CN114410703A

CN114410703A - 一种微生物发酵生产色氨酸的方法及应用

Info

Publication number: CN114410703A
Application number: CN202210116152.2A
Authority: CN
Inventors: 邹季虹
Original assignee: Nanjing Shoubai Biotech Co
Current assignee: Nanjing Shoubai Biotech Co
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明公开了通过微生物发酵生产色氨酸的方法。该方法主要通过提高微生物中磷酸解酮酶的作用，以更高效率和更高产量生产色氨酸。

Description

一种微生物发酵生产色氨酸的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产色氨酸基因工程大肠杆菌菌株及其构建方法，以及使用该菌株发酵生产色氨酸的方法。本发明还涉及用于从发酵过程中回收色氨酸的方法。属于医药、食品和饲料领域。

背景技术

色氨酸，又名β-吲哚-α-氨基丙酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。色氨酸有三种光学异构体，L-色氨酸呈绢丝光泽、六角片状白色晶体，无臭，有甜味。L-色氨酸在水中溶解度低(1.14g/l，25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中易分解。L-色氨酸微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

色氨酸具有重要的生理作用。在生物体内，从L-色氨酸出发可合成激素、色素、生物碱、辅酶和多种生理活性物质。在临床上常用作氨基酸输液、抗闷剂、抗臭滤药，调节脑代谢等。新近的研究报导，L-色氨酸在体内能在维生素B₆参与下，生成神经荷尔蒙的前体5-羟基色胺，从而促进睡眠和精神安定，可用作保健食品和安神药。

色氨酸的生产方法，最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是随着研究的不断深入，微生物法生产色氨酸的方法已经走向实用，并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法、酶法，以及将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸。

(1)微生物转化法：亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。同时可以筛选前体物的抗性突变株来提高前体物的添加量。微生物转化法的缺点是，当转化液中前体物浓度较高时，转化率下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。

(2)酶法：酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双酶菌法和单酶菌法两种类型。该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所需的酶固定化后再使用，一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段组成。例如，利用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单孢菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和DL-丝氨酸为底物；或者利用黄杆菌的酶系，以DL-5-吲哚甲基乙丙酚脲为底物，同时在反应液中加入适量的苯肼或野芝麻花碱以抑制色氨酸氧化酶的活性而阻止色氨酸的降解。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，但生产成本高。

(3)直接发酵法：该法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。对这种方法的研究比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物，若想进一步提高色氨酸的积累量就必需设法增强合成这些前体物的代谢流。另一方面，色氨酸生物合成途径中的调控机制比较复杂，除了反馈调节这一粗调系统之外，还存在着细调系统－弱化子系统。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。采用微生物直接发酵法生产L-色氨酸，显著优于微生物转化法和酶法，生产成本低廉，具有显著的优势。

在微生物以葡萄糖作为碳源的分解代谢过程中，磷酸解酮酶(phosphoketolase)催化果糖-6磷酸生成4-磷酸-赤藓糖和乙酰磷酸，以及催化5-磷酸-木酮糖生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛，生成的乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环。这一代谢支路避免糖酵解途径中由丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A时释放的一分子CO₂，可以提高葡萄糖的利用率。

由于磷酸乙酮醇酶途径仅发生在双歧杆菌糖代谢，在大肠杆菌中是不存在的。可在大肠杆菌等微生物中引入该途径，用以绕过由丙酮酸转化为乙酰CoA的途径，避免了丙酮酸转化为乙酰CoA时释放CO₂而产生的碳损失，也即葡萄糖的损失，提高下游产品的得率。

发明内容

本发明针对色氨酸的代谢途径，采用新的遗传修饰方法改造微生物，并利用该微生物以更高效率和更高产量生产色氨酸。

具体而言，本发明通过提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase)的作用，新建磷酸乙酮醇酶途径，增加4-磷酸-赤藓糖代谢流，同时产生的乙酰磷酸进入三羧酸循环充分利用，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产色氨酸。

