CN114606253B - 一种无外源氨基酸作用下高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无外源氨基酸作用下高产L‑甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌以赖氨酸途径敲除的L‑甲硫氨酸高产菌株E.coliW3110M2/pAm为出发菌株，在基因组上对lysA基因进行原位回补，并将lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，再在pAm的质粒上过表达gltA基因和malY基因获得的；本发明菌株在发酵过程中无需外源添加必需氨基酸也可以生长良好，降低了发酵成本，解决了发酵过程中必需氨基酸添加时机的不确定性，降低了发酵调控的操作难度，使摇瓶中L‑甲硫氨酸产量从添加赖氨酸获得的2.44g/L提高至无外源氨基酸添加时的2.96g/L。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，以及在微生物发酵制备L-甲硫氨酸中的应用。
(二)背景技术
L-甲硫氨酸(L-methionine)，又名L-蛋氨酸，是人体八种必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，在生物体代谢中起着关键作用。含硫氨基酸最早于1847年被Fleitmann在实验室中所发现，之后Osborne在高纯度蛋白质中确定了2种含硫氨基酸，并将其中的一种归为半胱氨酸。1922年，Mueller从蛋白中分离获得了另一种含硫氨基酸，随后在1928年Barger和Coyne确定了该含硫氨基酸的化学式并正式命名为L-甲硫氨酸。L-甲硫氨酸因其独特的结构和性质被广泛应用于食品、饲料和医药等领域。
甲硫氨酸的生产方法主要分为化学合成法，生物酶催化法以及微生物发酵法等。目前甲硫氨酸的合成主要通过化学合成法，化学合成法的产物为DL-甲硫氨酸，主要作为添加剂应用到饲料中。化学合成法生产甲硫氨酸是以丙烯醛和甲硫醇为原料通过丙烯醛法合成甲硫基丙醛为基础，根据不同的工艺分为氰醇法和海因法。但是化学合成法制备甲硫氨酸由于使用氢氰酸和甲硫醇等高挥发有毒底物，反应条件苛刻、三废排放量大、环境污染严重等问题而逐渐受到限制。生物酶法制备的L-甲硫氨酸主要用途是医药行业，主要分为不对称合成法和酶拆分法，但实际应用价值低。微生物代谢合成L-甲硫氨酸具有反应条件温和、立体选择性高、副产物少、环境友好等优势而备受研究者的青睐，但是由于生物体内L-甲硫氨酸的合成途径复杂且受到多层次的调控等原因限制了微生物法合成L-甲硫氨酸的高效制备。
虽然国内外研究者在产L-甲硫氨酸菌株选育方面做了大量的研究工作，但是筛选到的野生型和人工诱变的营养缺陷型菌株由于菌体内部复杂的代谢调控导致L-甲硫氨酸生产能力低，不能满足工业化生产的需要。传统微生物育种方法在L-甲硫氨酸选育方面不再适用。随着基因工程、代谢工程等技术的发展，通过代谢工程的手段去改造微生物生产L-甲硫氨酸越来越受到各国学者的青睐。Usuda等从E.coli W3110出发构建了metJ和thrBC缺陷菌株，后在异亮氨酸平板上筛选metK自发突变的抗性菌株，将这些突变株的metK突变基因替换到之前构建的缺陷菌株后，获得L-甲硫氨酸生产菌，产量达到0.14g/L。最后，通过L-甲硫氨酸结构类似物(α-甲基蛋氨酸)筛选得到抗L-甲硫氨酸反馈抑制的高丝氨酸转琥珀酰基酶，过量表达其突变体后，L-甲硫氨酸产量提高到0.24g/L。郭谦从E.coli BL21(DE3)出发，首先通过Red同源重组敲除阻遏基因metJ，获得解除了metJ阻遏子阻遏的菌株；然后通过紫外诱变筛选得到抗DL-乙硫氨酸(蛋氨酸结构类似物)的突变株；最后通过质粒过表达L-蛋氨酸合成关键基因得到的菌株进行发酵条件和培养基优化后L-甲硫氨酸产量可达到0.395g/L。
我国是人口大国，对甲硫氨酸需求量随着时代的发展而日益增大，但是由于国内生产甲硫氨酸能力有限，大多依靠国外进口来维持甲硫氨酸需求量，且市场上绝大部分甲硫氨酸都是通过化学合成法合成，对环境等造成极大的污染，而通过基因编辑技术改造的重组大肠杆菌对甲硫氨酸进一步工业化生产有着极大的促进作用。
因此，采用代谢工程及合成生物学等手段改造微生物合成L-甲硫氨酸受到越来越多的关注。在甲硫氨酸合成代谢途径中，赖氨酸合成途径是其竞争途径，赖氨酸的合成会降低甲硫氨酸的合成效率，因此，大部分甲硫氨酸高产菌中均敲除了赖氨酸合成的相关基因lysA，以此提高甲硫氨酸的产量。但赖氨酸为微生物生长所需的必需氨基酸，lysA基因的敲除会显著影响微生物的生长，因此在后续发酵过程中通常采用在培养基中补加赖氨酸的方式来解决这一问题，这就导致了发酵成本、操作的复杂性及不确定性的提高。因此，甲硫氨酸的生物合成需要开发一种提高产量的同时尽量节约成本且生产可行的有效菌株。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌菌株及其在发酵产L-甲硫氨酸中的应用，本发明利用代谢工程和基因编辑技术构建高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌菌株，有效提高了L-甲硫氨酸产量的同时在培养基中无需额外添加其他必需氨基酸，对甲硫氨酸进一步工业化生产有着极大的促进作用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以赖氨酸敲除菌株E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株，在基因组上对lysA基因进行原位回补，并将lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，在pAm的质粒上过表达gltA基因和malY基因获得的。
