の形成は減少する。PKD12.112上にserAが含まれることによって、宿主株のSP1.1及びSP2.1は、セリンの添加のない培地において、プラスミドを維持することになる。最後に、β−ラクタマーゼを含むことによって、SP1.1とSP2.1において、プラスミドの維持に対して選択的圧力をかける方法が、付加的に与えられる。しかしながら、発酵用の接種菌の準備の間、アンピシリンに対する抵抗性は、ただ二次的な選択的圧力としてのみ使用された。発酵培養には、アンピシリンは決して加えられなかった。
【００２９】
プラスミドpKD12.138は、トランスケトラーゼをコードするtktAを挿入することによって、pKD12.112から調製された。トランスケトラーゼは、通常細胞中ではほとんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン酸である、Ｄ−エリトロース−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの過剰発現は、シキミ酸の形成速度及び最終タイターの両方を改善する。
【００３０】
＜実施例２＞
グルコースからシキミ酸の合成
Ｉ．結果
SP1.1/pKD12.112をＫｃ＝0.1で４２時間培養し、結果として、２７．２ｇ／Ｌのシキミ酸、１２．６ｇ／Ｌのキニン酸、４．４ｇ／Ｌの３−デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）が得られたＤＨＳの蓄積は、予想されていた、シキミ酸によるシキミ酸脱水素酵素のフィードバック阻害を反映していた。Draths, K.M. et al, J.Am.Chem.Soc. 114: 9726 (1992)。これに対し、３−デヒドロキニン酸とキニン酸の変換を触媒するキニン酸脱水素酵素が大腸菌に存在しないことを考えると、キニン酸生合成は驚くべき事であった。ＤＨＳは発酵培地を加熱することによって容易に除去され、漂白の間活性炭によって吸収されるプロトカテキュ酸に変換する。残念なことに、キニン酸の混入は、結晶化によってシキミ酸から分離して精製されることができたものより過剰だった。
【００３１】
３−デヒドロキニン酸の細胞内濃度を最小限にすることは、大腸菌SP1.1/pKD12.112によって合成されるシキミ酸中のキニン酸混入を減らすための合理的な方法であるように見えた。それゆえ、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼをコードするAroD遺伝子を、aroE、aroFFBR、serAと共に、プラスミドpKD12.152Aに位置させた。しかしながら、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼの付随する過剰発現は、SP1.1/pKD12.112に対して用いられたものと同じバッチ式発酵器の条件で、SP1.1/pKD12.152Aによって合成されるシキミ酸におけるキニン酸の混入レベルを低下させなかった。理論に拘束されようとは思わないが、これらの結果は、キニン酸形成が、新たに始まる生合成から生じるのではなく、最初に合成されたシキミ酸の平衡から生じるのかもしれないということを示唆する。
【００３２】
キニン酸とシキミ酸の平衡は、以前Klebsiella pneumoniaeの無細胞抽出物中で、調べられた。Mitsuhashi, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 15: 268 (1954)。大腸菌SP1.1/pKD12.112におけるキニン酸形成に関連して、一般的な経路は、生体条件内で（in vivo）正常な生合成の方向の逆に作用することもできなければならない。この可能性をテストするため、２４時間後に発酵器から集菌したSP1.1/pKD12.112細胞を洗い、シキミ酸を含む新しい最少培地に再び懸濁し、それから振とうした。キニン酸（黒塗りの棒、図２）及び３−デヒドロシキミ酸（斜線の棒、図２）の形成は、SP1.1/pKD12.112が最初合成されたシキミ酸からキニン酸の形成が触媒されることを示している。
【００３３】
観察された平衡化の間に、培地から微生物の細胞質に輸送されたシキミ酸の、可能な役割によって、キニン酸混入を最小限にするための対策が示された。大腸菌におけるシキミ酸輸送（Pittard. J. et a;. J. Bacteriol. 92:1070 (1966); Brown, K. D. et al., Biochim. Biophys. Acta 428: 550 (1976)）は、増殖と代謝のための唯一の炭素源としてシキミ酸とキニン酸を触媒する、かつてあった能力の進化的痕跡なのかもしれない。グルコース以外の炭素源を利用すると、しばしば代謝抑制に陥るので、Ｄ−グルコースの利用性が増大すると、シキミ酸の輸送が抑制され、それによってキニン酸の形成が最小限になる。
【００３４】