根据本发明的一个实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产色氨酸的方法，该方法包括：

A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase，xfp)作用的遗传修饰；和

B)收集从培养步骤A)中产生的色氨酸。

在本发明中，提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸解酮酶的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸解酮酶被过量表达；

本领域技术人员可以理解，为提高微生物中磷酸解酮酶的作用，可以通过筛选编码具有磷酸解酮酶的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选xfp基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中xfp的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达xfp来实现。

在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。

在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码磷酸解酮酶的核酸序列的重组核酸分子转化。

在一个方面，编码磷酸解酮酶的核酸序列含有至少一种增加磷酸解酮酶的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的下述位置处的取代中的一种或多种：第178位半胱氨酸被丝氨酸取代、第343位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第482位半胱氨酸被酪氨酸取代；更优选，编码磷酸解酮酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

在另一个方面，所述的磷酸解酮酶具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的磷酸解酮酶具有酶活性；进一步优选，所述的磷酸解酮酶具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

在另一个方面，重组核酸分子中编码磷酸解酮酶的基因拷贝数增加。

在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。

在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。

在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。

在上述任意实施方案的一个方面中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的，包括但不限于被乳糖诱导。例如，通过在培养液中添加乳糖等可实现被乳糖诱导表达。

本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规发酵培养基。在一个方面中，发酵培养基中包含碳源。在另一个方面中，发酵培养基中包含氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源和氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种碳源均可用于本发明，包括有机碳源和/或无机碳源。优选，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种。优选，碳源的浓度维持在约0.1％-约5％。本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种氮源均可用于本发明，包括有机氮源和/或无机氮源。优选，氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种。

优选，本发明采用补料发酵法。根据本发明的一个方面，补糖液包含葡萄糖，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)。

在优选的实施方案中，在约20℃-约45℃进行所述培养步骤，进一步优选，在约33℃-约37℃进行所述培养步骤。

在优选的实施方案中，在约pH4.5-约pH8.5进行所述培养步骤。进一步优选，在约pH6.7-pH7.2进行所述培养步骤。

本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规方法收集色氨酸。优选，可以从发酵培养基中的胞外产物中收集色氨酸。进一步优选，该收集步骤包括选自如下的步骤：(a)从去除微生物的发酵液中沉淀色氨酸；和/或(b)从去除微生物的发酵液中结晶色氨酸。

根据本发明，收集步骤进一步包括将发酵液脱色的步骤。脱色步骤可以包括但不限于在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行，脱色包括活性炭处理和/或色谱脱色。所述色谱脱色包括使所述发酵液与离子交换树脂接触的步骤，离子交换树脂包括但不限于阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂，例如使发酵液与阴离子和阳离子交换树脂的混合床接触。

在本发明中，微生物可以是任意的微生物(例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物)。在优选的实施方案中，微生物包括但不限于细菌、酵母或真菌。优选，所述的微生物选自细菌或酵母。进一步优选，细菌包括但不限于选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌；更优选，细菌包括但不限于选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。进一步优选，酵母包括但不限于选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属(Phaffia)的酵母；更优选，酵母包括但不限于选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。优选，所述的微生物为真菌；进一步优选，真菌包括但不限于选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌；更优选，真菌包括但不限于选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W，最优选K-12。尽管大肠杆菌作为优选的微生物且用作本发明各种实施方案的实例，但是应理解在本发明方法中可以使用产生色氨酸且可以通过遗传修饰以提高色氨酸产量的任意其它微生物。用于本发明的微生物也可以称作生产生物体。

在本发明中，术语色氨酸均指L-色氨酸。术语L-色氨酸可以称作β-吲哚基丙氨酸、α-氨基吲哚基丙酸。术语L-色氨酸可以分别缩写为L-trp。

术语提高微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性增加和/或该酶被过量表达，从而提高了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。

术语降低微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性降低和/或该酶的表达减少，从而降低了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。

