CN111471638A - 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用 - Google Patents

一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用 Download PDF

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Abstract

发明公开了一株产L‑高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用，属于发酵工程技术领域。本发明以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，敲除调控蛋白McbR、高丝氨酸激酶、转运蛋白MetD、磷酸烯醇丙酮酸羧激；下调表达异柠檬酸脱氢酶；过表达转运蛋白BrnFE、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶；并且提高天冬氨酸激酶、丙酮酸羧化酶以及来源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶I的表达。所述突变株摇瓶培养48h，L‑高丝氨酸的产量可达到8.8g/L。

Description

一株产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
技术领域
本发明涉及一株产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用，属于发酵工程技术领域。
背景技术
作为一种四碳氨基酸，L-高丝氨酸是一种有潜力的平台化合物，用于合成甲硫氨酸、γ-丁内酯(γ-butyrolactone)等化合物。虽然L-高丝氨酸不是蛋白合成氨基酸，但是它可以是一些重要含硫化合物的前体(L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸)，而L-甲硫氨酸已经广泛应用于食品、医药、动物饲料等领域。因为L-甲硫氨酸的生物合成受到很强的调控，工业合成方式主要是酶转化法与化学合成的结合。对于酶转化法，O-乙酰-L-高丝氨酸可以作为前体，与甲硫醇通过酶转化形成L-甲硫氨酸；对于化学合成法，L-高丝氨酸可以作为前体，先通过HCl的活化，然后再与甲硫醇通过化学合成形成L-甲硫氨酸。因此，作为一种潜在的平台化合物，L-高丝氨酸的市场与应用将会不断地提高。
L-天冬氨酸是L-高丝氨酸的前体，具体的途径是：葡萄糖经过糖酵解形成丙酮酸，丙酮酸经过丙酮酸羧化酶(pyc编码)催化形成草酰乙酸，草酰乙酸经过天冬氨酸转氨酶(aspB编码)催化形成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸经过L-天冬氨酸激酶(lysC编码)催化形成L-天冬氨酸-4-磷酸，L-天冬氨酸-4-磷酸经过L-天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)催化形成L-天冬氨酸半醛，L-天冬氨酸半醛经过L-高丝氨酸脱氢酶(hom编码)催化形成L-高丝氨酸。在谷氨酸棒杆菌中进行L-赖氨酸的生产时，丙酮酸羧化酶受L-天冬氨酸的反馈抑制(BeckerJ等From zero to hero-Design-based systems metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicum for L-lysine production，公开日2011年)；在谷氨酸棒杆菌中进行L-蛋氨酸的生产时，L-天冬氨酸激酶受L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制(李莹，基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-蛋氨酸高产菌，公开日2016年)。虽然谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸的主要菌株之一，但是目前还没有相关利用谷氨酸棒杆菌生产L-高丝氨酸的报道，目前主要采用大肠杆菌为生产菌株，但以大肠杆菌作为宿主生产L-高丝氨酸会伴随有大量的乙酸生成(Li et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli W3110for L-homoserine production.Process Biochemistry，公开日2016年)。
而谷氨酸棒杆菌是一种安全的工业微生物，并且能够使用更加廉价的培养基作为原料。因此，谷氨酸棒杆菌展现出很大的潜力用于生产L-高丝氨酸及其衍生物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明构建一株重组菌，从而使得谷氨酸棒杆菌利用葡萄糖为原料进行L-高丝氨酸的生产。
本发明的第一个目的是提供一株谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达天冬氨酸激酶编码基因、丙酮酸羧化酶编码基因以及来源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶I编码基因。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸激酶I编码基因的核苷酸序列如GeneID：945803所示。
在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株。
本发明的第二个目的是提供一种产谷氨酸棒杆菌工程菌，所述工程菌以谷氨酸棒杆菌为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述工程菌敲除了调控蛋白McbR基因(mcbR)、高丝氨酸激酶的编码基因(thrB)、转运蛋白MetD的编码基因(metD)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因(pck)；下调异柠檬酸脱氢酶编码基因(icd)的表达；过表达转运蛋白BrnFE编码基因(brnFE)、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因(asd)、高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom)。
在本发明的一种实施方式中，所述的敲除调控蛋白McbR基因(mcbR)的核苷酸序列如Gene ID：1020883所示；所述高丝氨酸激酶的编码基因基因(thrB)的核苷酸序列如GeneID:1019167所示；所述转运蛋白MetD的编码基因(metD)的核苷酸序列如Gene ID:1019015所示；所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因(pck)的核苷酸序列如Gene ID:1020806所示。
在本发明的一种实施方式中，所述异柠檬酸脱氢酶编码基因(icd)的Gene ID:1018663。
在本发明的一种实施方式中，所述brnFE为NCBI上Gene ID：1021322与Gene ID：1021321形成的基因簇brnFE；所述天冬氨酸激酶编码基因(lysC)的Gene ID：1021294；所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因(asd)的Gene ID：1021315；所述高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom)的Gene ID：1019166；所述丙酮酸羧化酶编码基因(pyc)的Gene ID：1018688。
本发明的第三个目的是提供一种所述产谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，所述方法是将mcbR、thrB、metD、pck进行敲除；下调icd；过表达brnFE、asd、hom、aspC；提高lysC、pyc以及来自于大肠杆菌的thrA的表达强度。
在本发明的一种实施方式中，所述的下调是把icd的起始密码子ATG更换为GTG。
在本发明的一种实施方式中，所述提高lysC的表达强度是将天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸替换成异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述提高pyc的表达强度是将丙酮酸羧化酶第458位的脯氨酸替换成丝氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述提高thrA的表达强度是将天冬氨酸激酶I第345位的丝氨酸替换成苯丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，利用强启动子Psod启动目的基因lysC、pyc。
在本发明的一种实施方式中，利用质粒pEC-XK99E表达基因thrA。
本发明的第四个目的是提供一种生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以所述工程菌为发酵菌株发酵生产L-高丝氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将所述工程菌以葡萄糖为底物，发酵生产L-高丝氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将所述工程菌在OD600为20～30时加入含有葡萄糖的体系中发酵。
在本发明的一种实施方式中，在30～35℃、200～250rpm条件下进行发酵。
本发明还保护所述谷氨酸棒杆菌，或产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，或生产L-高丝氨酸的方法在生物、化学领域制备L-高丝氨酸中的应用。