すべての発酵実験におけるＤ−グルコース添加速度及びこれによるＤ−グルコースの利用性は、比例−積分−微分制御のＫｃによって制御された。例えば、大腸菌SP1.1/pKD12.112によるシキミ酸とキニン酸の混合物の合成（表２）においては、KC=0.1のPID設定値が使われた。PID設定値をKC=0.8まで増やすことによってグルコースの利用性を増加させると、発酵全体を通じて、キニン酸の形成の劇的な減少という結果が得られた。４２時間の培養の後、大腸菌SP1.1/pKD12.112は２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸、４．６ｇ／ＬのＤＨＳ、ただ１．９ｇ／Ｌしかないキニン酸が合成された。同様な条件の下で、SP2.1/pKD12.112は３７ｇ／Ｌのシキミ酸、２．１ｇ／Ｌのキニン酸、４．２ｇ／ＬのＤＨＳを合成した。シキミ酸の合成されたタイターの減少は、大腸菌によるＬ−フェニルアラニンの濃度と収量に対する、Ｄ−グルコース利用性の増大の既知の影響と矛盾がない。Konstantinov. K. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 70:253 (1990); Konstantinov, K. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 71: 350(1991)。もっと重要なことは、２．４：１（KC=0.1）ないし１１．８：１（KC=0.8）のシキミ酸対キニン酸のモル比の改善によって、キニン酸は、シキミ酸の結晶化の間に完全に除去されうる。
【００３５】
【表２】
さらに行われた発酵実験でも、同様のシキミ酸の収量及びシキミ酸：キニン酸の割合が得られた。グルコース添加に対する比例−積分−微分制御の利得（KC）が０．１に設定されたとき、SP1.1/pKD12.112及びSP2.1/pKD12.112は両方ともシキミ酸とキニン酸の許容できない混合物を合成した。SP1.1/pKD12.112はシキミ酸のキニン酸に対するモル比が３．０に達する一方、SP2.1/pKD12.112はモル比が５．０に達した（表３）。モル比がこの範囲にある培地から純粋なシキミ酸を得る試みは、成功しなかった。副産物の合成は、シキミ酸タイターの損失を示したが、ＤＨＳは精製中容易にシキミ酸から分離できる。純粋なシキミ酸を得るのに、ＤＨＳ形成は障害ではなかった。
【００３７】
【表３】
グルコース添加を制御する利得を０．１から０．８に増加したとき、シキミ酸のキニン酸に対するモル比のかなりの増加が観察された。KCを０．８に増加すると、溶解酸素濃度が設定値からはずれたとき、グルコース・ポンプによるより強い反応が生じた。KCを０．８に設定して、４２時間培養後、SP1,1/pKD12.112は、２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸及びただ１．９ｇ／Ｌのキニン酸だけを合成し、モル比は１２に達した（表３）。匹敵する完全がSP2.1/pKD12.112に対しても見られ、４２時間後、３６．６ｇ／Ｌのシキミ酸と２．２ｇ／Ｌのキニン酸を合成することにより、モル比は１８に達した（表３）。そのモル比が約９を越えると、培地中のキニン酸から分離してシキミ酸を容易に精製できる。
【００３９】
KCを増加させると、効果的にキニン酸形成を抑制できるが、これらの実験を制御するのは、極端に難しい。溶解酸素レベルは、グルコース添加レベルにおける振動の直接的な結果として、振動する。これらの実験は、大量の、不必要なグルコースの添加を避けるため、実験開始後約３６時間後から緻密にモニターしなければならない。実験は、４２時間まで機械的に、慎重に管理されたが、４２時間経つと、実験は終了された。培地内での一定のグルコース濃度を増加させると、SP1.1/pKD12.112に対しては、シキミ酸生産速度にかなりの影響があった。SP1.1/pKD12.112は、利得が低い値に設定されたときは、４２時間後に３３ｇ／Ｌのシキミ酸を合成したのに対し、より高い利得では、同時刻に２０．２ｇ／Ｌ合成した。しかしながら、SP2.1/pKD12.112に対しては、生産速度に対する効果は見られなかった。
【００４０】
キニン酸形成を抑制するために、Kcを増やすのと別の方法は、加水分解されないグルコースアナログを培地に加えることであった。メチルα−Ｄ−グルコピラノシド（ＭαＤＧ）が菌の接種の時に発酵培地に加えられ、発酵がそれ以上の調整なしに始められた。１ｍＭのＭαＤＧをSP1.1/pKD12.112の発酵に加えた結果、４０．３ｇ／Ｌのシキミ酸合成が生じた（表３）。キニン酸は検出されなかった。いくつかの濃度が調べられたが、１ｍＭのＭαＤＧが、キニン酸形成を完全に抑制できた最小の濃度であった。ＭαＤＧをSP2.1/pKD12.112の培養に加えた結果も、キニン酸の抑制が生じた。０．５ｍＭのＭαＤＧの存在下で４８時間培養した後、SP2.1/pKD12.112（表３）は３９．６ｇ／Ｌのシキミ酸および、４．１ｇ／Ｌのキニン酸を合成した結果、モル比は１１になった。より高濃度のＭαＤＧは、キニン酸抑制において、それ以上の改善は示さなかった。
