CN111778225A

CN111778225A - 一种天冬氨酸激酶突变体及其在生产l-苏氨酸中的应用

Info

Publication number: CN111778225A
Application number: CN202010729811.0A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 邵明龙; 童丽珍; 朱荣帅; 徐美娟; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明公开了一种天冬氨酸激酶突变体及其在生产L‑苏氨酸中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产L‑苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)‑lysC^r‑asdA，此重组谷氨酸棒杆菌表达编码天冬氨酸激酶突变体G359D的基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因；将此重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵罐中发酵60h，即可使发酵液中L‑苏氨酸的产量达62.8g/L、糖酸转化率达到38％，较出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032分别提高了29.5％和33.9％。

Description

一种天冬氨酸激酶突变体及其在生产L-苏氨酸中的应用

技术领域

本发明涉及一种天冬氨酸激酶突变体及其在生产L-苏氨酸中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

L-苏氨酸是一种必需氨基酸，主要应用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等领域。特别是在饲料添加剂领域，L-苏氨酸的用量增长快速，它常被添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。

目前，国内外生产L-苏氨酸的方法主要是微生物发酵法，此方法通过将可生产L-苏氨酸的野生菌或基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵以生产L-苏氨酸。其中，大肠杆菌(Escherichia coli)是构建可生产L-苏氨酸的基因工程菌时最为常用的宿主细胞。但是，由于大肠杆菌在代谢过程中会逐渐积累一些毒素，因此，利用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌生产得到的L-苏氨酸安全性不高，这限制了此类L-苏氨酸在医药行业的应用。相对来说，利用以无致病性的安全菌株谷氨酸棒杆菌为宿主的基因工程菌生产得到的L-苏氨酸在医药行业更具优势。

然而，现有的以谷氨酸棒杆菌为宿主的基因工程菌生产L-苏氨酸的产量不高，例如，Diesveld等人通过在谷氨酸棒杆菌中异源表达来源于E.coli的rhtC基因获得了一株可产L-苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，将此重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中发酵72h，仅可使发酵液中L-苏氨酸的产量达3.7g/L(具体可见参考文献：DIESVELD R,TIETZE N,FURSTO,et al.Activity of exporters of Escherichia coli in Corynebacteriumglutamicum,and their use to increase L-threonine production[J].Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology,2009,16(3-4):198-207.)；Dong等人通过在谷氨酸棒杆菌中串联表达lysC、hom和thrB基因获得了一株可产L-苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，将此重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中发酵72h，仅可使发酵液中L-苏氨酸的产量达7.27g/L(具体可见参考文献：Dong X,Yue Z,Hu J,et al.Attenuating L-lysineproduction by deletion ofddh,and lysE,and their effect on L-threonine and L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum[J].Enzyme&MicrobialTechnology,2016(93-94):70-78)。因此，急需找到一种可高产L-苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高产L-苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种天冬氨酸激酶突变体，所述天冬氨酸激酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸激酶相比，第359位甘氨酸突变为了天冬氨酸，命名为G359D。

在本发明的一种实施方式中，编码所述天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述天冬氨酸激酶突变体。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述天冬氨酸半醛脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET21a(+)质粒为表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因；或者，所述宿主细胞携带上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032。

本发明还提供了一种发酵生产L-苏氨酸的方法，所述方法为先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-苏氨酸的发酵液，然后将含有L-苏氨酸的发酵液进行分离，获得L-苏氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为29～31℃、转速为250～350r/min、pH为6～8。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为300r/min、pH为6.8～7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含所述发酵培养基的成分包含葡萄糖60～120g/L、豆粕提取粉15～25g/L、(NH₄)₂SO₄ 3～4g/L、玉米浆15～25g/L、KH₂PO₄ 0.5～1.5g/L、MgSO₄ 0.3～0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.3～0.8g/L、CaCO₃ 25～35g/L、V_B180～120μg/L以及V_H 130～180μg/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖80g/L、豆粕提取粉20g/L、(NH₄)₂SO₄ 3.5g/L、玉米浆20g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.5g/L、CaCO₃ 30g/L、V_B1 100μg/L以及V_H 150μg/L。