本发明的有益效果：
本发明对谷氨酸棒杆菌基因组进行改造，通过对L-高丝氨酸代谢途径中的相关基因进行敲除或过表达，从而获得了一株可以生产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，首次实现了在谷氨酸棒杆菌中培养获得L-高丝氨酸，将所述重组菌在以廉价的葡萄糖为底物的体系中培养48h，L-高丝氨酸产量可达到8.8g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
菌株和质粒：
菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(记载于文献Kalinowski J,B Bathe,DBartels,et al.The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genomesequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acidsand vitamins.Journal of Biotechnology,2003,104(1-3):5-25.)。
质粒pK18mobsacB(记载于文献Schafer A,A Tauch,W Jager,et al.Smallmobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coliplasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutamicum.Gene,1994,145(1):69-73.)。
pXMJ19(记载于文献Jakoby M,C E Ngouoto-Nkili and ABurkovski.Construction and application of new Corynebacterium glutamicumvectors.Biotechnol.Techniques,1999,13(6):437-441.)。
菌体浓度的测定：取一定量的菌悬液使用去离子水适当稀释，用UV 7500型可见光分光光度计，于660nm处测定OD值。
葡萄糖的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：LC-20AT高效液相色谱仪(配示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column，流动相：5mMH2SO4，流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样量：10μL，示差折光检测器：检测葡萄糖，样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。
LBHIS培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，D-山梨醇91g/L。加入20g/L琼脂条，以配制LBHIS固体培养基。
种子培养基：25g/L D-葡萄糖，1.25g/L尿素，20g/L玉米浆，1g/L KH2PO4,，and0.5g/L MgSO4，使用氨水调节pH为7.0。
发酵培养基：100g/L D-葡萄糖，20g/L玉米浆，20g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4,，0.01g/L MnSO4·H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，1mg/L维生素B1，6mg/L维生素B6，4mg/L维生素B12，0.025mg/L生物素，使用氨水调节pH为7.0。
电击转化谷氨酸棒杆菌：步骤见秦天宇，代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-甲硫氨酸[D].江南大学,2014。
Gibson组装方式：具体步骤参见Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods,2009,6(5):343-5.
实施例1：菌株Cg01的构建
1、基因敲除质粒的构建
使用限制性内切酶HindIII与BamHI消化质粒pK18mobsacB，得到线性化pK18mobsacB片段；
根据谷氨酸棒杆菌基因组(NCBI登录号为NC_003450.3)，合成核苷酸序列如SEQID NO.1所示的片段mcbR-U；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的片段mcbR-D；通过Gibson组装方式，把mcbR-U、mcbR-D与线性化pK18mobsacB组装得到敲除质粒pK-mcbR；
将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的片段thrB-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的片段thrB-D，通过Gibson组装方式与线性化pK18mobsacB组装得到敲除质粒pK-thrB；
将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的片段metD-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的片段metD-D，通过Gibson组装方式与线性化pK18mobsacB组装得到敲除质粒pK-metD。
2、基因敲除菌株的构建
(1)将所述质粒pK-mcbR电击转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，将转化得到的菌液涂布于含有终浓度为15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落；挑取单菌落于含有终浓度为15μL/mL卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃、220rpm培养12h得到菌液，吸取2μL的菌液涂布于含有100g/L蔗糖的LBHIS培养基的平板中进行筛选，在30℃培养48h，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR。
(2)参照步骤(1)，向正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR中以相同的电击转化法转入质粒pK-thrB，使用同样的筛选方法，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB。
(3)参照步骤(1)，向正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB中以相同的电击转化法转入质粒pK-metD，使用同样的筛选方法，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子为突变菌株Cg01。
实施例2：菌株Cg03的构建
1、质粒的构建
使用限制性内切酶Hind III与BamH I消化质粒pK18mobsacB，得到线性化pK18mobsacB片段；
将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的片段lysC(P)-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的片段lysC(P)-D、以及核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的片段Psod，通过Gibson组装方式，与线性化pK18mobsacB组装得到表达质粒pK-lysC(P)；
将核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的片段hom(P)-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的片段hom(P)-D和Psod，通过Gibson组装方式，与线性化pK18mobsacB组装得到过表达质粒pK-hom(P)；
使用引物lysC(m)-U-R与lysC(m)-D-F对质粒pK-lysC(P)通过PCR进行定点突变，将天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸替换成异亮氨酸，得到质粒pK-lysC(Pm)；
lysC(m)-U-R：CAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGC(SEQ ID NO.23)；
lysC(m)-D-F：ACCGACATCATCTTCACCTGCCCTC(SEQ ID NO.24)。
2、菌株的构建
(1)将所述质粒pK-lysC(Pm)电击转化至Cg01，将转化得到的菌液涂布于含有15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落；挑取单菌落于含有15μL/mL卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃、220rpm培养12h得到菌液，吸取2μL的菌液涂布于含有100g/L蔗糖的LBHIS培养基的平板中进行筛选，在30℃培养48h，挑取单菌落测序验证，得到正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB,Psod-lysCT311I。
(2)参照步骤(1)，向正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB,Psod-lysC中以相同的电击转化法转入质粒pK-asd(P)，使用同样的筛选方法，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB,Psod-lysCT311I,Psod-asd。