术语酶活性增加是指酶催化一定化学反应的能力增加。其涵盖了在酶受产物抑制作用和酶对底物亲合力不变的情况下酶自身催化化学反应的能力增加，和/或由于酶受产物抑制作用降低导致和/或酶对底物亲合力增加所导致的酶催化化学反应的能力增加。术语酶受产物抑制作用降低是指催化反应的酶的活性受其终产物特异抑制作用而降低。术语酶对底物亲合力增加是指酶对所催化的底物的亲合力增加。

图1以大肠杆菌为例解释了本发明公开的用于大规模生产色氨酸代谢途经中遗传修饰的主要方面。就图1而言，粗体箭头表示本发明涉及的通过遗传改造产生和/或增加代谢流量。图1公开了用于合成色氨酸的不同方法，包括对Xfp的修饰。本领域技术人员可以理解，其它微生物具有类似的糖代谢途经，且在这类途经中基因和蛋白质具有类似的结构和功能。因此，本发明所讨论的除适用于大肠杆菌外同样适用于其它微生物且其它微生物显然包括在本发明中。

本领域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名称，这取决于该酶来源于什么样的微生物。下面是本文涉及的许多酶的可选名称和来自一些生物体的编码这类酶的具体基因名称。这些酶的名称可以互换使用或如果合适用于给定的序列或生物体，但本发明意图包括来自任意生物体的指定功能的酶。

例如，本文一般称作“磷酸解酮酶”的酶，即指6-磷酸-果糖/5-磷酸-木酮糖磷酸酮醇酶，或木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶，催化果糖-6磷酸生成4-磷酸-赤藓糖和乙酰磷酸，以及催化5-磷酸-木酮糖生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛，生成的乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环。来自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的木酮糖5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(xylulose 5-phosphatefructose 6-phosphatephosphoketolase)一般称作xfp。来自各种生物体的磷酸解酮酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自短双歧杆菌的磷酸酮醇酶具有由SEQ IDNO:1表示的氨基酸序列。

“Trc启动子”经过巧妙的设计可用于原核表达，例如大肠杆菌表达系统。Trc启动子是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了的Trcpromoter具有SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列。

本发明的有益效果在于：本发明证实可通过微生物引入双歧杆菌5-磷酸-木酮糖/6-磷酸-果糖磷酸解酮酶，新建磷酸乙酮醇酶途径，增加4-磷酸-赤藓糖代谢流，同时产生的乙酰磷酸进入三羧酸循环充分利用，以此来提供色氨酸生产产量。

将本文引述或描述的各公开文献和参考文献的全部内容引入本文作为参考。

附图说明

图1为大肠杆菌中色氨酸生物合成途径与改造策略图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，实施例中使用的原料和试剂均为市售商品。

实施例1

本实施例描述了磷酸解酮酶(Xfp)的基因Xfp的克隆、Xfp/pTrc99A质粒转化亲本菌株，及其对色氨酸产量的影响。

所述亲本菌株SAS-01是先前构建的色氨酸菌株，属于大肠杆菌K-12衍生株，具有一定的色氨酸生产能力。通过扩增Bifidobacterium breve Xfp(Xylulose 5-phosphatefructose 6-phosphate phosphoketolase，6-磷酸-果糖/5-磷酸-木酮糖磷酸酮醇酶，简称磷酸解酮酶)的基因Xfp，置于Trc启动子控制下转化菌种，使之过量表达，期望增加4-磷酸-赤藓糖代谢流，同时产生的乙酰磷酸进入三羧酸循环充分利用。

1、短双歧杆菌Xfp基因的克隆与重组菌制备

根据NCBI查找GU936109.1，获得Bifidobacterium breve Xfp基因氨基酸序列SEQID NO：1。按大肠杆菌偏爱碱基密码子进行碱基优化，其核酸序列SEQ ID NO：2。将SEQ IDNO：2基因合成，并在5’端装入Nco I酶切点序列，在3’端装入HindIII酶切点序列，与pUC57-T载体连接并测序鉴定，获得Xfp/pUC57。