本发明还提供了上述天冬氨酸激酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产L-苏氨酸中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种可高产L-苏氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA，此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA表达编码天冬氨酸激酶突变体G359D的基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因；将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA接种至发酵罐中发酵60h，即可使发酵液中L-苏氨酸的产量达62.8g/L、糖酸转化率达到38％，较出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032分别提高了29.5％和33.9％。

附图说明

图1：串联基因lysC-asdA的PCR验证结果；其中，M为10000bp DNAMarker，1-2为串联基因lysC-asdA。

图2：重组质粒pET21a(+)-lysC^r-asdA的酶切验证结果；其中，M为10000bpDNAMarker，1为重组质粒pET21a(+)-lysC^r-asdA。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032和pET21a(+)质粒购自上海信裕生物科技有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。

LBG液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖。

LBG固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖、琼脂粉20g/L。

种子培养基：葡萄糖25g/L、豆粕提取粉20g/L、尿素1.25g/L、玉米浆20g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.5g/L、V_B1 100μg/L以及V_H 150μg/L，用20％(v/v)的氨水调pH为6.9±0.1。

发酵培养基：葡萄糖80g/L、豆粕提取粉20g/L、(NH₄)₂SO₄ 3.5g/L、玉米浆20g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.5g/L、CaCO₃ 30g/L、V_B1 100μg/L以及V_H 150μg/L，用20％(v/v)的氨水调pH为6.9±0.1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

L-苏氨酸含量的测定：采用高效液相色谱系统(HPLC)自动柱前衍生化法测定；色谱柱为Venusil-AA柱；采用流动相组成为水相(1L)：7.6g无水乙酸钠、925mL高纯水，冰醋酸调pH至6.5；有机相(1L)：80％(v/v)乙腈；色谱条件：柱温40℃，流量1.0mL/min，SPD-M20A检测器。

糖酸转化率的测定：糖酸转化率的计算公式如下：

式中，ρ：L-苏氨酸质量浓度，g/L；V：发酵液总体积，L；m：总耗糖量，g。

实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建

具体步骤如下：

1、重组质粒pET21a(+)-lysC-asdA的构建

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的基因组为模板，以CA-F、CA-R为引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码天冬氨酸激酶(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的基因和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的编码天冬氨酸半醛脱氢酶(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的基因串联所得的的串联基因片段lysC-asdA；将此串联基因片段lysC-asdA与pET21a(+)质粒经限制性内切酶EcoR I和BamHⅠ酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1氯霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落PCR验证(验证结果见图1)以及测序验证(并送苏州金唯智有限公司进行测序分析)，验证正确即获得转化成功的重组质粒pET21a(+)-lysC-asdA；其中，引物如下：

CA-F：5'-CGGAATTCCGGTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGGC-3'(SEQ ID No.5)；

CA-R：5'-CGGGATCCCGTTACTTAACCAGCAGCTCAGCG-3'(SEQ ID No.6)。

2、重组质粒pET21a(+)-lysC^r-asdA的构建

利用全质粒PCR技术，以重组质粒pET21a(+)-lysC-asdA为模板，以C^r-A-F、C^r-A-R为引物进行PCR扩增，获得携带编码天冬氨酸激酶突变体G359D的基因的重组质粒pET21a(+)-lysC^r-asdA；

其中，扩增引物如下：

C^r-A-F：5'-CCGATAAGCCAGGCGAG A CTGCGAAGGTTTTCCG-3'(SEQ ID No.7)；

C^r-A-R：5'-CAGCCTCGCCTGGCTTATCGGAAATACCCAGAACGG-3'(SEQ ID No.8)。

3、重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA的构建

将重组质粒pET21a(+)-lysC^r-asdA电转谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032，得到转化产物；将转化产物涂布于含50μg·mL^-1氯霉素的LBG固体培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；挑取转化子接种至LBG液体培养基中，于30℃、、220r/min的条件下摇瓶培养24h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图2)以及测序验证(并送苏州金唯智有限公司进行测序分析)，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA。

实施例2：L-苏氨酸的生产(摇瓶发酵)

具体步骤如下：

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA的单菌落接种至含有30mLLBG液体培养基的250mL三角瓶中，于30℃、220r/min培养12h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种至50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，于30℃、220r/min发酵60h，得到发酵液；发酵过程中，通过添加20％(v/v)的氨水控制发酵培养基的pH维持在6.9～7.0。