所述的出发菌株E.coli W3110 M2/pAm基因型为E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pA*Ham，质粒pA*Ham为用trc99A质粒的trc强启动子增强metAfbr、yjeH、serAfbr基因，参照文献(Jian-Feng Huang et al2018Systematic Analysis of Bottlenecks in a Multibranched and MultilevelRegulated Pathway:The Molecular Fundamentals of L-Methionine Biosynthesis inEscherichia coli)中E.coli W3110 IJAHFEBC/pAm的构建。
所述PfliA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述lysA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，gltA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，malY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1:
acccctcatttcacccactaatcgtccgattaaaaaccctgcagaaacggataatcatgccgataactcatataacgcagggc tgtttatc.
SEQ ID NO.2:
atgccacattcactgttcagcaccgataccgatctcaccgccgaaaatctgctgcgtttgcccgctgaatttggctgcccggtgtgggtctacgatgcgcaaattattcgtcggcagattgcagcgctgaaacagtttgatgtggtgcgctttgcacagaaagcctgttccaatattcatattttgcgcttaatgcgtgagcagggcgtgaaagtggattccgtctcgttaggcgaaatagagcgtgcgttggcggcgggttacaatccgcaaacgcaccccgatgatattgtttttacggcagatgttatcgatcaggcgacgcttgaacgcgtcagtgaattgcaaattccggtgaatgcgggttctgttgatatgctcgaccaactgggccaggtttcgccagggcatcgggtatggctgcgcgttaatccggggtttggtcacggacatagccaaaaaaccaataccggtggcgaaaacagcaagcacggtatctggtacaccgatctgcccgccgcactggacgtgatacaacgtcatcatctgcagctggtcggcattcacatgcacattggttctggcgttgattatgcccatctggaacaggtgtgtggtgctatggtgcgtcaggtcatcgaattcggtcaggatttacaggctatttctgcgggcggtgggctttctgttccttatcaacagggtgaagaggcggttgataccgaacattattatggtctgtggaatgccgcgcgtgagcaaatcgcccgccatttgggccaccctgtgaaactggaaattgaaccgggtcgcttcctggtagcgcagtctggcgtattaattactcaggtgcggagcgtcaaacaaatggggagccgccactttgtgctggttgatgccgggttcaacgatctgatgcgcccggcaatgtacggtagttaccaccatatcagtgccctggcagctgatggtcgttctctggaacacgcgccaacggtggaaaccgtcgtcgccggaccgttatgtgaatcgggcgatgtctttacccagcaggaagggggaaatgttgaaacccgcgccttgccggaagtgaaggcaggtgattatctggtactgcatgatacaggggcatatggcgcatcaatgtcatccaactacaatagccgtccgctgttaccagaagttctgtttgataatggtcaggcgcggttgattcgccgtcgccagaccatcgaagaattactggcgctggaattgctttaa.