1)重组质粒制备：质粒用NcoI和HindIII酶切质粒Xfp/pUC57和载体pTrc99A，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收Xfp片段和pTrc99A片段，用T4 DNA连接酶，16℃将连接过夜，并鉴定，得到Xfp/pTrc99A质粒。

2)感受态制备：首先，将保存于-20℃的产色氨酸亲本菌株SAS-01冻存菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。

3)质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl Xfp/pTrc99A质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。得到重组菌Xfp/pTrc99A，命名为：SAS-02。

2、重组菌Xfp/pTrc99A摇瓶发酵试验与产物测定

1)发酵培养液制备

5×M9培养基配制：将在约800ml双蒸水(ddH₂O)中加入64g Na₂HPO₄·7H2O、15gKH₂PO₄、2.5g NaCl、5.0g NH₄Cl，溶解后，加水至1000ml。121℃灭菌30分钟。再分别配制1MMgSO₄、1M CaCl₂、20％葡萄糖，并单独灭菌。然后按表1配制M9培养液，其中，1000×微量元素溶液按表2配制。

表1.M9培养液成分

表2. 1000×微量元素溶液成分

成分	用量(g/L)
		CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.01
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.01
		MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.033
Fe SO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.50
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.38
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.01
		NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.01
pH	3

2)将重组菌Xfp/pTrc99A(SAS-02)和对照亲本菌株(SAS-01)，做摇瓶发酵试验。

取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。LB液体培养基成分：5g/l酵母粉,10g/l蛋白胨,10g/l NaCl。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定色氨酸含量。

3)色氨酸含量的HPLC法测定

①仪器与用具：

高效液相色谱仪：具有可见波长紫外检测器；

色谱柱：150mm×4.6mm不锈钢柱，内装十八烷基硅烷键合硅胶填充物，5um；

微量进样器：100μl

②色谱条件：

流动相：称取1.327g磷酸氢二钠溶解于850ml纯化水，加0.5ml乙酸，混匀，再加150ml甲醇。过滤，超声脱气；

柱温：36℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：278nm；

进样量：20μl；

走纸时间：主峰保留时间的2倍以上。

③测定步骤：

标样溶液的配制：称取标准品约15mg(精确至0.01mg)于100ml容量瓶中，用新煮沸并冷却至室温的纯化水加水超声溶解，放冷用水稀释至刻度。

试样溶液的制备：30小时之前样品用1ml吸管吸取1ml至100ml容量瓶，用纯化水溶解并定容，摇匀，过滤。30小时之后的样品，整瓶倒入500或1000ml烧杯，加热水1-3倍(根据样品浓度调整),用磷酸调pH至3.0，玻璃棒搅拌均匀，从中用1ml吸管吸取1ml至100ml容量瓶，用纯化水溶解并定容，摇匀，过滤。

测定：在上述条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准溶液，直至相邻两针标准溶液色谱图中L-色氨酸峰面积相对变化小于1.5％时，进试样溶液。记录标准溶液与样品溶液中L-色氨酸峰的峰面积，取两针标准溶液色谱图中L-色氨酸峰面积平均值，计算含量。对L-色氨酸样品进行测定双样，两次测定结果相对误差应≤2.0％。

4、Xfp/pTrc99A质粒转化对摇瓶发酵色氨酸产量的影响

摇瓶发酵产量情况见表3。结果表明：对照亲本菌株(SAS-01)产量较低，而Xfp基因在Trc启动子控制下过量表达的重组菌株Xfp/pTrc99A(SAS-02)产量明显提高。

表3.重组菌Xfp/pTrc99A(SAS-02)摇瓶发酵产量

菌种	色氨酸(g/L)
		Xfp/pTrc99A(SAS-02)	6.8±0.4
对照亲本菌株(SAS-01)	4.8±0.3

实施例2

本实施例描述筛选突变的磷酸解酮酶的基因，所述基因编码酶活性增加的磷酸解酮酶。

为了进一步提高生产菌株中的色氨酸合成量，筛选编码具有酶活性增加的磷酸解酮酶的基因突变体。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因，以便在PCR产物中得到高频突变。

