CN113817659B - 一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法 - Google Patents

一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β‑丙氨酸的方法，属于生物工程领域。本发明构建了一种工程菌株，通过游离型表达质粒分别过表达panD基因、aspA基因、大肠杆菌来源的ppc基因、gldA基因和dhaKLM基因，敲除了染色体上的lacI基因、乙醛羧酸循环抑制子iclR和富马酸消耗途径的fumA和fumC基因获得高效生产β‑丙氨酸的重组菌。该重组菌株能够以廉价的甘油为底物，发酵生成附加值更高的β‑丙氨酸，发酵50h，β‑丙氨酸产量可达37.9g/L，为工业绿色、高效生产β‑丙氨酸提供了技术支持。

Description

一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术
β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸，已被广泛应用于精细化工、医药、食品、饲料等多个领域，在人们的日常生活及生产过程中发挥着越来越重要的作用。目前工业合成β-丙氨酸的主要方法是化学合成法，该方法能耗较高，对设备要求严苛。微生物发酵法反应条件温和，可以实现β-丙氨酸的绿色生产。但是发酵法高效生产β-丙氨酸的研究较少，尚未建立成熟的生产体系，限制了该方法在工业生产上的大范围推广。
Song等（Metabolic engineering ofEscherichia colifor the production of3-aminopropionic acid.Metabolic Engineering.2015,30:121-129）以大肠杆菌为底盘菌株，构建微生物细胞工厂，以期通过好氧发酵过程高效生产β-丙氨酸。通过对底盘菌株的多轮改造，最终产量达到32.3 g·L-1，为目前已知最高产量。但是，该研究尚未完全成熟，依旧限制了该方法在工业应用上的推广。如该研究所构建工程菌株并未敲除有机酸等副产物的合成途径，副产物的积累会影响菌体的生长，而且会降低底物转化率，同时降低产物的化学纯度。而且该研究构建工程菌株的过程并未全局性调控大肠杆菌胞内代谢途径，导致代谢失衡，以至于β-丙氨酸的产量未随着代谢途径的叠加改造而逐步增加。
发明内容
针对现有的重组大肠杆菌生产β-丙氨酸产量较低的问题，本发明提供了一株产β-丙氨酸的重组大肠杆菌，通过在大肠杆菌中构建新的代谢途径，使重组大肠杆菌能够以甘油作为合成β-丙氨酸的原料，转化低价值的原料为高附加值化学品。
本研究根据好氧发酵过程中大肠杆菌合成β-丙氨酸的代谢途径（图2），将β-丙氨酸的从头合成途径划分为三大模块，并分别命名为β-丙氨酸合成模块（模块一）、TCA模块（模块二）和底物酵解模块（模块三），并利用模块化的调控策略对三大模块内及模块间的代谢流进行全局而系统的调控。
本发明的目的是提供一种高效合成β-丙氨酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达了天冬氨酸-α-脱羧酶、天冬氨酸氨裂解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油脱氢酶和/或二羟丙酮激酶，并敲除了乳糖操纵子阻遏蛋白、乙醛羧酸循环抑制子、延胡索酸酶。
在一种实施方式中，天冬氨酸-α-脱羧酶序列的GenBank: QYO72381.1或NCBIReference Sequence: NP_001096055.1；天冬氨酸氨裂解酶序列的NCBI ReferenceSequence: NP_418562.4。
在一种实施方式中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶序列的NCBI Reference Sequence:NP_418391.1；甘油脱氢酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_418380.4；二羟丙酮激酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_415718.6、NP_415717.1、NP_415716.4。
在一种实施方式中，乳糖操纵子阻遏蛋白序列的NCBI Reference Sequence: NP_414879.3；乙醛羧酸循环抑制子iclR序列的NCBI Reference Sequence: NP_418442.2；延胡索酸酶包括延胡索酸酶A和延胡索酸酶C，延胡索酸酶A序列的NCBI ReferenceSequence: NP_416129.1，延胡索酸酶C序列的NCBI Reference Sequence:NP_416128.1。