【００４１】
相当の妥協をするような条件ではなく、十分にキニン酸形成を抑制する条件を確立し、トランスケトラーゼの過剰発現を用いてシキミ酸のタイターを増やすほうに注意が向けられた。１ｍＭのＭαＤＧの存在下で培養されたとき、SP1.1/pKD12.138は、５１．１ｇ／Ｌのシキミ酸及び４．３ｇ／Ｌのキニン酸を合成し、１３を越すモル比が得られた（表３）。トランスケトラーゼを発現させた結果、シキミ酸を単離できるシキミ酸のキニン酸に対するモル比を維持しながら、シキミ酸のタイターが２５％増加した。ＤＨＳ副産物の濃度はまた８．８ｇ／Ｌに増加したが、それはシキミ酸抑制に耐性のシキミ酸脱水素酵素を得るための余分な刺激となった。SP1.2/pKD12.138が標準的な条件で培養された時、発酵は決して相変化のポイントまで達しなかった。３３℃では、SP2.1/pKD12.138の増殖は遅く、かなりの酢酸の生産が生じた。この状態を防ぐため、培養温度を少し上昇させると増殖速度が上昇するようである。
【００４２】
ここで述べたように、微生物によるシキミ酸の合成は、シキミ酸合成ユーティリティの制限となっている植物源からこの水素化芳香物の単離に、とって代わるかもしれない。同時に、シキミ酸の利用性の増加は、この水素化芳香族のより幅広い利用を予見しているのかもしれない。シキミ酸の微生物合成に対する理論上の最大収量は、Ｄ−グルコースからの４３％である。Draths, K. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 2395 (1995)。微生物の生物学的触媒に対してこの水素化芳香物の毒性が明らかにないことと共に、これまでのシキミ酸の微生物合成で達成された収率（１４〜２２％）と比較すると、収率とタイターの規模の拡大は可能であることが示唆される。
【００４３】
II．方法
＝全般＝
溶質濃度の１Ｈ ＮＭＲ定量のため、溶液は陰圧の下で乾燥するまで濃縮され、重水を加えてもう一度乾燥するまで濃縮され、それから既知の濃度の３−（トリメチルシリル）−２，２，３，３四ジュウテリオプロピオン酸（ＴＳＰ）のナトリウム塩（ランカスター・シンセシス社から購入）を含む重水に、再び溶解された。濃度は、各化合物に対応する数字を、１Ｈ ＮＭＲにおけるＴＳＰ（δ＝０．００ｐｐｍ）に対応した数字と比較することにより、決定された。全ての１Ｈ ＮＭＲスペクトラムは、ヴァリアンＶＸＲ−３００ ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメーター（３００ＭＨｚ）で記録された。
【００４４】
＝培地＝
全ての培地は、蒸留し、脱イオン化した水で調製した。Ｍ９塩（１Ｌ）は、Ｎａ２ＨＰＯ４（６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ）を含む。Ｍ９最少培地（１Ｌ）は、Ｄ−グルコース（１０ｇ）、ＭｇＳＯ４（０．１２ｇ）、チアミン（塩酸塩）（０．００１ｇ）、Ｌ−フェニルアラニン（０．０４０ｇ）、Ｌ−チロシン（０．０４０ｇ）、Ｌ−トリプトファン（０．０４０ｇ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸カリウム（０．０１０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）を含んだＭ９塩１Ｌから成る。示されたところには、アンピシリン（０．０５ｇ／Ｌ）を加えた。Ｍ９塩、ＭｇＳＯ４、グルコースは、個々にオートクレーブし、その後で混合した。芳香族アミノ酸、芳香族ビタミン、アンピシリンは、０．２２μｍ膜で滅菌した。
【００４５】
発酵培地（１Ｌ）は、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）（０．３ｇ）、クエン酸一水和物（２．１ｇ）、Ｌ−フェニルアラニン（０．７ｇ）、Ｌ−チロシン（０．７ｇ）、Ｌ−トリプトファン（０．３５ｇ）、濃硫酸（１．２ｍＬ）を含む。発酵培地は、オートクレーブする前に濃アンモニア溶液を加えて、ｐＨ７．０に調整する。以下の補助物質は、発酵を始める直前に加えられた。Ｄ−グルコース（２０ｇ）、ＭｇＳＯ４（０．２４ｇ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸カリウム（０．０１０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、（ＮＨ４）６（Ｍｏ７Ｏ２４）５・４Ｈ２Ｏ（０．００３７ｇ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００２９ｇ），Ｈ３ＢＯ３（０．０２４７ｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．００２５ｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．０１５８ｇ）を含んだ微量金属。Ｄ−グルコースとＭｇＳＯ４は、別にオートクレーブされ、芳香族ビタミンと微量金属は、０．２２μｍ膜で滅菌された。