具体操作过程如下：

1.易错PCR扩增短双歧杆菌磷酸解酮酶基因Xfp

利用Taq DNA聚合酶不具有3'-5'校对功能的性质，在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中，dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L；dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库；模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。

易错PCR反应体系(50μl)：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，MgCl₂(2.5mM)5μl，正向引物(Xfp-F，SEQ ID NO:5)1μl，反向引物(Xfp-R，SEQ ID NO:6)1μl，DNA模板(Xfp/pUC57)0.1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，ddH₂O 32.4μl。

PCR程序：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45个循环；最后75℃延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物(产物大小：0.9kb)；取5μl产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

2.构建磷酸解酮酶的基因突变体库

将上述PCR产物经限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切消化后，与用Nco I和Hind III内切酶消化的pTrc99A质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌SAS-01，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。

3.筛选高酶活突变体

从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆约3000株，以野生型Xfp/pTrc99A(SAS-02)为对照，分别接种至含50μg/mL青霉素(Amp)的5ml LB培养基中，37℃、150rpm培养18h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4℃下重悬于1ml PBS(pH值7.5，10mmol/L)溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min，离心取上清作为酶粗提液，进行酶活测定。

磷酸解酮酶(Xfp)的活性检测：以底物6-磷酸-果糖减少为测定标记。酶活单位定义：在酶促反应条件下，每分钟减少相当于1μmol 6-磷酸-果糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位(IU)。具体操作如下：以5ml反应体系为酶活测定体系，其中含500mmol/L 6-磷酸-果糖、5mmol/L葡萄糖、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)及100μl粗酶液。酶活反应在37℃水浴中进行，保温4h，然后将酶解液在70℃下10min终止反应。3000rpm离心10min，取上清液。HPLC测定6-磷酸-果糖、4-磷酸-赤藓糖含量。

结果表明：最高突变体菌株的酶活为46.5IU/ml，对照菌株的酶活为11.7IU/ml。通过易错PCR对Xfp进行改造，获得酶活力提高约5倍的突变株。挑选该酶活性最高的突变体菌株，提取质粒测序。结果表明：该磷酸解酮酶突变体基因序列如SEQ ID NO:3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。与野生型的磷酸解酮酶基因序列比对，共发生了3处碱基点突变：532T/A，870C/T，1445G/A；致氨基酸3处错义突变，其突变点分别为：C178(第178位半胱氨酸变为丝氨酸)，S343F(第343位丝氨酸变为苯丙氨酸)，C482Y(第482位半胱氨酸变为酪氨酸)。将该突变基因命名为XfpM。重组菌XfpM/pTrc99A，命名为：SAS-03。

4.XfpM/pTrc99A质粒转化对摇瓶发酵色氨酸产量的影响

将重组菌XfpM/pTrc99A(SAS-03)与重组菌Xfp/pTrc99A(SAS-02)、对照亲本菌株(SAS-01)，做摇瓶发酵试验。

取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD₆₀₀约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0，根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定色氨酸含量。

摇瓶发酵产量情况见表4。结果表明：对照菌种SAS-01产量低，突变的pTrc-XfpM重组菌SAS-03产量明显提高，且较未突变的对照菌种SAS-02产量亦有明显提高。

表4.pTrc-XfpM重组菌摇瓶发酵产量

菌种	色氨酸产量(g/L)
		XfpM/pTrc99A(SAS-03)	8.9±0.4
Xfp/pTrc99A(SAS-02)	6.7±0.3
		对照亲本菌株(SAS-01)	4.6±0.3