在一种实施方式中，编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc基因的Gene ID:948457、编码甘油脱氢酶的gldA基因的Gene ID: 948440和编码延胡索酸酶的dhaKLM基因的Gene ID: 945747、945748、945749。
在一种实施方式中，天冬氨酸-α-脱羧酶和天冬氨酸氨裂解酶位于敲除了乳糖操纵子基因的pET-24a质粒上。
在一种实施方式中，基因ppc、gldA和dhaKLM位于pCDFDuet-amp质粒上；所述pCDFDuet-amp质粒为将链霉素抗性基因替换为青霉素抗性基因amp的pCDFDuet质粒。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌B0016-082BB为宿主，所述大肠杆菌B0016-082BB已在文章Xu J, Zhu Y, Zhou Z.Systematic engineering of therate-limiting step of β-alanine biosynthesis inEscherichia coli.ElectronicJournal of Biotechnology.2021中公开。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述重组大肠杆菌的微生物制剂。
本发明的第三个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以质粒pET-24a为质粒骨架，将基因片段panD连接至质粒pET-24a，得到重组质粒pET-24a-CgpanD；
（2）敲除重组质粒pET-24a-CgpanD的lacI基因，得到重组质粒pET-24a-CgpanD-1；
（3）以质粒pCDFDuet-amp质粒骨架，将基因片段ppc、gldA和dhaKLM连接至质粒pCDFDuet-amp，得到重组质粒pCDFDuet-ppc-gldA-dhaKLM。
（4）敲除大肠杆菌B0016-082BB染色体上lacI基因、iclR基因、fumA和fumC基因，得到重组菌株B0016-087BB；
（5）将将步骤（1）~（4）构建的重组质粒中的至少一种转入菌株B0016-087BB，得到重组菌株。
在一种实施方式中，panD基因的Gene ID:100124592，aspA的Gene ID: 948658
在一种实施方式中，ppc基因的Gene ID: 948457、gldA基因的Gene ID: 948440所示和dhaKLM基因的Gene ID: 945747、945748、945749所示。
本发明的第四个目的是提供一种生产β-丙氨酸的方法，以甘油为底物，利用上述重组大肠杆菌或上述微生物制剂发酵生产β-丙氨酸。
在一种实施方式中，将上述重组大肠杆菌或微生物制剂加入反应体系，控制溶氧不低于45%，控制转速为200~900 rpm，通气量为2~10 L/min，温度为35~38℃，pH为6.5~7.5。
在一种实施方式中，流加碱液使反应体系的pH保持为6.5~7.5，从第一次溶氧反弹开始一直流加发酵补料培养基进行补料，直至发酵结束。
在一种实施方式中，所述碱液包括NaHCO3溶液。
本发明还保护所述重组大肠杆菌或所述微生物制剂或生产β-丙氨酸的方法在药物分析、食品分析、环境监测、物化工程和生物制药中的应用。
有益效果：
本发明构建了一种高效合成β-丙氨酸的重组大肠杆菌，并对该宿主菌株进行改造优化。该重组大肠杆菌能够以廉价的甘油为底物，发酵生成附加值更高的β-丙氨酸，发酵50h，β-丙氨酸产量可达37.9 g/L。
本发明采用的发酵工艺易于控制，生产成本低，有利于工业化生产。
附图说明
图1 为本研究所用主要质粒结构图。
图2 为好氧发酵过程中β-丙氨酸的代谢途径；Gly: 甘油，DHA: 二羟基丙酮，DHAP: 磷酸二羟基丙酮;，G3P: 3-磷酸甘油醛，PYR: 丙酮酸，OAA: 草酰乙酸，CIT: 柠檬酸，ICIT: 异柠檬酸，SCU: 琥珀酸，FUM: 富马酸，MAL: 苹果酸，ASP: 天冬氨酸，BALA: β-丙氨酸，GLYO:乙醛酸，AKET: α-酮戊二酸，SCU-COA: 琥珀酰-CoA；
图3为β-丙氨酸合成模块的改造对氨基酸合成以及菌体浓度的影响。圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
图4 基因组编辑核酸验证。M: DL 5000 DNA marker；1: B0016-082BB，lacI（1271-bp）；2: B0016-080BB，lacI:: FRT-kan（1515-bp）；3: B0016-085BB，lacI:: FRT（293-bp）；4: B0016-085BB，iclR（1872-bp）；5: B0016-085BB，iclR:: FRT-kan（2347-bp）；6: B0016-086BB，iclR:: FRT（1044-bp）；7: B0016-086BB，fumAC（3525-bp）；8: B0016-086BB，fumAC:: FRT-kan（1560-bp）；9: B0016-087BB，fumAC:: FRT（338-bp）。