【００４６】
＝発酵＝
発酵には、２．０Ｌの作業容積を持つビー・ブラウンＭ２培養器が用いられた。ユーティリティは、ＤＣＵ−１によって管理されたビー・ブラウン・バイオスタット・ＭＤによって供給された。データを得るには、ビー・ブラウンのＭＦＣＳ／Ｗｉｎソフトウエアが装備されたデル オプティプレックスＧｓ＋ ５１６６Ｍパーソナルコンピューターが利用された。温度、ｐＨ、グルコースの添加は、ＰＩＤ制御ループでコントロールされた。温度は、３３℃に保たれた。ｐＨは、濃ＮＨ４ＯＨか２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって、７．０に維持された。溶解した酸素（Ｄ．Ｏ．）は、インゴールドＡタイプＯ２浸透膜を備えたメトラー・トレド社の１２ｍｍ滅菌可能Ｏ２センサーを使って、測定された。Ｄ．Ｏ．は、１０％空気飽和で維持された。
【００４７】
接種材料は、アンピシリンを含むＭ９培地５ｍＬに単一コロニーを植えることによって始められた。接種された培地を、３７℃で、２５０ｒｐｍ、２４時間振盪培養し、引き続いて、アンピシリンを含んだＭ９培地１００ｍＬに加えた。３７℃、２５０ｒｐｍでさらに１２時間増殖後、接種材料は発酵器に移される準備が整った。発酵培地の最初のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌであった。実施している間、１０％の空気飽和でＤ．Ｏ．レベルを維持するために、三つの段階になった方法が使われた。最初０．０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎにセットした空気の流れで、インペラーの速度を、最初の設定値である５０ｒｐｍから最大プリセット値９４０ｒｐｍへと増やすことにより、Ｄ．Ｏ．濃度は維持された。それから、９４０ｒｐｍでインペラーを一定にし、質量流量制御器によって空気の流れの速度を０．０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎから最大プリセット値１．０Ｌ／Ｌ／ｍｉｎに増加させることにより、Ｄ．Ｏ．レベルを維持した。最後に、一定のインペラーのスピードと、一定の空気の流れの速度で、Ｄ．Ｏ．レベルは、酸素センサーによって制御されるグルコースの添加による発酵の残り時間に、１０％空気飽和で維持された。このステージの最初に、Ｄ．Ｏ．レベルはメディウム中の残った最初のグルコースのために、１０％空気飽和以下に落ちた。これは、グルコース（６５％ｗ／ｖ）の添加が始まる前、約一時間続いた。ＰＩＤ制御パラメーターは、微分制御（τＤ）に対しては、０．０（off）に、積分制御（τＩ）にたいしては、９９９．９ｓ（最小制御動作）にセットされた。Ｘｐは、０．１のKCを得るためには９５０％に設定され、０．８のKCを得るためには１２５％に設定された。
【００４８】
発酵培地のサンプル（１０ｍＬ）は、６時間おきに採られた。細胞密度は、水で発酵培地を薄めて、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を計ることによって、決定された。細胞の乾燥重量（ｇ／Ｌ）は、変換係数０．４３ｇ／Ｌ／ＯＤ６００を用いて得られた。残った発酵培地は、細胞のない培地を得るため、ベックマン社微量遠心装置を用いて、４分間遠心した。細胞のない培地中の溶質の濃度は、１Ｈ ＮＭＲによって決定された。
【００４９】
＝発酵培地からシキミ酸の精製＝
発酵培地（１１００〜１２００ｍｌ）を１４０００ｇで２０分間遠心し、細胞が捨てられた。結果として得られた上澄みが４時間還流され、室温まで冷やされ、ｐＨは濃硫酸を加えることにより、２．５に調整された。１４０００ｇで２０分間、遠心した後で、透明な黄色い液体が、細胞の残渣を残して注ぎ出され、濃アンモニア水を加えることで、ｐＨ６．９に調整された。溶液は、ダルコＫＢ−Ｂ活性炭５ｇと混ぜ合わされ、５０ｒｐｍで１〜２時間かき混ぜられ、それからワットマン５の濾紙で濾過された。濾されたものは、さらに水２５０ｍｌで洗われた。一つにされた濾過液は、それから二番目の活性炭と同じやり方で処理された。
【００５０】
溶液を活性炭で処理した後、濃い色は処理前より薄くなっていたが、溶液は無色ではなかった。活性炭での処理の後、溶液は少し灰色であった。氷酢酸を最終濃度１５％になるように加えると、透明な黄色い液体になり、その後４℃でＡＧ１−ｘ８（酢酸型、５ｃｍ×２０ｃｍ）を通して溶出させた。さらに液体の１５％酢酸４００ｍｌで溶出させた後、一つにした溶出液を、４℃でダウエックス５０（水素イオン型、５ｃｍ×２０ｃｍ）のカラムに通し、液体の２５％酢酸４００ｍｌでカラムを洗った。カチオン交換カラムを通った溶出液が混ぜ合わされ沸騰させることで、１５０ｍＬまで濃縮し、回転式エバポレーターで乾燥するまで濃縮すると、堅くて白い固体が残された（この段階までで、８３％の回収率）。エタノールと酢酸エチルとの混合液によって再結晶化すると、細かく白い粉として、シキミ酸が得られた（精製していない発酵培地で定量したシキミ酸を基準として、６１％の回収率）。
