CN116904416A - 一种高效生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程领域。本发明以大肠杆菌BL21为宿主，pET等系列质粒为载体，在胞内异源表达L‑二氨基丁酸转氨酶(EctBT15S/T49A/Y293M)、L‑二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)和四氢嘧啶合成酶(EctC)，通过质粒拷贝数优化得到最优表达载体及基因组合方式，并通过不同水平RBS调控三酶表达水平从而进一步优化体内三酶的酶活比例。以最优重组菌株作为生物催化剂进行全细胞转化，四氢嘧啶最高产量达到87.36g/L。该生产过程简单、原料易得、杂质少，具有较好的工业化应用前景。

Description

一种高效生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高效生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
四氢嘧啶，又名依可多因、四氢甲基嘧啶羧酸，英文名称为Ectoine,1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid，分子式为C6H10N2O2，分子量为142.16，是一种亲水性有机小分子，是嗜盐微生物或耐盐微生物中常见的渗透压调控物。研究表明，四氢嘧啶对极端环境中细胞内的蛋白质和核酸等生物大分子的结构和功能有保护作用，因而在医药、生物制剂和化妆品等行业有广泛的应用前景。
目前，四氢嘧啶的合成方式主要有化学法和生物法。其中化学法因四氢嘧啶的化学结构中存在手性碳原子而导致合成难度较大，副产物多，合成产率低，难以大规模生产；生物法主要包括发酵法和酶催化转化法，是目前四氢嘧啶合成的主要研究方向。嗜盐菌四氢嘧啶的主要合成途径为：草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸-β-半缩醛→醛氨酸→草酰乙二氨基丁酸→N-γ-乙酰二氨基丁酸→四氢嘧啶，基于该代谢途径构建异源表达工程菌株，可实现四氢嘧啶的异源表达。康振等(CN 113186143 A)公布了利用合成生物学技术和基因工程的手段，构建了低盐条件下生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌ECT-LA，包含了由T7启动子控制的四氢嘧啶合成基因簇ectABC及外源基因lysCC932T和asd，以葡萄糖为底物，分批补料发酵56h后，四氢嘧啶产量达到60g/L。林凌等(CN 112961875 A)公布了一株串联表达了Salinicola salaria来源的氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶的重组大肠杆菌工程菌株，以天冬氨酸钠和葡萄糖为底物，酶促反应催化生成四氢嘧啶，获得的最高产量为24.8g/L。上述两种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶的产量在现有文献报道中处于较高水平，但仍有进一步提升的空间。Hillier等研究发现EctB是四氢嘧啶合成途径的限速酶；Chen等通过提高EctB突变体的外泌碱产量和比活性提高了四氢嘧啶产量。因此通过提高四氢嘧啶合成途径关键酶的催化效率，有望开发高产四氢嘧啶的生产菌株，对促进四氢嘧啶的工业化生产和应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产四氢嘧啶的方法。本发明通过在大肠杆菌细胞中过表达合成四氢嘧啶的路径酶L-二氨基丁酸转氨酶(EctBT15S/T49A/Y293M)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EtcA)和四氢嘧啶合成酶(EtcC)，随后通过质粒拷贝数优化得到最优表达载体及基因组合方式，并通过不同水平RBS调控三酶表达水平从而进一步优化体内三酶的酶活比例，实现了四氢嘧啶的高效生产，为四氢嘧啶的工业化生产奠定了基础。
本发明提供了一种L-二氨基丁酸转氨酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-二氨基丁酸转氨酶的第15位的苏氨酸突变为丝氨酸，将第49位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第293位的酪氨酸突变为甲硫氨酸；命名为：EctBT15S/T49A/Y293M。
在本发明的一种实施方式中，编码所述L-二氨基丁酸转氨酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种编码所述突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-28a、pRSF-Duet-1、或pCDF-Duet-1为表达载体。
本发明还提供了表达上述突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是过表达了上述L-二氨基丁酸转氨酶突变体EctBT15S/T49A/Y293M、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-二氨基丁酸乙酰转移酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成酶。
在本发明的一种实施方式中，编码所述L-二氨基丁酸转氨酶突变体EctBT15S /T49A/Y293M的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述L-二氨基丁酸乙酰转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述四氢嘧啶合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，采用pCDF-Duet-1载体过表达了四氢嘧啶合成酶，采用pRSF-Duet-1过表达了L-二氨基丁酸转氨酶突变体和L-二氨基丁酸乙酰转移酶。
在本发明的一种实施方式中，采用RBS序列CCGTGATTGACGCCGACAAACTGGATGACG替代L-二氨基丁酸乙酰转移酶基因前方载体本身的AAGGAG。
本发明还提供了一种所述重组大肠杆菌的构建方法，所述构建方法的步骤为：
(1)获得L-二氨基丁酸转氨酶突变体、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶的单基因表达载体；