(3)参照步骤(1)，向正确的转化子ATCC13032,ΔmcbR,ΔthrB,Psod-lysC,Psod-asd中以相同的电击转化法转入质粒pK-hom(P)，使用同样的筛选方法，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子Cg03(ATCC 13032,ΔmcbR,ΔthrB,ΔmetD,Psod-lysCT311I,Psod-asd,Psod-hom)。
实施例3：菌株Cg04的构建
1、质粒的构建
使用限制性内切酶Hind III与BamH I消化质粒pK18mobsacB，得到线性化pK18mobsacB片段；
通过Gibson组装方式将核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的片段pyc(P)-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的片段pyc(P)-D、片段Psod与线性化pK18mobsacB组装得到表达质粒pK-pyc(P)；
通过Gibson组装方式将核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的片段aspC(P)-U、核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的片段aspC(P)-D、片段Psod、核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的片段aspC与线性化pK18mobsacB组装得到表达质粒pK-aspC(P)；
使用引物pyc(m)-F与pyc(m)-F对质粒pK-pyc(P)进行定点突变，将丙酮酸羧化酶第458位的脯氨酸替换成丝氨酸，得到过表达质粒pK-pyc(Pm)。
pyc(m)-F：TGCCGATCACTCGCACCTCCTTCAGGCTC(SEQ ID NO.25)，
pyc(m)-R：GGAGGTGCGAGTGATCGGCAATGAATCCG(SEQ ID NO.26)。
2、菌株的构建
(1)将所述质粒pK-pyc(Pm)电击转化实施例2中得到的Cg03，将转化得到的菌液涂布于含有15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落；挑取单菌落于含有15μL/mL卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃、220rpm培养12h得到菌液，吸取2μL的菌液涂布于含有100g/L蔗糖的LBHIS培养基的平板中进行筛选，在30℃培养48h，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子Cg03,Psod-pycP458S。
(2)参照步骤(1)，向正确的转化子Cg03:Psod-pycP458S中以相同的电击转化法转入质粒pK-aspC(P)(将aspC基因整合至pck基因的位点上，将aspC基因破坏)，使用同样的筛选方法，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子Cg04(ATCC 13032,ΔmcbR,ΔthrB,ΔmetD,Psod-lysCT311I,Psod-asd,Psod-hom,Psod-pycP458S,Δpck::Psod-aspC)。
实施例4：菌株Cg06的构建
1、过表达质粒的构建
将核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的片段brnFE(P)-U、核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示的brnFE(P)-D、Psod片段，通过Gibson组装方式与线性化pK18mobsacB组装得到过表达质粒pK-brnFE(P)。
2、基因过表达菌株的构建
将所述质粒pK-brnFE(P)电击转化至实施例3中得到的Cg04，将转化得到的菌液涂布于含有终浓度为15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落；挑取单菌落于含有终浓度为15μL/mL卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃、220rpm培养12h得到菌液，吸取2μL的菌液涂布于含有100g/L蔗糖的LBHIS培养基的平板中进行反筛，在30℃培养48h，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子Cg06。
实施例5：菌株Cg09的构建
1、下调质粒的构建
将核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的片段icd(AG)-U、核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示的icd(AG)-D，通过Gibson组装方式与线性化pK18mobsacB组装得到下调质粒pK-icd(AG)。
2、icd基因下调菌株的构建
将pK-icd(AG)电击转化至突变菌株实施例4构建得到的Cg06，将转化得到的菌液涂布于含有15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落；挑取单菌落于含有15μL/mL卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃、220rpm培养12h得到菌液，吸取2μL的菌液涂布于含有100g/L蔗糖的LBHIS培养基的平板中进行反筛，在30℃培养48h，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子为Cg09。
实施例6：菌株Cg09-1的构建
1、异源表达大肠thrA质粒的构建
根据大肠杆菌K12-MG1655基因，利用引物thrA(m)-F和thrA(m)-R扩增得到thrA定点突变的片段thrA(m)-U(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)、thrA(m)-D(核苷酸序列如SEQID NO.22所示)；以质粒pEC-XK99E(NCBI登陆号为AY219683.1)为模板，使用引物XK99E-JBS-F与XK99E-JBS-R将质粒pEC-XK99E线性化；通过Gibson组装方式把thrA(m)-U、thrA(m)-D、线性化pEC-XK99E组装得到异源表达质粒pEC-thrAS345F_Ec。
thrA(m)-F：CACGCGCCCGTATTTTCGTGGTGCTGATTACGCAATC(SEQ ID NO.27)；
thrA(m)-R：TAATCAGCACCACGAAAATACGGGCGCGTGACATC(SEQ ID NO.28)；
XK99E-JBS-F：GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG(SEQ ID NO.29)；
XK99E-JBS-R：TACTAGTCTCCTTCTGAATTCCATGGTCTGTTTCCTGT(SEQ ID NO.30)。
2、重组菌株的转化及筛选
将异源表达质粒pEC-thrAS345F_Ec电击转化至突变菌株Cg09，将转化得到的菌液涂布于含有终浓度为15μL/mL的卡那霉素的LBHIS培养基中，在30℃进行培养，至长出单菌落，挑取单菌落进行验证，得到正确的转化子为Cg09-1。
表2实施例1～6构建的突变株
Figure BDA0002503437820000081
注：在基因组上，基因asd在基因lysC的下游，并共用一个启动子，当基因lysC的启动子更换为Psod时，基因asd的启动子也更换为Psod。
实施例7：突变株发酵实验
将实施例1～6制备得到的重组菌株和含有空质粒pEC-XK99E的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的单菌落于种子培养基上进行活化，培养20h得到OD600为25的种子液，将种子液以4％的接种量接种到装有30mL发酵培养基的250mL中，于30℃、220rpm条件下进行发酵培养，20g/L的碳酸钙被添加来缓冲发酵过程中的pH，维持pH在6.5～7.5。发酵48h，重组菌株的L-高丝氨酸产量如表3所示，产量可达8.8g/L。
表3突变株发酵结果
Figure BDA0002503437820000082
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggcgcttaa atcgagaaat taggccatca ccttttaata acaatacaat gaataattgg 60
aataggtcga cacctttgga gcggagccgg ttaaaattgg cagcattcac cgaaagaaaa 120
ggagaaccac atgcttgccc taggttggat tacatggatc attattggtg gtctagctgg 180
ttggattgcc tccaagatta aaggcactga tgctcagcaa ggaattttgc tgaacatagt 240
cgtcggtatt atcggtggtt tgttaggcgg ctggctgctt ggaatcttcg gagtggatgt 300
tgccggtggc ggcttgatct tcagcttcat cacatgtctg attggtgctg tcattttgct 360
gacgatcgtg cagttcttca ctcggaagaa gtaatctgct ttaaatccgt agggcctgtt 420
gatatttcga tatcaacagg ccttttggtc attttggggt ggaaaaagcg ctagacttgc 480