【００５１】
以上の議論は、本発明の例となる態様を開示し、記述しただけにすぎない。当業者は、そういった議論や添付された図や請求項から、以下の請求項に提示されているような発明の精神と範囲を離れないで、様々な変更、修正、変形がなされ得るだろう事は、容易に認識できるだろう。
【００５２】
ここで引用された全ての参考文献は、完全に記載されているのと同様に援用されている。加えて、１９９９年１月２９日に提出された米国特許出願第０９／２４０，４４１号「キニン酸の生物触媒による合成」もまた、明示的に援用されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シキミ酸を製造するための本発明の生物工学的合成スキームの図式である。
【図２】 SP1.1/pKD12.112によって触媒されたシキミ酸とキニン酸との平衡関係を示しているグラフである。
Claims (35)
- 炭素源からシキミ酸を生産するための方法であって、
ａ）炭素源をシキミ酸に変換することができる宿主細胞を準備する段階であって、
前記宿主細胞は、芳香族アミノ酸生合成経路における３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、シキミ酸脱水素酵素、および３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする組換え遺伝子を含み、
前記宿主細胞は、当該宿主細胞におけるシキミ酸キナーゼ活性の、変異による欠失、阻害または減少をさらに含むことを特徴とする、段階と、
ｂ）炭素源の存在下で、シキミ酸対キニン酸のモル比を制御する環境において、宿主細胞を培養する段階と
を含む方法。 - 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- シキミ酸脱水素酵素をコードする組換えＤＮＡがaroE遺伝子を含む請求項１に記載の方法。
- プラスミド上のaroE遺伝子が、宿主細胞に導入される請求項３に記載の方法。
- 前記プラスミドが、aroFFBR、serA、およびaroEをコードする組換えＤＮＡを含むpKD12.112である請求項４に記載の方法。
- 前記プラスミドが、aroFFBR、serA、aroE、およびtktAをコードする組換えＤＮＡを含むpKD12.138である請求項４に記載の方法。
- ３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする組換えＤＮＡがaroB遺伝子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- aroB遺伝子が宿主細胞のserA遺伝子座に挿入されることにより、宿主細胞に導入される請求項７に記載の方法。
- 前記シキミ酸キナーゼ活性の、変異による欠失、阻害または減少が、aroK及びaroL遺伝子の欠失、または、aroK及びaroLを不活性化するその他の変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- さらに、炭素源からの宿主細胞の芳香族アミノ酸に共通な生合成経路への炭素の流れを増大させる段階を含む請求項１に記載の方法。
- 芳香族アミノ酸や他の芳香族分子によるフィードバック阻害に抵抗性のある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロネート−７−リン酸シンターゼのアイソザイムをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換することによって、炭素源の経路への流れを増大させる請求項１０に記載の方法。
- アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸のアイソザイムをコードしている遺伝子がaroFFBR遺伝子である請求項１１に記載の方法。
- プラスミド上のaroFFBR遺伝子が宿主細胞に導入される請求項１２に記載の方法。
- 前記プラスミドがaroFFBR、serA、およびaroEをコードする組換えＤＮＡを含むpKD12.112である請求項１３に記載の方法。
- 前記プラスミドがaroFFBR、serA、aroE 、およびtktをコードする組換えＤＮＡを含むApKD12.138である請求項１３に記載の方法。
- シキミ酸のキニン酸に対するモル比が９以上である請求項１に記載の方法。
- シキミ酸のキニン酸に対するモル比を制御することが、シキミ酸のキニン酸に対する平衡を減少させることを含む請求項１に記載の方法。