(2)分别扩增编码三种酶的基因，按照独立的阅读框顺序分别连接至pACYC-Duet-1、pCDF-Duet-1、pET-Duet-1、pRSF-Duet-1表达载体上，三种基因在每种载体的连接种类及顺序各不同。
(3)将步骤(1)和(2)得到的表达载体对路径酶进行组装，得到多种组合方式。
(4)将步骤(3)所得的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中，得到大肠杆菌重组菌。
本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体是所有路径酶基因按照独立的开放阅读框的顺序依次与表达载体相连接，开放阅读框的顺序为：启动子、核糖体结合位点RBS、路径酶编码基因、终止子。
本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌E.coli BL21。
本发明还提供了一种制备四氢嘧啶的方法，所述方法为，采用上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌为全细胞催化剂，以天冬氨酸钠、葡萄糖为底物，转化制备得到四氢嘧啶；所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-二氨基丁酸乙酰转移酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸钠的添加量为100-200mM，所述葡萄糖的添加量为50-100mM。
在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化剂的制备方法为：
按照2-10％的接种量接种至发酵罐中，培养4-5h，添加终浓度0.5-0.8mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为37℃，诱导时间18h，发酵结束后以8000rpm转速离心收集菌体，用0.8％的NaCl溶液洗菌体，-20℃保存菌体备用。
在本发明的一种实施方式中，发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨15g/L,磷酸氢二钠5g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸镁3g/L,硫酸亚铁1g/L，通过补加氨水调节pH为7.0-7.5；补料液成分：葡萄糖母液800g/L；整个发酵阶段补料葡萄糖母液。
在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化生产体系中，以上述重组菌作为细胞催化剂，以100-200mM天冬氨酸钠、50-100mM葡萄糖为底物，50mM、pH7.0的PBS缓冲液作为溶剂进行转化反应。
在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化生产体系中，反应2-4h后，向转化体系补加2M L-天冬氨酸钠和1M葡萄糖，维持转化反应体系的pH 7.0。
本发明还提供了上述L-二氨基丁酸转氨酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备四氢嘧啶或含有四氢嘧啶的产品中的应用。
有益效果
本发明通过改变质粒拷贝数和RBS的强度精细化调控四氢嘧啶合成的路径酶L-二氨基丁酸转氨酶EctBT15S/T49A/Y293M、L-二氨基丁酸乙酰转移酶EctA和四氢嘧啶合成酶EctC表达水平，实现了该级联路径反应平衡；最优重组菌株E.coli9(含有质粒pRSF-EctBT15S /T49A/Y293M-EctA，pCDF-EctC)5L发酵罐下采用分批补料策略(共流加155.08g/L L-天冬氨酸钠)，转化20h，四氢嘧啶产量达到87.36g/L。本发明方法在工业上用于提高四氢嘧啶的产量具有极大的潜力和广泛的价值。
附图说明
图1为四氢嘧啶生物合成路径示意图。
图2为不同拷贝数的基因表达载体构建示意图。
图3为6种不同拷贝数重组菌株在摇瓶转化中的四氢嘧啶产量比较。
图4为不同RBS水平的基因表达载体构建示意图。
图5为10种不同RBS水平重组菌株在摇瓶转化中的四氢嘧啶产量比较。
图6为最优重组菌株E.coli9在5L发酵罐上补料分批转化的四氢嘧啶产量。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
伸长盐单胞菌H.elongate DSM 2581种子液培养基：NaCl 80g/L，酪蛋白氨基酸7.5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，MgSO4·7H2O 20g/L，K2HPO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 1g/L，pH7.0；
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；
发酵培养基：葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨13g/L,磷酸氢二钠5g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸镁3g/L,硫酸亚铁1g/L，用氨水调节pH为7.0-7.5。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
L-二氨基丁酸转氨酶酶活的检测方法：
通过测定30min、L-二氨基丁酸转氨酶生成L-2,4-二氨基丁酸的产量来计算L-二氨基丁酸转氨酶的酶活。1mL反应体系中含100mM的底物，过量的谷氨酸和适量的L-二氨基丁酸转氨酶酶液，反应时间为30min-1h。反应后经HPLC测定的L-2,4-二氨基丁酸的生成量。以1min内生成1μmol L-2,4-二氨基丁酸所需要的酶量来定义L-二氨基丁酸转氨酶的酶活。
L-2,4-二氨基丁酸的HPLC检测：
色谱柱为安捷伦氨基酸柱；流动相组成为：A相采用浓度为10mM的KH2PO4，用KOH溶液调节pH至5.30左右，B相利用纯乙腈、纯甲醇以及A相溶液以5:3:1的体积比混合，用冰醋酸溶液调节pH至5.30左右；采用邻苯二甲醛衍生法测定，即8μL样品与4μL OPA混合，在线衍生；此外，洗脱方法为梯度洗脱；检测器为荧光检测器，其中激发波长为330nm，发射波长为465nm。
实施例1：突变体的构建
(1)单突突变体构建：