图5 为β-丙氨酸合成模块与TCA模块间的改造对氨基酸合成以及菌体浓度的影响；圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
图6 TCA模块调控对氨基酸合成以及菌体浓度的影响。(a) B0016-0861BB菌株好氧发酵曲线图；(b) B0016-0871BB菌株好氧发酵曲线图。圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
图7 为发酵液中氨基酸种类及含量分析。(a) B0016-0821BB菌株好氧发酵曲线图；(b) B0016-0861BB菌株好氧发酵曲线图。
图8 底物酵解模块内及其与TCA模块间的调控对氨基酸合成以及菌体浓度的影响。(a) B0016-0872BB菌株好氧发酵曲线图；(b) B0016-0873BB菌株好氧发酵曲线图。圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
图9 工程菌株B0016-0874BB的发酵性能验证。圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
图10 工程菌株B0016-0874BB与B0016-082BB的发酵性能。(a) B0016-082BB菌株好氧发酵曲线图； (b) B0016-0874BB菌株好氧发酵曲线图。圆形：菌体浓度；三角形：β-丙氨酸；方形：L-天冬氨酸。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的培养基：
LB液体培养基：先用电子天平称取10 g胰蛋白胨（Tryptone）、5 g酵母粉(Yeastextract)、 10 g 氯化钠（NaCl）于烧杯中，然后再加去离子水于烧杯中定容至1 L，最后再于高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭菌20 min。
LB固体培养基：称取20 g琼脂粉加到1 L的LB液体培养基中，然后放于高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭菌20 min。
M9Y培养基是在M9培养基的基础上进行优化，其配方为(g/L)：KH2PO413.50，(NH4)2HPO44，NaCl 2，MgSO41，甘油 10，酵母粉2，蛋白胨2，柠檬酸 1.70，经121℃高温高压灭菌20min后，添加1‰（v/v）MgSO4母液（120 g/L）、泛酸钙母液（200 g/L）和微量元素母液。
微量元素母液：MnSO4·4H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10.0 g/L，CaCl22.0 g/L，(NH4)Mo7O240.1 g/L，CuSO4·5H2O 3.0 g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23 g/L，ZnSO4·7H2O 5.25g/L，用0.1 mol/LHCl配置。
发酵补料培养基(g/L)：甘油 650，酵母粉4，蛋白胨4，(NH4)2SO4100，MgSO43.67。
培养基中根据需要添加相应的抗生素，抗生素添加量为：卡那霉素终浓度为50 μg/mL，链霉素终浓度为25 μg/mL。
下述实施例中涉及到的质粒和菌株：
pPL451-panD：已公开于文章，为文章中相对应的质粒pPL-panD，详见：梁姗姗，周丽，张斌,等. 代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸[J]. 食品与发酵工业, 2017(05):18-23.。
pCDFDuet-amp质粒：以商品化pCDFDuet质粒为出发质粒，将链霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因amp。
大肠杆菌B0016-082BB：已在文章Xu J, Zhu Y, Zhou Z.Systematicengineering of the rate-limiting step of β-alanine biosynthesis inEscherichia coli.Electronic Journal of Biotechnology.2021中公开。
下述实施例中涉及到的方法：
吉布森组装方式构建重组质粒：具体步骤参见Gibson et al., Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods,2009, 6 (5):343–5.