- シキミ酸のキニン酸に対する平衡を減少させることが加水分解できないグルコース・アナログの存在下で前記宿主細胞を培養すること含む請求項１７に記載の方法。
- 加水分解できないグルコース・アナログがメチルグルコピラノシドである請求項１８に記載の方法。
- 発酵培地の中のメチルグルコピラノシドの濃度が、約０．５ｍＭないし１．０ｍＭである請求項１９に記載の方法。
- 炭素源からシキミ酸を生産することができる形質転換細胞を生産するために、宿主細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、前記形質転換が、
ａ）宿主細胞内で炭素源をシキミ酸に変換できる能力を宿主細胞に与える段階であって、
前記宿主細胞は、芳香族アミノ酸生合成経路における３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、シキミ酸脱水素酵素、および３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする組換え遺伝子を含む、段階と、
ｂ）宿主細胞の経路で、シキミ酸からシキミ酸−３−リン酸の変換を阻害する段階であって、
前記宿主細胞は、当該宿主細胞におけるシキミ酸キナーゼ活性の、変異による欠失、阻害または減少をさらに含む、段階と
を含む方法により調整された形質転換細胞。 - 炭素源の存在下で、請求項２１の形質転換細胞を培養することを含む、炭素源からシキミ酸を生産する方法。
- 炭素源からシキミ酸を合成する方法であって、芳香族アミノ酸や他の芳香族分子によるフィードバック阻害に抵抗性のある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロネート−７−リン酸シンターゼのアイソザイム、３−デヒドロキニン酸シンターゼ、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼ、及びシキミ酸脱水素酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を含む組換え大腸菌を用いて、炭素源をシキミ酸に変換すること、および、シキミ酸対キニン酸のモル比を制御する環境において、前記大腸菌を炭素源の存在下で培養すること、を含む方法であり、
シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子が、全体あるいは一部分で欠失しているか、または変異を起こしていて、それにより、シキミ酸キナーゼ活性を消失させているか、阻害しているか、あるいは減少させていることを特徴とする方法。 - さらに、aroＬ及びaroＫ遺伝子が欠失しているか、変異しているか、あるいは発現レベルが低下しているかを含む請求項２３に記載の方法。
- 組換え大腸菌が、
ａ）serA遺伝子座に挿入されたaroBカセットと、
ｂ）変異を起こしたaroLとaroK遺伝子座と、
ｃ）aroE、aroFFBR、serA遺伝子のインサートを含むプラスミドと
を含む請求項２３に記載の方法。 - 前記プラスミドがaroFFBR、serA、およびaroEをコードする組換えＤＮＡを含むpKD12.112である請求項２５に記載の方法。
- 組換え大腸菌がＡＴＣＣ識別番号９８９０５によって同定される大腸菌である請求項２３に記載の方法。
- ＡＴＣＣ識別番号９８９０５によって同定される大腸菌SP1.1/pKD12.112。
- ＡＴＣＣ識別番号９８９０３によって同定される大腸菌SP2.1/pKD12.112。
- ＡＴＣＣ識別番号２０７０５５によって同定される大腸菌SP1.1/pKD12.138。
- ＡＴＣＣ識別番号２０７０５４によって同定される大腸菌SP2.1/pKD12.138。
- 前記炭素源がグルコースであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- シキミ酸のキニン酸に対する平衡を減少させることが、Ｋｃ値により表わされる比例−積分−微分制御の利得を増加させることを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記生合成経路は、aroB、aroE、およびaroF遺伝子によりコードされる酵素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記aroB、aroE、およびaroF遺伝子が、野生型遺伝子であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
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- 2000-09-30 US US09/676,609 patent/US6472169B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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