ctgtggatta aaactatacg aaccggtttg tctatattgg tgttagacag ttcgtcgtat 540
cttgaaacag accaacccga aaggac 566
<210> 2
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacatcagt cctcttgaga cggctcgcga tttggctcgg cagttgttgt cggctccacc 60
tgcggactac tcaatttagt ttcttcattt tccgaagggg tatcttcgtt gggggaggcg 120
tcgataagcc ccttcttttt agctttaacc tcagcgcgac gctgctttaa gcgctgcatg 180
gcggcgcggt tcatttcacg ttgcgtttcg cgcctcttgt tcgcgatttc tttgcgggcc 240
tgttttgctt cgttgatttc ggcagtacgg gttttggtga gttccacgtt tgttgcgtga 300
agcgttgagg cgttccatgg ggtgagaatc atcagggcgc ggtttttgcg tcgtgtccac 360
aggaagatgc gcttttcttt ttgttttgcg cggtagatgt cgcgctgctc taggtggtgc 420
actttgaaat cgtcggtaag tgggtatttg cgttccaaaa tgaccatcat gatgattgtt 480
tggaggagcg tccacaggtt gttgctgacc caatagagtg cgattgctgt ggggaatggt 540
cctgtgaggc caagggacag tgggaagatc 570
<210> 3
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacgcccctc cctcatcttc caaacacgcg tccccgacaa ccgcgctgtc gccaaagaat 60
acatcaccct gatcgaactc atggccaaca tgctcggcga tgtcgacgat gacgcaatgc 120
acaaccccga cctccgcgcc aaagcacttt ccatcggaac ccagtgggca cacgtcatgg 180
gcattaacca cgccgaagcc gaagaactcg acgaagccct ctccccgctc attaaccgcc 240
tccgcgaaat gggctttgac cccaccgaaa ccgaagaagc aaactccctc gctctacaca 300
gctgcccatt tgtggtcaac gacaaacgcc catcagcctt cgtctgcgcc atccacgccg 360
gattcatcca agaaagcctc ggtgaaaaca accgcatcca gctggaactc aaaccactca 420
acgcgccggg cacctgtaag gttcacgtgt tcagcgaata attgctgcac taataaggcc 480
cccttcttga ttcgaagggg gccttccttg ttgggcctaa ggttggttaa cttcaacctt 540
gactggtccc gcaacctcaa gctcaagcac cttaatgcca gactcacgag catcttccaa 600
aaccttgtct ggaattggct cagtggacag caccatggcg gttgggccgg caccggaaag 660
gtatgccgcg tagcca 676
<210> 4
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaccttacga ccgacgttca gttcaattgc catgtcagta aaattagtcc ctttcgaggc 60
ggatcacact gttgattgcc ttaacaacag gcttagcctt cagcagttca acggtgcggg 120
aaagatcaga ttccagcgca gagtgggtga ccacgatcag acgtgcatca tcatcgcgct 180
cttcctgtcg gattgtacgc agggagattc cttgctcaga gaacaggcta gccaattcag 240
ccaaaacccc cacgcgatct tccacatcca tgtcgaggtg gtaacgagtg gtggtctcac 300
cgaaatcagc gatcggcagg ttagcgtagg tggactcacc tggagcacgg ccaccgtgca 360
ccttgtttcg tgcggcacca acgacgtcgc caagcacagc agacgcggtt ggcgcgccac 420
ctgcaccgtt tccgtagaac atcaggcgac cagctgcttc tgcttcaaca aagattgcat 480
taaaggactt gtttaccgac gccagtgggt gggacacagg taatagagtc gggtgcacgc 540
gagcagaaat agccgacttt ccttccttgt tggtgaactt ctcacagatg gccaacaact 600
tgatggtgtg gcctgcctgc tgtgctgcct caatgtcggc agcgctgatg ttgctgatac 660
cttcgca 667
<210> 5
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgctactgg tgcggttcat ttagctaact cgaaccctga tctctttgat ggagtcattg 60
gcatctctgg ttgctactcc acgcttgatc ccattggaca aaccacggtg tcactaattg 120
ttaattctcg cggtggcaat gtagaaaata tgtggggtcc cactggttct gaaacttgga 180
aagctcacga tgtcacatca aatcctgagg ggctgcgcga catggctgtc tatttgtcag 240
ctgcgaacgg agttgtagat gacatcgatt tggcggattc cgagaaagag cctttctaca 300
atttgctggc tggcgtagtg cttgagcgtg gttcgctgag ctgcacagag gcattggatg 360
agtcgatgag cagggccggc atgaaccatc aagtggtgga ctacaaagat tccggaacgc 420
acaattggcg caactttaat ccacagttac agcctggctg ggatgcgatc aagcacgctc 480
tttactagag cactggcctt attcgtttga taacaaacgc gctatcactc cttgcagtga 540
cagcgcgttt ttgcggtttt tgcatcattt cgtacacagc atggaaatcc atgcgaattc 600
ttccctatat cactgttaag atcatttcag ttgtatttta gtcaccccat tttccagatt 660
gcggccacat caggctgaga acgaggagag catcaggttc ggaccacaca caggactgtt 720
cctttgcttg gggaattctt attggtcctt tgtgcatgac tggagactcg ttaagatgtc 780
agctccacaa catacgcctc cga 803
<210> 6
<211> 953
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgctggctgt catcctggtg gctgcattcc ttttgcccat ggtttcttgg ccaaagggca 60
cgcttgtcga cggcccaccc ggctccgact tcggcgttct gccggagttc aagcgtacgc 120
tgcaccgccc gcgtcgctgg gcgtccaatg acccgatcag tccttttgat gccaatgagg 180
atgcatcacg cttccctacc gtggcaatca ccaatcctga agctaaggag tcctaaatca 240
tgggaactac tgcaatcatc atgatggtgt tgttcatggt catcatttgg ggtggcctgg 300
tttatgccac catcgcactt cgacgcgaac cagatgagaa ggttggactg tttggaacct 360
ctccatatgc caccgactct gttcttattg agcaagagtc tgaacgacct gcaacggcct 420
aaagatctct gtaggaaaca ctcccgccac agtcgctggg agtgtttcgt gctttaaaac 480
caagaaccat gcaaaatgga gaactgtggc aacaatggat gaattctctc aggtccctga 540
cggtgaccaa catggcatca gagacgacaa aaatggcgaa cccgttaagt ctgccagtgc 600
agagccgact ccaagcaaaa cttctgctcg gcaccgggat gcaattgatc gcgtagaccg 660