设计EctB突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒PCR(此处所用的全质粒是含野生型L-二氨基丁酸转氨酶EctB基因的pET-28a质粒)进行突变体构建。
表1：单突变体突变引物序列
(2)构建反应PCR扩增体系：PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、，模板(EctBWT)4μL、水32.5μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于卡那抗性平板后37℃恒温培养12h左右。挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。
(3)多突变体构建：构建方法与将单突变体构建方法相同，以第一轮获得的单突变体为模板，进行组合突变后获得突变体EctBT15S/T49A/Y293M。
分别制备得到含有EctBT49A、EctBT15S、EctBY293M、EctBT15S/T49A/Y293M突变体的重组大肠杆菌(E coli BL21/pET-28a-EctBT49A、E coli BL21/pET-28a-EctBT15S、E coli BL21/pET-28a-EctBY293M、E coli BL21/pET-28a-EctBT15S/T49A/Y293M)，同时，以含有野生型EctB的重组大肠杆菌(E coli BL21/pET-28a-EctB，制备方法同上)为对照菌株。
实施例2：酶的纯化与酶学性质测定
(1)摇瓶发酵生产酶：
分别将实施例1制备得到的含有突变体的重组菌株阳性转化子接种至LB培养基，37℃培养至OD600为0.6～1.0时加入终浓度0.1mM IPTG诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导时间18h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min，收集菌体。
(2)酶的纯化及酶学性质测定：
将收集的菌体，加入10mL结合液A(20mM Tris-HCl、0.5mM NaCl、20mM咪唑，用HCl调pH至7.0附近)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。
将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。
用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下向柱子里加入约6～12倍柱体积超纯水冲洗柱子，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白，再用洗脱液B(20mM Tris-HCl、0.5mMNaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。
(3)酶学性质测定：为了对突变体进行评价，本发明测定了突变亲本EctB及突变体EctBT15S、EctBT49A、EctBY293M和EctBT15S/T49A/Y293M在20℃下的酶活(表2)。
表2：EctB亲本酶及其突变体的酶活
实施例3：路径酶相关的单基因表达载体的构建
本发明所用的L-二氨基丁酸转氨酶为实施例1制备得到的突变体EctBT15S/T49A/Y293M亲本酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶基因EctA和四氢嘧啶合成酶基因EctC均来源于Halomonas elongate。具体步骤如下：
(1)将伸长盐单胞菌H.elongate DSM 2581接种于种子培养基中进行培养，培养基组成(g/L)：NaCl 80，酪蛋白氨基酸7.5，蛋白胨5，酵母粉1，MgSO4·7H2O 20，K2HPO4 0.5，FeSO4·7H2O 1，去离子水定容至1L，pH7.0。培养条件在30℃，200rpm培养10h。收集菌体，并利用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸菌H.elongate DSM 2581基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计各个路径酶相对应的引物，以上述提取的基因组DNA和实验室已有质粒为模板，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得相应的EctA(SEQ ID NO.6所示)和EctC基因(SEQ ID NO.7所示)片段；同时，根据实施例1的方法，得到编码突变体EctBT15S/T49A/Y293M的基因片段(SEQ ID NO.5所示)(也可根据基因序列化学合成相关的基因片段)。
(2)将质粒pET-28a经过BamHI和XhoI双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收，回收获得线性化的质粒pET-28a。
(3)将上述PCR扩增获得的基因片段分别与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至JM109感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，则证明单基因表达载体构建成功，由此获得3个表达载体，分别为：
pET28a-EctBT15S/T49A/Y293M、pET28a-EctA、pET28a-EctC。
实施例4：路径酶不同基因拷贝数载体的构建
具体步骤如下：
1、单拷贝的重组载体的制备
(1)按照实施例3的方法获得相应的EctBT15S/T49A/Y293M(SEQ ID NO.5所示)、EctA(SEQ ID NO.6所示)和EctC基因(SEQ ID NO.7所示)片段；
(2)分别将质粒pRSF-Duet-1、pCDF-Duet-1、pET-Duet-1经过BamHI和HindIII双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收，回收获得线性化的质粒pRSF-Duet-1、pCDF-Duet-1、pET-Duet-1。
(3)将上述PCR扩增获得的基因片段分别与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至JM109感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，则证明单基因表达载体构建成功，由此获得7个表达载体，分别为：
pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M、pRSF-EctA、pET-EctBT15S/T49A/Y293M、pET-EctA、pET-EctC、pCDF-EctA、pCDF-EctC。
2、多拷贝的重组载体的制备
不同载体的拷贝数如表3所示：
表3：质载体拷贝数
具体步骤如下：
(1)按照实施例3的方法获得相应的EctA(SEQ ID NO.6所示)、EctC(SEQ ID NO.7所示)基因片段；
(2)分别将质粒pCDF-EctA、pRSF-EctA、pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M和pET-EctA经过KpnI和XhoI双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收，回收获得线性化的质粒pCDF-EctA、pRSF-EctA、pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M和pET-EctA。
(3)将上述PCR扩增获得的基因片段分别与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至JM109感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，则证明单基因表达载体构建成功，由此获得5个表达载体，分别为：
pCDF-EctA-EctC、pET-EctA-EctC、pRSF-EctA-EctC、pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctC、pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctA。
以上构建成功的表达载体，两两根据路径酶表达要求进行组合，双质粒同时转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，由此得到6个重组菌(图2)，分别为：
E.coli BL21(DE3)/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M/pCDF-EctA-EctC，命名为E.coli 1；
E.coli BL21(DE3)/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M/pET-EctA-EctC，命名为E.coli 2；
E.coli BL21(DE3)/pET-EctBT15S/T49A/Y293M/pRSF-EctA-EctC，命名为E.coli 3；
E.coli BL21(DE3)/pET-EctA/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctC，命名为E.coli 4；
E.coli BL21(DE3)/pET-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctA，命名为E.coli 5；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctA，命名为E.coli 6。
实施例5：重组菌E.coli1-E.coli6摇瓶发酵
具体步骤如下：
(1)重组菌培养：
分别将实施例4制备得到的E.coli 1～6的单克隆接种于50mL(250mL摇瓶)LB培养基中，于37℃，200rpm培养10h，作为摇瓶发酵的种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量接种至150mL发酵培养基中，在37℃条件下，培养至OD600为0.8，加入IPTG使终浓度为0.4mM，25℃诱导14h，结束后6000rpm转速离心10min收集菌体，并放置-20℃保存，作为生物转化所需的全细胞催化剂。
发酵培养基成分：葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨13g/L,磷酸氢二钠5g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸镁3g/L,硫酸亚铁1g/L，通过补加氨水调节pH为7.0-7.5。
(2)摇瓶转化体系：
分别将制备得到全细胞催化剂悬浮于100mM pH 7.0的PBS缓冲液得到湿细胞；
向含有200mM L-天冬氨酸钠、100mM葡萄糖的反应体系中添加20g/L湿细胞，在30℃条件下转化反应24h；检测四氢嘧啶的产量，结果如图3所示。
结果显示，转化24h，最优重组菌株E.coli6(E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-EctA)可产生14.4g/L四氢嘧啶，转化率为46.5％(底物投料量：31g/L L-天冬氨酸钠、18g/L L-葡萄糖)。
实施例6：E.coli 7～E.coli 16的构建
具体步骤如下：
(1)不同RBS水平的基因表达载体构建
在实施例5构建成功的不同基因拷贝数表达载体的基础上，以天冬氨酸钠为底物评估生物转化后(实施例5)，得到最优三酶基因组合方式的载体(pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S /T49A/Y293M-EctA)，设计10种不同强度的RBS(其序列表4所示)，替换EctA基因前方载体本身的RBS(native RBS，命名为RBS0)，如图4所示。
将pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS0-EctA中的RBS0分别替换为RBS1～RBS10。
表4：所采用的RBS序列
首先进行全质粒PCR，PCR产物进行纯化，利用DPNI去除原始的模板，消化产物转化至BL21感受态细胞，并经过菌落PCR验证条带正确的送测序，测序正确的则说明不同RBS水平的基因表达载体构建成功，最终共得到10种重组菌，分别为：