SEQ ID NO.3:
atggctgatacaaaagcaaaactcaccctcaacggggatacagctgttgaactggatgtgctgaaaggcacgctgggtcaagatgttattgatatccgtactctcggttcaaaaggtgtgttcacctttgacccaggcttcacttcaaccgcatcctgcgaatctaaaattacttttattgatggtgatgaaggtattttgctgcaccgcggtttcccgatcgatcagctggcgaccgattctaactacctggaagtttgttacatcctgctgaatggtgaaaaaccgactcaggaacagtatgacgaatttaaaactacggtgacccgtcataccatgatccacgagcagattacccgtctgttccatgctttccgtcgcgactcgcatccaatggcagtcatgtgtggtattaccggcgcgctggcggcgttctatcacgactcgctggatgttaacaatcctcgtcaccgtgaaattgccgcgttccgcctgctgtcgaaaatgccgaccatggccgcgatgtgttacaagtattccattggtcagccatttgtttacccgcgcaacgatctctcctacgccggtaacttcctgaatatgatgttctccacgccgtgcgaaccgtatgaagttaatccgattctggaacgtgctatggaccgtattctgatcctgcacgctgaccatgaacagaacgcctctacctccaccgtgcgtaccgctggctcttcgggtgcgaacccgtttgcctgtatcgcagcaggtattgcttcactgtggggacctgcgcacggcggtgctaacgaagcggcgctgaaaatgctggaagaaatcagctccgttaaacacattccggaatttgttcgtcgtgcgaaagacaaaaatgattctttccgcctgatgggcttcggtcaccgcgtgtacaaaaattacgacccgcgcgccaccgtaatgcgtgaaacctgccatgaagtgctgaaagagctgggcacgaaggatgacctgctggaagtggctatggagctggaaaacatcgcgctgaacgacccgtactttatcgagaagaaactgtacccgaacgtcgatttctactctggtatcatcctgaaagcgatgggtattccgtcttccatgttcaccgtcattttcgcaatggcacgtaccgttggctggatcgcccactggagcgaaatgcacagtgacggtatgaagattgcccgtccgcgtcagctgtatacaggatatgaaaaacgcgactttaaaagcgatatcaagcgttaa.
SEQ ID NO.4:
atgttcgatttttcaaaggtcgtggatcgtcatggcacatggtgtacacagtgggattatgtcgctgaccgtttcggcactgctgacctgttaccgttcacgatttcagacatggattttgccactgccccctgcattatcgaggcgctgaatcagcgcctgatgcacggcgtatttggctacagccgctggaaaaacgatgagtttctcgcggctattgcccactggttttccacccagcattacaccgccatcgattctcagacggtggtgtatggcccttctgtcatctatatggtttcagaactgattcgtcagtggtctgaaacaggtgaaggcgtggtgatccacacacccgcctatgacgcattttacaaggccattgaaggtaaccagcgcacagtaatgcccgttgctttagagaagcaggctgatggttggttttgcgatatgggcaagttggaagccgtgttggcgaaaccagaatgtaaaattatgctcctgtgtagcccacagaatcctaccgggaaagtgtggacgtgcgatgagctggagatcatggctgacctgtgcgagcgtcatggtgtgcgggttatttccgatgaaatccatatggatatggtttggggcgagcagccgcatattccctggagtaatgtggctcgcggagactgggcgttgctaacgtcgggctcgaaaagtttcaatattcccgccctgaccggtgcttacgggattatagaaaatagcagtagccgcgatgcctatttatcggcactgaaaggccgtgatgggctttcttccccttcggtactggcgttaactgcccatatcgccgcctatcagcaaggcgcgccgtggctggatgccttacgcatctatctgaaagataacctgacgtatatcgcagataaaatgaacgccgcgtttcctgaactcaactggcagatcccacaatccacttatctggcatggcttgatttacgtccgttgaatattgacgacaacgcgttgcaaaaagcacttatcgaacaagaaaaagtcgcgatcatgccggggtatacctacggtgaagaaggtcgtggttttgtccgtctcaatgccggctgcccacgttcgaaactggaaaaaggtgtggctggattaattaacgccatccgcgctgttcgttaa.