ctcggtggtc ataggtgatt acttcaagag ggtgtccatg tggagtttgc ggttggtgtt 720
cgtcgccgcc gctgtcttta ttttatggtg ggtcattggt cggttctggc agggcgtttt 780
gccggtcacc ttggcaatca tcatctgtac tgtgctgtcc tcaccaaact catggttgcg 840
gaagcatgga gttcccagtg tggtgtcggc gtttatcacc atcggcacgt tttttgccgt 900
cgtgggtgct attttgtggt taattgcgcc gagtatcgcc caacaatccc agg 953
<210> 7
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagggtagcc cagaagattt cagttcggcg tagtcggtag ccattgaatc gtgctgagag 60
cggcagcgtg aacatcagcg acaggacaag cactggttgc actaccaaga gggtgccgaa 120
accaagtgct actgtttgta agaaatatgc cagcatcgcg gtactcatgc ctgcccacca 180
catcggtgtc atcagagcat tgagtaaagg tgagctcctt agggagccat cttttggggt 240
gcggagcgcg atccggtgtc tgaccacggt gccccatgcg attgttaatg ccgatgctag 300
ggcgaaaagc acggcgagca gattgctttg cacttgattc agggtagttg actaaagagt 360
tgctcgcgaa gtagcacctg tcacttttgt ctcaaatatt aaatcgaata tcaatatatg 420
gtctgtttat tggaacgcgt cccagtggct gagacgcatc cgctaaagcc ccaggaaccc 480
tgtgcagaaa gaaaacactc ctctggctag gtagacacag tttataaagg tagagttgag 540
cgggtaactg tcagcacgta gatcgaaagg tgcacaaag 579
<210> 8
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tc 1032
<210> 9
<211> 541
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggttgccga tgtctccgta tgcagtgagc gtggcgtttc cgaggggaac ttgatcagag 60
gaatacacca tggagccgat gtcagaggcg actgcgggca gatccttttg aagctgtttc 120
acaatttctt tgcccagttc gcggcggatc tggaaccact tttgcatgcg atcgtcgtca 180
gagtggttca tgtgaaaaat acactcacca tctcaatggt catggtgaag gcctgtactg 240
gctgcgacag catggaactc agtgcaatgg ctgtaaggcc tgcaccaaca atgattgagc 300
gaagctccaa aatgtcctcc ccgggttgat attagatttc ataaatatac taaaaatctt 360
gagagttttt ccgttgaaaa ctaaaaagct gggaaggtga atcgaatttc ggggctttaa 420
agcaaaaatg aacagcttgg tctatagtgg ctaggtaccc tttttgtttt ggacacatgt 480
agggtggccg aaacaaagta ataggacaac aacgctcgac cgcgattatt tttggagaat 540
c 541
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgcatct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcg 596
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60
ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120
gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
gattttttac cc 192
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<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcgtctgag ctgatcctac cgatcgctgt ggcagtgacc aaccgtctga cagttgctga 60
tctggctgat accttcgcgg tgtacccatc attgtcaggt tcgattactg aagcagcacg 120
tcagctggtt caacatgatg atctaggcta atttttctga gtcttagatt ttgagaaaac 180
ccaggattgc tttgtgcact cctgggtttt cactttgtta agcagttttg gggaaaagtg 240
caaagtttgc aaagtttaga aatattttaa gaggtaagat gtctgcaggt ggaagcgttt 300
aaatgcgtta aacttggcca aatgtggcaa cctttgcaag gtgaaaaact ggggcggggt 360
tagatcctgg ggggtttatt tcattcactt tggcttgaag tcgtgcaggt caggggagtg 420
ttgcccgaaa acattgagag gaaaacaaaa accgatgttt gattggggga atcgggggtt 480
acgatactag gacgcagtga ctgctatcac ccttggcggt ctcttgttga aaggaataat 540
tac 543
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<212> DNA
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<400> 13
atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatg 1438
<210> 14
<211> 509
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaccaagaa taaggaactg ctgaactgga tcgcagacgc cgtcgagctc ttccagcctg 60
aggctgttgt gttcgttgat ggatcccagg ctgagtggga tcgcatggcg gaggatcttg 120
ttgaagccgg taccctcatc aagctcaacg aggaaaagcg tccgaacagc tacctagctc 180
gttccaaccc atctgacgtt gcgcgcgttg agtcccgcac cttcatctgc tccgagaagg 240
aagaagatgc tggcccaacc aacaactggg ctccaccaca ggcaatgaag gacgaaatgt 300
ccaagcatta cgctggttcc atgaaggggc gcaccatgta cgtcgtgcct ttctgcatgg 360
gtccaatcag cgatccggac cctaagcttg gtgtgcagct cactgactcc gagtacgttg 420
tcatgtccat gcgcatcatg acccgcatgg gtattgaagc gctggacaag atcggcgcga 480
acggcagctt cgtcaggtgc ctccactcc 509
<210> 15
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acgactggga aggcgtcaag atcgacgcaa tcctcttcgg tggacgtcgc gcagacaccg 60
tcccactggt tacccagacc tacgactggg agcacggcac catggttggt gcactgctcg 120
catccggtca gaccgcagct tccgcagaag caaaggtcgg cacactccgc cacgacccaa 180
tggcaatgct cccattcatt ggctacaacg ctggtgaata cctgcagaac tggattgaca 240
tgggtaacaa gggtggcgac aagatgccat ccatcttcct ggtcaactgg ttccgccgtg 300
gcgaagatgg acgcttcctg tggcctggct tcggcgacaa ctctcgcgtt ctgaagtggg 360
tcatcgaccg catcgaaggc cacgttggcg cagacgagac cgttgttgga cacaccgcta 420
aggccgaaga cctcgacctc gacggcctcg acaccccaat tgaggatgtc aaggaagcac 480