检测发酵液中的L-苏氨酸的产量，检测结果如下：

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA发酵获得的发酵液中L-苏氨酸的产量达53.75g/L、糖酸转化率达到34.31％，较出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032分别提高了10.82％和20.55％。

实施例3：L-苏氨酸的生产(发酵罐发酵)

具体步骤如下：

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA的单菌落接种至含有30mL LBG液体培养基的250mL三角瓶中，于30℃、220r/min培养12h至ΔOD_562nm为0.2×100，得到一级种子液；将一级种子液按0.33％(v/v)的接种量接种至含有3L种子培养基的5L种子罐中，于30℃、300r/min培养8h至ΔOD_562nm为0.30×100，得到二级种子液；将二级种子液按20％(v/v)的接种量接种至含有15L发酵培养基的30L发酵罐中，于温度为30℃、初始转速为300r/min的条件下发酵60h，获得发酵液；发酵过程中，通过控制转速控制发酵培养基的溶氧维持在25～35％，通过流加25％(v/v)的氨水控制发酵培养基的pH维持在6.9～7.0，当发酵培养基中葡萄糖的含量降至5.0g/L以下时，通过流加700g/L的葡萄糖，控制发酵培养基中葡萄糖的浓度维持在5.0～10g/L，发酵结束前4h停止流加葡萄糖。

检测发酵液中的L-苏氨酸的产量，检测结果如下：

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032/pET21a(+)-lysC^r-asdA发酵获得的发酵液中L-苏氨酸的产量达62.8g/L、糖酸转化率达到38％，较出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032分别提高了29.5％和33.9％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种天冬氨酸激酶突变体及其在生产L-苏氨酸中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 1

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 2

<211> 1266

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 2

gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60

aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120

tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180

ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240

gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagctcaat ctttcactgg ctctcaggct 300

ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgacgtcac accgggtcgt 360

gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggttttca gggtgttaat 420

aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480

ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540

accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600

atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660

cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720

attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780

gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcc 840

aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900

tcctctgtgg aagacggcac caccgacatc acgttcacct gccctcgcgc tgacggacgc 960

cgtgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020

gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080

accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140

tctgagatcc gcatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200

ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260

cgctaa 1266

<210> 3

<211> 344

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 3

Met Thr Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Thr Gly Gln Val Gly Gln Val

1 5 10 15

Met Arg Thr Leu Leu Glu Glu Arg Asn Phe Pro Ala Asp Thr Val Arg

20 25 30

Phe Phe Ala Ser Pro Arg Ser Ala Gly Arg Lys Ile Glu Phe Arg Gly

35 40 45

Thr Glu Ile Glu Val Glu Asp Ile Thr Gln Ala Thr Glu Glu Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Ile Asp Val Ala Leu Phe Ser Ala Gly Gly Thr Ala Ser Lys

65 70 75 80

Gln Tyr Ala Pro Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala Thr Val Val Asp Asn

85 90 95

Ser Ser Ala Trp Arg Lys Asp Asp Glu Val Pro Leu Ile Val Ser Glu

100 105 110

Val Asn Pro Ser Asp Lys Asp Ser Leu Val Lys Gly Ile Ile Ala Asn

115 120 125

Pro Asn Cys Thr Thr Met Ala Ala Met Pro Val Leu Lys Pro Leu His

130 135 140

Asp Ala Ala Gly Leu Val Lys Leu His Val Ser Ser Tyr Gln Ala Val

145 150 155 160

Ser Gly Ser Gly Leu Ala Gly Val Glu Thr Leu Ala Lys Gln Val Ala

165 170 175

Ala Val Gly Asp His Asn Val Glu Phe Val His Asp Gly Gln Ala Ala

180 185 190

Asp Ala Gly Asp Val Gly Pro Tyr Val Ser Pro Ile Ala Tyr Asn Val

195 200 205

Leu Pro Phe Ala Gly Asn Leu Val Asp Asp Gly Thr Phe Glu Thr Asp

210 215 220

Glu Glu Gln Lys Leu Arg Asn Glu Ser Arg Lys Ile Leu Gly Leu Pro

225 230 235 240

Asp Leu Lys Val Ser Gly Thr Cys Val Arg Val Pro Val Phe Thr Gly

245 250 255

His Thr Leu Thr Ile His Ala Glu Phe Asp Lys Ala Ile Thr Val Asp

260 265 270

Gln Ala Gln Glu Ile Leu Gly Ala Ala Ser Gly Val Lys Leu Val Asp

275 280 285

Val Pro Thr Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Asp Glu Ser Leu Val Gly