利用Red重组方法对染色体基因进行改造：步骤参见K.A. Datsenko et al.,One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coliK-12 using PCRproducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 6640–6645.
氨基酸浓度检测方法：
发酵液预处理方法：发酵液样品10000 rpm离心2 min，取上清液加入等体积10%（m/v）三氯乙酸，避光放置大于3 h，适当稀释后用0.45 μm滤膜过膜。
利用邻苯二甲醛（OPA）试剂在线衍生β-丙氨酸，用高效液相色谱（HPLC）分析氨基酸的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱（250 cm×4.6 mm，5μm），流动相A为：无水醋酸钠（分析纯）4.52 g，先溶于水，再加三乙胺 200 μL，四氢呋喃 5 mL，水定容至1 L，醋酸调节pH7.2；流动相B为：无水醋酸钠4.52 g，水定容为200 mL，醋酸调节pH 7.2，加400 mL甲醇和400 mL乙腈。采用梯度洗脱：0~27 min，B液由8%上升到60%，流速为1 mL/min；20~31.5 min，B液由60%上升到100%，流速为1 mL/min；32~34 min，B液梯度不变，流速为1.2 mL/min。34~35min，B液由100%下降到8%，流速为1 mL/min。柱温为40℃，检测波长为338 nm；进样量为10μL。
摇瓶培养：
取-80℃保藏的工程菌株于具有相应抗性的LB固体培养基划线，并于37℃过夜培养。挑取单菌落至含有相应抗生素抗性的50 mL LB培养基中，于37℃、200 r/min震荡培养至OD600为3，而后离心，并利用发酵培养基重悬菌体沉淀，并将重悬菌液转接至发酵培养基，调节菌液浓度为OD600为0.05，于37℃、200 r/min振荡培养至发酵结束，期间每隔6 h利用100 g/LNaHCO3溶液调节pH至7，并补加0.50 mL 50%（m/v）的甘油。
发酵罐培养：
利用LB培养基对工程菌株过夜培养，细胞在LB培养基中摇瓶培养方法如上所述，以获得一级种子液，而后转接至M9Y培养基于37℃培养至OD600为4即获得二级种子液。以5%（v/v）的接种量将二级种子液转接入含有100 mL发酵培养基的发酵罐中。发酵过程通过调节转速及通气量以维持溶氧不低于45%，其中，转速的调节范围是200 rpm至900 rpm，通气量的调节范围是2 L/min至10 L/min，温度保持37℃。发酵过程中，流加100 g/L的NaHCO3溶液调节发酵体系的pH保持为7，并根据菌体生长情况以及底物消耗速率，利用发酵补料培养基进行补料。从第一次溶氧反弹开始一直流加发酵补料培养基进行补料，直至发酵结束。
表1 下述实施例中涉及的引物
实施例1：过表达天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD
（1）构建重组质粒pET-24a-CgpanD
以pPL451-panD为模板，利用引物BglII-panDF和HindIII-panDR进行PCR扩增获得p L-CgpanD表达盒，并切胶回收。利用BglII和HindIII分别酶切p L-CgpanD表达盒和pET-24a质粒，再次切胶回收。将胶回收获得的p L-CgpanD表达盒和线性化的pET-24a质粒混合，并加入DNA连接酶过夜连接，以构建重组质粒pET-24a-CgpanD。
利用化学转化法，将重组质粒pET-24a-CgpanD转化入大肠杆菌E. coliJM109感受态细胞中并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基37℃过夜培养，挑选具有正常菌落形态的单菌落，并利用验证引物YpETF和YpETR进行菌落PCR。将经菌落PCR验证的菌株过夜培养并抽提重组质粒，而后利用Sanger测序技术对重组质粒的基因序列进行验证，即获得验证正确的重组质粒pET-24a-CgpanD。
（2）构建菌株B0016-0821BB