tgaccgctcc tgcagagcag tgggcaaacg a 511
<210> 16
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60
cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120
ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180
accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240
ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300
ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360
aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420
ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480
gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540
tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600
tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660
ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720
gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780
gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840
gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900
gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960
atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020
atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080
ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140
acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191
<210> 17
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcgagctggt ttcaccactt tcatagcaaa acgtgatgag atctttgcaa ttcctggcac 60
ggtttgaatg tgactggata aaaattgctc atacgcctcc aaatcagcaa cgccgatgcg 120
gacaaaataa tctggcgaac caaaaagcct gtgcaactcc agtacttcat catgctgcgc 180
aacggagctt tcaaaattgt ctacagtgga gcggtcgaag ttgctgagag tgacatccac 240
ggtcacctca aatccacgat tcatcaccgc agggtgaatg tccgcgctgt agcccaaaat 300
gattccttcg gcttccaaac gctgcaccct cctcaagcaa ggtcccggag tgagatgcac 360
cttgtcagcc agtgcgagat ttgagatgcg cgcattcgcg ctaagctccg caataattgc 420
gcgatcaatg gaatctagct tcatatattg cacaatagcc tagttgaggt gcgcaaactg 480
gcaacaaaac tacccggcaa ttgtgtgatg attgtagtgt gcaaaaaacg caagagattc 540
attcaagcct ggag 554
<210> 18
<211> 566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atgtcgccat ccaaggcagc cctggaacca gatgataaag gttatcggcg ctacgaaatc 60
gcgcaaggtc taaaaacctc ccttgctgca ggtttgggca tgtacccgat tggtattgcg 120
tttggtctct tggttattca atacggctac gaatggtggg cagccccact gttttccggc 180
ctgattttcg cgggctccac cgaaatgctg gtcatcgccc tcgttgtggg cgcagcgccc 240
ctgggcgcca tcgcgctcac cacattgctg gtgaacttcc gccacgtatt ctatgcgttt 300
tcattcccgc tgcatgtggt caaaaacccc attgcccgtt tctattcggt tttcgcgctt 360
atcgacgaag cctacgcagt cactgcggcc aggcccgcag gctggtcggc gtggcgactt 420
atctcaatgc aaatagcgtt tcactcctac tgggtattcg gcggtctcac cggagtggcg 480
atcgcagagt tgattccttt tgaaattaag ggcctcgagt tcgccctttg ctctctcttt 540
gtcacgctga ctttggattc ctgccg 566
<210> 19
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cttggcaggc gatgaaaccg cagcacccgc aatcgcgcgc atcctcgaag acctcgcaga 60
ttccgatatt ccaggaaccg ccatgatcga aatcccctca gatgacgatg cacttgccat 120
cgagggacct tcctccatcg atgtgaaatg gctgccccgc aacggccgca agcacggtga 180
attgttgatg gaaaccctgg ccctccacca tgaagaaaca gaagctgcag ccacctccga 240
aggcgaactt gtgtgggaga ctcctgtgtt ctccgccact ggcgaacaga tcacagaatc 300
caacccacgt tcaggcgact actactggat tgctggcgaa agtggtgtcg tgaccagcat 360
tcgtcgatct ctagtgaaag agaaaggcct cgaccgttcc caagtggcat tcatggggta 420
ttggaaacac ggcgtttcca tgcggggctg aaactgccac cataggcgcc agcaattagt 480
agaacactgt attctaggta gctgaacaaa agagcccatc aaccaaggag actcgtggca 540
aaaataatat ggac 554
<210> 20
<211> 602
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtggcaaaaa taatatggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60
aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcgggcattg aggtcgagac ccgggacatt 120
tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180
ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240
cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300
cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360
ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420
tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480
ggcgagtggt ctgcagattc caagaccaac gttgcaacca tggatgcaaa cgacttccgc 540
cacaacgaga agtccatcat cctcgacgct gctgatgaag ttcagatcaa gcacatcgca 600
gc 602
<210> 21
<211> 1048
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960
tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020
cgcgcccgta ttttcgtggt gctgatta 1048
<210> 22
<211> 1445
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cacgcgcccg tattttcgtg gtgctgatta cgcaatcatc ttccgaatac agcatcagtt 60