以上结果显示：不仅磷酸解酮酶超表达可明显提高色氨酸产量，通过易错PCR技术筛选突变体也可大大提高色氨酸产量，这应该是由于所获得的该激酶突变体酶活性增加所致。

实施例3

本实施例描述色氨酸分离纯化后处理工艺。

将重组菌XfpM/pTrc99A(SAS-03)在12M³发酵罐按常规工艺发酵。发酵结束后，产物分离纯化工艺具体如下：

1、发酵液用旋流分离器分离。获得的晶体乳浆先调碱溶解，再调酸、结晶，结晶烘干即为色氨酸。

2、结晶母液加入前面旋流分离产生的母液，用陶瓷膜过滤。絮凝沉淀，板框压滤。菌渣烘干。

3、陶瓷膜过滤或板框压滤产生的母液经三效浓缩、结晶，离心。

4、结晶乳浆先调碱溶解，再调酸、结晶，结晶烘干即为色氨酸。母液套用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 南京寿柏生物科技有限公司

<120> 一种微生物发酵生产色氨酸的方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

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1 5 10 15

Val Ser Glu Glu Ala Ile Glu Gly Met Asp Lys Tyr Trp Arg Val Thr

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245 250 255

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Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Glu His Phe Glu Val

325 330 335

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340 345 350

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530 535 540

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565 570 575

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<210> 2

<211> 2475

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

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Claims

1.一种通过微生物发酵生产色氨酸的方法，该方法包括：

A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase)作用的遗传修饰；和

B)收集从培养步骤A)中产生的色氨酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中，提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸解酮酶的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸解酮酶被过量表达；

优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。

3.如权利要求2所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码磷酸解酮酶的核酸序列的重组核酸分子转化；

优选，编码磷酸解酮酶的核酸序列含有至少一种增加磷酸解酮酶的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的下述位置处的取代中的一种或多种：第178位半胱氨酸被丝氨酸取代、第343位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第482位半胱氨酸被酪氨酸取代；更优选，编码磷酸解酮酶的核酸序列为SEQ ID NO：3；

优选，所述的磷酸解酮酶具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的磷酸解酮酶具有酶活性；进一步优选，所述的磷酸解酮酶具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

进一步优选，重组核酸分子中编码磷酸解酮酶的基因拷贝数增加；

进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。

4.如权利要求2所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的；优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤A)在约20℃-约45℃进行；优选，在约33℃-约37℃进行；

优选，所述培养步骤A)在约pH4.5-约pH8.5进行；优选在约pH6.7-约pH7.2进行；

优选，所述培养步骤A)采用常规发酵培养基；

进一步优选，发酵培养基中包含碳源；进一步优选，发酵培养基中包含氮源；进一步优选，发酵培养基中包含碳源和氮源；进一步优选，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐；

更进一步优选，各种碳源包括有机碳源和/或无机碳源；优选，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种；优选，碳源的浓度维持在约0.1％-约5％；更进一步优选，各种氮源包括有机氮源和/或无机氮源；优选，氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种；

优选，所述培养步骤A)采用补料发酵法；

进一步优选，补糖液包含葡萄糖，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述收集步骤B)包括(a)从去除微生物的发酵液中沉淀色氨酸；和/或(b)从去除微生物的发酵液中结晶色氨酸；

优选，所述收集步骤B)进一步包括将发酵液脱色的步骤；进一步优选，所述脱色步骤在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行；更优选，所述脱色步骤包括活性炭处理和/或色谱脱色。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法或者任一项所述的微生物，其中，所述微生物为细菌、酵母或真菌；

优选，所述的微生物选自细菌或酵母；

进一步优选，细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌；进一步优选，细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌；更优选，细菌为大肠杆菌；更进一步优选，大肠杆菌选自K-12、B和W菌株；最优选大肠杆菌为K-12菌株；

进一步优选，酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属(Phaffia)的酵母；更优选，酵母包括但不限于选自酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)；

优选，所述的微生物为真菌；进一步优选，真菌选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌；更优选，真菌选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。

10.一种具有更高酶活性的磷酸解酮酶(Xfp)，所述酶具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

11.一种编码如权利要求10所述磷酸解酮酶(Xfp)的核酸分子，所述核酸分子具有SEQID NO：3所示的核酸序列。

12.一种包含如权利要求11所述核酸分子的载体。

13.一种包含如权利要求12所述载体的微生物。

14.一种基因组中包含如权利要求11所述核酸分子的微生物。