290 295 300

Arg Ile Arg Gln Asp Ser Thr Val Asp Asp Asn Arg Gly Leu Val Leu

305 310 315 320

Val Val Ser Gly Asp Asn Leu Arg Lys Gly Ala Ala Leu Asn Thr Ile

325 330 335

Gln Ile Ala Glu Leu Leu Val Lys

340

<210> 4

<211> 1035

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 4

atgaccacca tcgcagttgt tggtgcaacc ggccaggtcg gccaggttat gcgcaccctt 60

ttggaagagc gcaatttccc agctgacact gttcgtttct ttgcttcccc gcgttccgca 120

ggccgtaaga ttgaattccg tggcacggaa atcgaggtag aagacattac tcaggcaacc 180

gaggagtccc tcaagggcat cgacgttgcg ttgttctctg ctggaggcac cgcttccaag 240

cagtacgctc cactgtttgc tgctgcaggc gcgactgttg tggataactc ttctgcttgg 300

cgcaaggacg acgaggttcc actaatcgtc tctgaggtga acccttccga caaggattcc 360

ctggtcaagg gcattattgc gaatcctaac tgcaccacca tggctgcaat gccagtgctg 420

aagccactgc acgatgccgc tggtcttgta aagcttcacg tttcctctta ccaggctgtt 480

tccggttctg gtcttgcagg tgtggaaacc ttggcaaagc aggttgctgc agttggcgac 540

cacaacgttg agttcgtcca tgatggacag gctgctgacg caggcgatgt cggaccttac 600

gtttccccaa tcgcttacaa cgtgctgcca ttcgccggaa acctcgtcga tgacggcacc 660

ttcgaaaccg acgaagagca gaagctgcgc aacgaatccc gcaagattct cggcctccca 720

gacctcaagg tctcaggcac ctgcgtccgc gtgccggttt tcaccggcca cacgctgacc 780

attcacgccg aattcgacaa ggcaatcacc gtcgagcagg cgcaggagat cttgggtgcc 840

gcttcaggcg tcgagcttgt cgacgtccca accccacttg cagctgccgg cattgacgaa 900

tccctcgttg gacgcatccg tcaggactcc actgtcgacg acaaccgcgg tctggttctc 960

gtcgtatctg gcgataacct tcgcaagggc gcagcactga acaccattca gattgctgag 1020

ctgctggtta agtaa 1035

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattccg gtggccctgg tcgtacagaa atatggc 37

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatcccg ttacttaacc agcagctcag cg 32

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgataagcc aggcgagact gcgaaggttt tccg 34

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagcctcgcc tggcttatcg gaaataccca gaacgg 36

Claims

1.一种天冬氨酸激酶突变体，其特征在于，所述天冬氨酸激酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸激酶相比，第359位甘氨酸突变为了天冬氨酸。

2.如权利要求1所述的一种天冬氨酸激酶突变体，其特征在于，编码所述天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1或2所述的天冬氨酸激酶突变体。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求3所述的基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求3所述的基因以及编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因；或者，所述宿主细胞携带权利要求4所述的重组质粒。

6.如权利要求5所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

7.一种发酵生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求5或6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-苏氨酸的发酵液，然后将含有L-苏氨酸的发酵液进行分离，获得L-苏氨酸。

8.如权利要求7所述的一种发酵生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为29～31℃、转速为250～350r/min、pH为6～8。

9.如权利要求7或8所述的一种发酵生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖60～120g/L、豆粕提取粉15～25g/L、(NH₄)₂SO₄ 3～4g/L、玉米浆15～25g/L、KH₂PO₄ 0.5～1.5g/L、MgSO₄ 0.3～0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.3～0.8g/L、CaCO₃ 25～35g/L、V_B1 80～120μg/L以及V_H 130～180μg/L。

10.权利要求1或2所述的天冬氨酸激酶突变体或权利要求3所述的基因或权利要求4所述的重组质粒或权利要求5或6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的方法在生产L-苏氨酸中的应用。