tctgcgttcc acaaagcgac tgtgtgcgag ctgaacgggc aatgcaggaa gagttctacc 120
tggaactgaa agaaggctta ctggagccgc tggcagtgac ggaacggctg gccattatct 180
cggtggtagg tgatggtatg cgcaccttgc gtgggatctc ggcgaaattc tttgccgcac 240
tggcccgcgc caatatcaac attgtcgcca ttgctcaggg atcttctgaa cgctcaatct 300
ctgtcgtggt aaataacgat gatgcgacca ctggcgtgcg cgttactcat cagatgctgt 360
tcaataccga tcaggttatc gaagtgtttg tgattggcgt cggtggcgtt ggcggtgcgc 420
tgctggagca actgaagcgt cagcaaagct ggctgaagaa taaacatatc gacttacgtg 480
tctgcggtgt tgccaactcg aaggctctgc tcaccaatgt acatggcctt aatctggaaa 540
actggcagga agaactggcg caagccaaag agccgtttaa tctcgggcgc ttaattcgcc 600
tcgtgaaaga atatcatctg ctgaacccgg tcattgttga ctgcacttcc agccaggcag 660
tggcggatca atatgccgac ttcctgcgcg aaggtttcca cgttgtcacg ccgaacaaaa 720
aggccaacac ctcgtcgatg gattactacc atcagttgcg ttatgcggcg gaaaaatcgc 780
ggcgtaaatt cctctatgac accaacgttg gggctggatt accggttatt gagaacctgc 840
aaaatctgct caatgcaggt gatgaattga tgaagttctc cggcattctt tctggttcgc 900
tttcttatat cttcggcaag ttagacgaag gcatgagttt ctccgaggcg accacgctgg 960
cgcgggaaat gggttatacc gaaccggacc cgcgagatga tctttctggt atggatgtgg 1020
cgcgtaaact attgattctc gctcgtgaaa cgggacgtga actggagctg gcggatattg 1080
aaattgaacc tgtgctgccc gcagagttta acgccgaggg tgatgttgcc gcttttatgg 1140
cgaatctgtc acaactcgac gatctctttg ccgcgcgcgt ggcgaaggcc cgtgatgaag 1200
gaaaagtttt gcgctatgtt ggcaatattg atgaagatgg cgtctgccgc gtgaagattg 1260
ccgaagtgga tggtaatgat ccgctgttca aagtgaaaaa tggcgaaaac gccctggcct 1320
tctatagcca ctattatcag ccgctgccgt tggtactgcg cggatatggt gcgggcaatg 1380
acgttacagc tgccggtgtc tttgctgatc tgctacgtac cctctcatgg aagttaggag 1440
tctga 1445
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caggtgaaga tgatgtcggt ggtgc 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
accgacatca tcttcacctg ccctc 25
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgccgatcac tcgcacctcc ttcaggctc 29
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggaggtgcga gtgatcggca atgaatccg 29
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cacgcgcccg tattttcgtg gtgctgatta cgcaatc 37
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
taatcagcac cacgaaaata cgggcgcgtg acatc 35
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ggatcctcta gagtcgacct gcag 24
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tactagtctc cttctgaatt ccatggtctg tttcctgt 38

Claims (10)

1.一株谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达天冬氨酸激酶编码基因突变体、丙酮酸羧化酶编码基因突变体以及来源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶I编码基因突变体。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述天冬氨酸激酶I编码基因的核苷酸序列如Gene ID：945803所示。
3.根据权利要求1～2任一所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株。
4.一种产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，以权利要求1～3任一所述的谷氨酸棒杆菌为宿主，沉默调控蛋白McbR基因、高丝氨酸激酶的编码基因、转运蛋白MetD的编码基因、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的表达，下调异柠檬酸脱氢酶编码基因的表达，过表达转运蛋白BrnFE编码基因、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因、高丝氨酸脱氢酶编码基因。
5.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述的调控蛋白McbR基因的核苷酸序列如Gene ID：1020883所示；所述高丝氨酸激酶的编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1019167所示；所述转运蛋白MetD的编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1019015所示；所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1020806所示；所述异柠檬酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1018663所示；所述转运蛋白BrnFE编码基因为Gene ID：1021322与Gene ID：1021321所示基因形成的基因簇；所述天冬氨酸激酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1021294所示；所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1021315所示；所述高丝氨酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1019166所示；所述丙酮酸羧化酶编码基因的核苷酸序列如Gene ID：1018688所示。
6.一种生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求4～5任一所述工程菌为发酵菌株发酵生产L-高丝氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述工程菌以葡萄糖为底物，发酵生产L-高丝氨酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述工程菌在OD600为15～30时加入含有葡萄糖的体系中发酵。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在25～35℃、170～250rpm条件下进行发酵。
10.权利要求1～3任一所述谷氨酸棒杆菌，或权利要求4或5所述工程菌，或权利要求6～9任一所述方法在生物、化学领域制备L-高丝氨酸中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375726A (zh) * 2021-01-18 2021-02-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
CN112695036A (zh) * 2021-03-23 2021-04-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用
CN112877271A (zh) * 2021-02-05 2021-06-01 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