利用电转化法，将步骤（1）得到的重组质粒pET-24a-CgpanD转化入大肠杆菌B0016-082BB菌株，构建菌株B0016-0821BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对菌株B0016-0821BB进行摇瓶发酵，结果如图3和图7 a所示，发酵92 h，获得7.18 g/L β-丙氨酸。菌体浓度在68 h达到最高值，OD600为11.76。整个发酵过程中，L-天冬氨酸的产量均低于0.3 g/L，说明panD基因的过表达使得L-天冬氨酸向β-丙氨酸的生物转化过程不再是β-丙氨酸合成途径中的限速步骤。
实施例2：β-丙氨酸合成模块与TCA模块间的代谢调控
（1）敲除lacI基因
以大肠杆菌B0016-082BB菌株为出发菌株，利用Red重组法，采用引物lacI-pKD13F和lacI-pKD13R敲除大肠杆菌染色体上的lacI基因，构建菌株B0016-085BB，利用引物YlacIF和YlacIR进行验证（图4）。
利用全质粒PCR方式，采用引物lacI-F3和lacI-R3，敲除质粒pET-24a-CgpanD上的lacI基因，构建质粒pET-24a-CgpanD-1。
（2）过表达天冬氨酸氨裂解酶基因aspA
以大肠杆菌E. coliMG1655为模板，利用引物CgpanD-aspA-F1和CgpanD-aspA-R1进行PCR扩增aspA基因；以步骤（1）中的质粒pET-24a-CgpanD-1为模板，利用引物CgpanD-aspA-F2和CgpanD-aspA-R2进行PCR扩增获得质粒骨架；利用布吉森组装方式，连接aspA基因与质粒骨架构建质粒pET-24a-CgpanD-aspA。
利用电转化法，将其导入步骤（1）中的工程菌株B0016-085BB，构建工程菌株B0016-0851BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对菌株B0016-0851BB进行摇瓶发酵培养，结果如图5所示，发酵80 h，β-丙氨酸产量达到8.30 g/L，比实施例1的工程菌株B0016-0821BB提高了15.59%。在发酵过程的32 h至68 h，发酵液中L-天冬氨酸大量积累，而后快速减少至低于0.20 g/L，说明强化L-天冬氨酸合成途径可以强化胞内L-天冬氨酸的积累，而β-丙氨酸快速合成时，发酵液中L-天冬氨酸的浓度快速降低，说明强化L-天冬氨酸转化生成β-丙氨酸的代谢节点可以高效地合成β-丙氨酸。
实施例3： TCA模块的代谢调控
（1）敲除染色体中乙醛羧酸循环抑制子iclR
在实施例2中得到的菌株B0016-085BB的基础上，利用Red重组法，采用引物iclR-pKD13F和iclR-pKD13R实施对大肠杆菌染色体上的iclR基因的敲除，构建工程菌株B0016-086BB。利用引物YiclRF和YiclRR进行PCR验证。
利用电转化法将实施例2中的质粒pET-24a-CgpanD-aspA转化入工程菌株B0016-086BB，构建工程菌株B0016-0861BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对工程菌株B0016-0861BB进行摇瓶发酵，结果如图6 a所示。与B0016-0851BB相比，β-丙氨酸的产量未发生显著性变化，但是菌体浓度增加10.14%。
相比工程菌株B0016-0821BB发酵液中积累的5.94 g/L缬氨酸，菌株B0016-0861BB缬氨酸的产量已降低至不足0.10 g/L （图7 b）。
（2）敲除染色体中富马酸消耗途径的fumA和fumC基因
以步骤（1）获得的B0016-086BB为出发菌株，利用Red重组法，采用引物fumC-pKD13F和fumA-pKD13R同时敲除大肠杆菌染色体上fumA和fumC基因，构建工程菌株B0016-087BB。利用引物YfumCF和YfumAR进行PCR验证。
利用电转化法，将实施例2构建的质粒pET-24a-CgpanD-aspA导入工程菌株B0016-087BB，构建工程菌株B0016-0871BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对工程菌株B0016-0871BB进行摇瓶发酵，其结果如图6 b所示，β-丙氨酸的产量达到8.95 g/L，较工程菌株B0016-0861BB提高了10.49%，但是生物量却减少了21.49%。