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS1-EctA，命名为E.coli7；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS2-EctA，命名为E.coli8；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS3-EctA，命名为E.coli9；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS4-EctA，命名为E.coli10；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS5-EctA，命名为E.coli11；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS6-EctA，命名为E.coli12；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS7-EctA，命名为E.coli13；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS8-EctA，命名为E.coli14；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS9-EctA，命名为E.coli15；
E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS10-EctA，命名为E.coli16；
(2)摇瓶转化比较
重组菌培养条件与转化条件同实施例5：
分别将制备得到全细胞催化剂悬浮于100mM pH 7.0的PBS缓冲液得到湿细胞；
向含有200mM L-天冬氨酸钠、100mM葡萄糖的反应体系中添加20g/L湿细胞，在30℃条件下转化反应24h。
根据四氢嘧啶的产量测定，结果如图5所示，转化24h，最优重组菌株E.coli 9(E.coli BL21(DE3)/pCDF-EctC/pRSF-EctBT15S/T49A/Y293M-RBS3-EctA)可产生18.23g/L四氢嘧啶，转化率为58.8％(底物投料量：31g/L L-天冬氨酸钠、18g/L L-葡萄糖)。
实施例7：最优重组菌株E.coli 9在5L发酵罐进行补料分批转化
具体步骤如下：
(1)重组菌培养：
挑取E.coli 9重组菌株进行上罐发酵。将单克隆接种于50mL(250mL摇瓶)LB培养基于37℃，200rpm培养10h，作为上罐的种子液。
整个发酵过程中的pH控制在7.0左右，发酵罐装液量为2L，发酵培养基为：葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨13g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁3g/L，硫酸亚铁1g/L。
按照5％(v/v)的接种量，将种子液接种至发酵罐中，保持溶氧水平为25±1.5％，供气速率为6L/min，搅拌转速100-500rpm，37℃培养至OD600为30，加入IPTG使终浓度为0.4mM，25℃诱导18h，结束后8000rpm转速离心10min收集菌体，并放置-20℃保存，作为生物转化所需的全细胞催化剂。
(2)5L发酵罐转化(1L反应体系)：
将全细胞催化剂悬浮于100mM PBS缓冲液得到湿细胞；
初始投料200mM L-天冬氨酸钠、100mM葡萄糖、20g/L湿细胞，然后每隔4h分别投料200mM L-天冬氨酸钠、100mM葡萄糖，共投料4次，总投料为155.08g/L L-天冬氨酸钠、90.08g/L葡萄糖。
在30℃下进行转化，反应过程使用2M NaOH维持pH在7.0附近，搅拌转速为400rpm，共反应24h，每隔2h取样检测样品中四氢嘧啶含量。
根据四氢嘧啶的产量测定，结果如图6所示，转化20h，四氢嘧啶产量达到87.36g/L，转化率为56.3％(共流加155.08g/L L-天冬氨酸钠)。
以上结果说明，本发明技术采用基因工程技术，改变RBS的强度及质粒拷贝数精细化调控四氢嘧啶级联路径中的酶L-二氨基丁酸转氨酶(EctBT15S/T49A/Y293M)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)和四氢嘧啶合成酶(EctC)的表达水平能够有效提高四氢嘧啶的产量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种L-二氨基丁酸转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的L-二氨基丁酸转氨酶的第15位的苏氨酸突变为丝氨酸，将第49位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第293位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述突变体，或含有权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述的重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时过表达了权利要求1所述的L-二氨基丁酸转氨酶突变体、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-二氨基丁酸乙酰转移酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成酶。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以E.coliBL21(DE3)为表达宿主；优选的，采用pCDF-Duet-1载体过表达了四氢嘧啶合成酶，采用pRSF-Duet-1过表达了L-二氨基丁酸转氨酶突变体和L-二氨基丁酸乙酰转移酶；优选的，采用RBS序列CCGTGATTGACGCCGACAAACTGGATGACG替代L-二氨基丁酸乙酰转移酶基因前方载体本身的AAGGAG。
8.一种制备四氢嘧啶的方法，其特征在于，采用权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求6或7所述的重组大肠杆菌为全细胞催化剂，以天冬氨酸钠、葡萄糖为底物，转化制备得到四氢嘧啶；所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-二氨基丁酸乙酰转移酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸钠的添加量为100-200mM，所述葡萄糖的添加量为50-100mM。
10.权利要求1所述的L-二氨基丁酸转氨酶突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4或5所述的重组细胞，或权利要求6或7所述的重组大肠杆菌在制备四氢嘧啶或含有四氢嘧啶的产品中的应用。
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