WO2023151406A1 (zh) * 2022-02-14 2023-08-17 廊坊梅花生物技术开发有限公司 苏氨酸生产菌株的构建方法
WO2023151412A1 (zh) * 2022-02-10 2023-08-17 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1466630A (zh) * 2000-09-30 2004-01-07 德古萨股份公司 使用肠细菌科菌株发酵生产l-氨基酸的方法
CN1898392A (zh) * 2003-12-24 2007-01-17 德古萨股份公司 使用肠杆菌科菌株制备l－氨基酸的方法
EP1846564A2 (en) * 2005-02-07 2007-10-24 Metabolic Explorer Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate
CN100554426C (zh) * 2001-08-06 2009-10-28 德古萨股份公司 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸
CN101578361A (zh) * 2005-06-17 2009-11-11 米克罗比亚精密工程股份有限公司 改进的氨基酸和代谢物生物合成
CN103215291A (zh) * 2012-01-18 2013-07-24 中国科学院上海生命科学研究院 用于生产l-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法
US20140099676A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Jun Xu Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
US20150056670A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Microorganism producing 4-hydroxybutyrate and a method for producing 4-hydroxybutyrate in anaerobic condition using the same
CN105734004A (zh) * 2016-03-02 2016-07-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
CN106868066A (zh) * 2009-08-28 2017-06-20 Cj第制糖株式会社 产生o‑乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o‑乙酰高丝氨酸的方法
CN107893089A (zh) * 2016-10-03 2018-04-10 味之素株式会社 用于生产l‑氨基酸的方法
WO2020004936A1 (ko) * 2018-06-27 2020-01-02 한국과학기술원 합성조절 srna 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법
CN111019878A (zh) * 2020-01-13 2020-04-17 江南大学 L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111705030A (zh) * 2020-07-07 2020-09-25 浙江工业大学 高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1466630A (zh) * 2000-09-30 2004-01-07 德古萨股份公司 使用肠细菌科菌株发酵生产l-氨基酸的方法
CN100554426C (zh) * 2001-08-06 2009-10-28 德古萨股份公司 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸
CN1898392A (zh) * 2003-12-24 2007-01-17 德古萨股份公司 使用肠杆菌科菌株制备l－氨基酸的方法
EP1846564A2 (en) * 2005-02-07 2007-10-24 Metabolic Explorer Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate
CN101578361A (zh) * 2005-06-17 2009-11-11 米克罗比亚精密工程股份有限公司 改进的氨基酸和代谢物生物合成
CN106868066A (zh) * 2009-08-28 2017-06-20 Cj第制糖株式会社 产生o‑乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o‑乙酰高丝氨酸的方法
CN103215291A (zh) * 2012-01-18 2013-07-24 中国科学院上海生命科学研究院 用于生产l-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法
US20140099676A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Jun Xu Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
US20150056670A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Microorganism producing 4-hydroxybutyrate and a method for producing 4-hydroxybutyrate in anaerobic condition using the same
CN105734004A (zh) * 2016-03-02 2016-07-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
CN107893089A (zh) * 2016-10-03 2018-04-10 味之素株式会社 用于生产l‑氨基酸的方法
WO2020004936A1 (ko) * 2018-06-27 2020-01-02 한국과학기술원 합성조절 srna 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법
CN111019878A (zh) * 2020-01-13 2020-04-17 江南大学 L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111705030A (zh) * 2020-07-07 2020-09-25 浙江工业大学 高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. OHNISHI • S等: "A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
STEFANIE KIND等: "Systems-wide metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
THEZE,J.等: "bifunctional aspartate kinase/homoserine dehydrogenase I [Escherichia coli]", 《GENBANK》 *
张博等: "代谢工程改造大肠杆菌生产L-高丝氨酸", 《生物工程学报》 *
李宁: "谷氨酸棒杆菌合成O-乙酰-L-高丝氨酸关键代谢过程调控", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑（电子期刊）》 *
杨运桂等: "新型高密度发酵基因工程菌G830 ", 《生物化学与生物物理学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375726A (zh) * 2021-01-18 2021-02-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
CN112877271A (zh) * 2021-02-05 2021-06-01 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
CN112877271B (zh) * 2021-02-05 2023-03-14 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
CN112695036A (zh) * 2021-03-23 2021-04-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用
CN112695036B (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用
WO2023151412A1 (zh) * 2022-02-10 2023-08-17 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用
WO2023151406A1 (zh) * 2022-02-14 2023-08-17 廊坊梅花生物技术开发有限公司 苏氨酸生产菌株的构建方法

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Publication number Publication date
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