本发明所述重组大肠杆菌按如下步骤构建：
(1)以E.coli W3110 M2/pAm(简写为M2)为出发菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将该工程菌基因组中lysA基因进行原位回补，得到工程菌E.coli W3110M2-lysA-ATG/pAm；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm基因组中lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，得到工程菌E.coli W3110M2-PfliA-lysA/pAm；
(3)以菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的gltA基因，将质粒转化到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA中得到工程菌E.coli W3110M2-PfliA-lysA/pAm gltA；
(4)以菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的malY基因，将质粒转化到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA中得到工程菌E.coliW3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY，即为所述发酵过程中无需外源添加必需氨基酸赖氨酸且能够高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌。
本发明还提供一种所述重组大肠杆菌在无外源氨基酸作用下生产L-甲硫氨酸的应用，所述的应用为：将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在25-35℃、100-200rpm条件下发酵培养(优选30℃、180rpm、48h)，获得含L-甲硫氨酸的发酵液；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L，CaCO310g/L、VB12 0.2μg/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然，其中CaCO3和VB12在接种时加入；微量元素溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·8H2O5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为去离子水。
所述重组大肠杆菌接种前先进行扩大培养，再将扩大培养的种子液以体积浓度1-5％(优选5％)的接种量接种到发酵培养基，所述扩大培养是将所述重组大肠杆菌接种到含50mg/L卡那霉素(Kan)的LB培养基中，37℃培养8-12h，获得扩大培养液；所述LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
本发明通过(1)回补赖氨酸合成途径，减少赖氨酸缺陷所造成的菌体生长困难等情况，进一步消除后期发酵过程培养基中需添加必需氨基酸的操作困难性；(2)自动调节减弱赖氨酸合成途径，减少碳源合成赖氨酸支路的途径，从而提高大肠杆菌合成L-甲硫氨酸的糖酸转化率；(3)强化三羧酸循环，促进大肠杆菌生长；(4)强化大肠杆菌L-甲硫氨酸合成途径的硫模块，增强大肠杆菌对半胱氨酸的利用能力。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明通过回补赖氨酸合成途径，并通过自我调节启动子原位替换lysA基因启动子，从而动态调节赖氨酸合成途径，实现碳源的高效利用，提高L-甲硫氨酸合成的糖酸转化率；通过加强gltA基因从而增强三羧酸循环，提高菌体代谢过程所需能量及前体物质，并使碳源往中心代谢途径走，增加菌体量；通过加强malY基因，强化菌体对中间代谢物半胱氨酸的利用途径，解除大肠杆菌因半胱氨酸积累而产生的代谢抑制，最后得到含有质粒的高产菌株，菌株在发酵过程中无需外源添加必需氨基酸赖氨酸也可以生长良好，降低了发酵成本，解决了发酵过程中赖氨酸添加时机的不确定性，降低了发酵调控的操作难度，使摇瓶中L-甲硫氨酸产量从添加赖氨酸获得的2.44g/L提高至无外源氨基酸添加时的2.96g/L。
(四)附图说明
图1为L-甲硫氨酸代谢途径和改造位点示意图。
图2为E.coli W3110 M2/pAm(简写为M2)、E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm(简写为M2(lysA-ATG))、E.coli W3110 M2-lysA-GTG/pAm(简写为M2(lysA-GTG))的OD600和L-甲硫氨酸效价变化图。
图3为E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm(简写为AM)、E.coli W3110M2-PfliC-lysA/pAm(简写为CM)、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA/pAm(简写为GM)的OD600和L-甲硫氨酸效价变化图。
图4为E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA(简写为AMA)的OD600和L-甲硫氨酸效价变化图。
图5为E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY(简写为AMAY)的OD600和L-甲硫氨酸效价变化图。
图6为pAm质粒图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
所述室温为25-30℃。菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(ColiGenetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏号CGSC#4474，已在专利US2009/0298132A1，US2010/0248311A1中公开。
本发明出发菌株E.coli W3110 M2/pAm以及质粒pAm(质粒图谱见图6)来自文献(Jian-Feng Huang et al 2018，Systematic Analysis of Bottlenecks in aMultibranched and Multilevel Regulated Pathway:The Molecular Fundamentals ofL-Methionine Biosynthesis in Escherichia coli)中的E.coli W3110 IJAHFEBC/pAm。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
实施例1：L-甲硫氨酸高产菌株的发酵方法以及含量的测定
1、发酵方法：