实施例4：TCA模块与底物酵解模块间的代谢调控
（1）过表达大肠杆菌来源的ppc基因
以大肠杆菌E. coliMG1655为模板，利用引物ppc-F1和ppc-R1进行PCR扩增ppc基因（NCBI Gene ID: 948457）；以pCDFDuet-amp质粒为模板，利用引物ppc-F2和ppc-R2进行PCR扩增获得质粒骨架，连接ppc基因与质粒骨架构建质粒，同时ppc基因由PL启动子启动表达，下游含有T7终止子，构建得到pCDFDuet-ppc质粒。
利用电转化法，将质粒pCDFDuet-ppc导入实施例3构建的工程菌株B0016-0871BB，构建工程菌株B0016-0872BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对菌株B0016-0872BB进行摇瓶发酵培养，其结果如图8 a所示，菌体浓度与β-丙氨酸的产量都出现了较大幅度的降低，这是明显的胞内代谢流失衡的表现。
（2）过表达编码甘油脱氢酶的基因gldA和编码二羟丙酮激酶的基因dhaKLM调控底物酵解模块
以大肠杆菌E. coliMG1655为模板，利用引物gldA-F1和gldA-R1进行PCR扩增gldA基因（NCBI Gene ID: 948440）；以pCDFDuet-ppc质粒为模板，利用引物gldA-F2和gldA-R2进行PCR扩增获得质粒骨架，连接gldA基因与质粒骨架构建质粒，同时gldA基因由PL启动子启动表达，下游含有T7终止子，构建得到pCDFDuet-ppc-gldA质粒。
以大肠杆菌E. coliMG1655为模板，利用引物dhaKLM-F1和dhaKLMR1进行PCR扩增dhaKLM基因（NCBI Gene ID: 945747、945748、945749）；以pCDFDuet-ppc-gldA质粒为模板，利用引物dhaKLM-F2和dhaKLM-R2进行PCR扩增获得质粒骨架，连接dhaKLM基因与质粒骨架构建质粒，同时dhaKLM基因由PL启动子启动表达，下游含有T7终止子，构建得到pCDFDuet-ppc-gldA-dhaKLM质粒（图1）。
利用电转化的方法，将该质粒导入实施例3构建的工程菌株B0016-0871BB，构建工程菌株B0016-0873BB。
利用M9Y培养基对菌株B0016-0873BB进行摇瓶发酵培养，其结果如图8 b所示，工程菌株B0016-0873BB的生长性能及生产性能均恢复正常，与工程菌株B0016-0871BB相比，菌体浓度提高了3.13%，β-丙氨酸产量提高了6.59%。在菌体浓度和β-丙氨酸产量提高的同时，L-天冬氨酸的积累量也随之增加，与工程菌株B0016-0871BB（图6 b）和B0016-0861BB（图6 a）相比，分别提高了2至3倍。
实施例5：β-丙氨酸合成途径的深度调控及其性能验证
化学合成赤拟谷盗Tribolium castaneum来源的的panD基因（TcpanD，NCBI GeneID: 100124592），替换实施例3构建的pET-24a-CgpanD-aspA上的panD基因，构建得到质粒pET-24a-TcpanD-aspA。
将质粒pET-24a-TcpanD-aspA与实施例4获得的质粒pCDFDuet-ppc-gldA-dhaKLM一起转化入工程菌株B0016-087BB，构建工程菌株B0016-0874BB。
利用M9Y培养基作为发酵培养基对工程菌株B0016-0874BB进行摇瓶发酵培养，结果如图9所示，在发酵过程的80 h，发酵液OD600为10.64，β-丙氨酸的产量为10.47 g/L，而且发酵过程中，L-天冬氨酸的积累量均不高于0.33 g/L。
与实施例1构建的工程菌株B0016-0821BB相比，工程菌株B0016-0874BB的菌体浓度下降了9.06%，但是β-丙氨酸的产量增加了47.46%。
实施例6：工程菌株发酵性能验证
通过摇瓶发酵试验，验证了工程菌株B0016-0874BB的发酵性能。为了进一步验证工程菌株的发酵性能，为工业化生产提供指导，本发明利用5 L发酵罐对实施例5获得的工程菌株B0016-0874BB的发酵性能进行验证。
结果如图10所示，工程菌株B0016-0874BB的β-丙氨酸产量为37.93 g/L，是出发菌株B0016-082BB的β-丙氨酸产量的16.93倍。发酵过程中，发酵液中的L-天冬氨酸的浓度始终低于0.42 g/L，并且在β-丙氨酸快速积累时，天冬氨酸的浓度快速降低，说明胞内的L-天冬氨酸被充分应用于β-丙氨酸的合成。对工程菌株B0016-0874BB与出发菌株B0016-082BB的菌体浓度进行比较，工程菌株的菌体浓度较出发菌株减少17.14%。由之前的结论可知，发酵液中的β-丙氨酸浓度大于0.50 g/L时，会出现产物抑制的现象。工程菌株B0016-0874BB的发酵液中β-丙氨酸的浓度为37.93 g/L，所以随着β-丙氨酸的积累，产物抑制会随之加剧。虽然与出发菌株相比，菌体浓度有所下降，但是其OD600为135.40，可以满足工业生产的要求。所以本研究所构建的工程菌株以及所应用的发酵策略为工业绿色、高效生产β-丙氨酸提供了指导。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高效合成β-丙氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过表达了天冬氨酸-α-脱羧酶、天冬氨酸氨裂解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶，并敲除了乳糖操纵子阻遏蛋白、乙醛羧酸循环抑制子、延胡索酸酶；
天冬氨酸-α-脱羧酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_001096055.1；天冬氨酸氨裂解酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_418562.4；
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_418391.1；甘油脱氢酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_418380.4；
二羟丙酮激酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_415718.6、NP_415717.1、NP_415716.4；
延胡索酸酶为延胡索酸酶A和延胡索酸酶C，延胡索酸酶A序列的NCBI ReferenceSequence: NP_416129.1，延胡索酸酶C序列的NCBI Reference Sequence:NP_416128.1；
以大肠杆菌B0016-082BB为宿主。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，乳糖操纵子阻遏蛋白序列的NCBIReference Sequence: NP_414879.3；乙醛羧酸循环抑制子iclR序列的NCBI ReferenceSequence: NP_418442.2。
3.含有权利要求1或2所述重组大肠杆菌的微生物制剂。
4.一种生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，以甘油为底物，利用权利要求1或2所述重组大肠杆菌或权利要求3所述的微生物制剂发酵生产。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述重组大肠杆菌或权利要求3所述的微生物制剂加入反应体系，控制溶氧不低于45%，控制转速为200~900 rpm，通气量为2~10 L/min，温度为35~38℃，pH为6.5~7.5。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，流加碱液使反应体系的pH为6.5~7.5，从第一次溶氧反弹开始流加发酵补料培养基。
7.权利要求1或2所述重组大肠杆菌或权利要求3所述的微生物制剂或权利要求4~6任一所述生产β-丙氨酸的方法在制备β丙酮酸中的应用。
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