将构建的菌株接种到10mL含50mg/L卡那霉素(Kan)的LB培养基中，37℃培养8-12h，再将培养液按体积浓度5％的接种量接种至20mL含50mg/L的Kan的发酵培养基中，在30℃、180rpm条件下发酵培养48h，获得发酵液。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O32g/L、酵母提取物2g/L，CaCO3 10g/L、VB12 0.2μg/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然，其中CaCO3和VB12在接种时加入；微量元素溶液组成为：MgSO4·7H2O500g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为去离子水。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
2、检测方法：
发酵结束后，取1mL发酵液，12000rpm室温离心10min，获得上清液和沉淀。沉淀加入体积浓度30％的乙酸水溶液，用移液枪吹匀溶解去除多余的CaCO3，采用分光光度计(UV-1600)测定OD600获取菌体量；利用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯(CNBF)作为衍生化试剂采用柱前衍生，利用赛默飞高效液相色谱仪(HPLC，UltiMate 3000)进行L-甲硫氨酸的检测，分析氨基酸效价。
高效液相色谱仪检测条件为：采用C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；紫外检测器，检测波长为260nm，进样量10μL；柱温30℃；流动相使用AB两相梯度洗脱，A相纯乙腈，B相为pH4.9三乙胺缓冲液，水：乙腈：三乙胺＝84.8：15：0.2(体积比)，流速0.8mL/min。
实施例2：构建有效菌株E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm及其摇瓶发酵以E.coliW3110 M2/pAm为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang etal.2015Multigene Editing in the Eshcrichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，在基因组上进行lysA基因原位回补，具体操作如下：
(1)构建pTarget-lysA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模板，表2中lysA-PAM-F/lysA-PAM-R为引物PCR扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，接种至含50mg/L壮观霉素的LB平板，37℃培养12h，筛选能够生长的菌落，测序验证获得正确的pTarget-lysA质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-lysA-ATG质粒：以E.coli W3110基因组为模板，表2中lysA-PF与lysA-PR为引物扩增获得PCR产物，用Clean up试剂盒纯化该PCR产物，得到donor DNA片段。以步骤(1)构建的pTarget-lysA质粒为模板，以表2中pTD-Line-F/pTD-Line-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收，得到线性化pTarget-lysA质粒；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pTarget-lysA质粒、donor DNA片段连接在一起，通过测序验证，得到pTD-lysA-ATG质粒。
(3)构建pTD-lysA-GTG质粒：以步骤(2)pTD-lysA质粒为模板，表2中GTG-PF与GTG-PR为引物扩增获得PCR产物，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，接种至含50mg/L壮观霉素的LB平板，37℃培养12h，筛选能够生长的菌落，测序验证获得正确的pTD-lysA-GTG质粒。
(4)制备E.coli W3110 M2化转感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3ed Edition,99-102)的描述。
(5)将pCas9质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110 M2化转感受态细胞中，挑选单克隆到含50mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μL 1mol/L的L-阿拉伯糖水溶液，150rpm、30℃培养至OD600＝0.4～0.6；5000rpm，4℃离心8min，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3ed Editing,99-102)的描述。
(6)取150ng步骤(2)制备的pTD-lysA-ATG质粒与100μL步骤(5)制备的电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴2min，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基，立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后，涂布到含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养18-20h，以lysA-PF和lysA-PR为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段3000bp左右的片段，则证明是E.coli W3110 M2-lysA-ATG阳性菌落。同样条件下，将pTD-lysA-ATG质粒替换为pTD-lysA-GTG质粒，得到E.coli W3110 M2-lysA-GTG阳性菌落。
(7)pTarget和pCas9质粒消除：挑取步骤(6)阳性单菌落分别接种到含1mM IPTG和50mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养，次日菌液划线于含50mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含50mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含50mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTD-lysA-ATG质粒和pTD-lysA-ATG质粒成功消除，挑取pTD-lysA-ATG质粒和pTD-lysA-ATG质粒成功消除的单菌落于LB试管，42℃过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于50mg/L卡那霉素的LB平板在30℃培养，不能在含50mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas9质粒成功消除，最终得到无质粒菌株E.coli W3110 M2-lysA-ATG和E.coli W3110 M2-lysA-GTG，按步骤(4)方法制备感受态。
(8)将pAm质粒导入步骤(7)制备的E.coli W3110 M2-lysA-ATG和E.coliW3110M2-lysA-GTG感受态中，得到E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm和E.coli W3110M2-lysA-GTG/pAm。
(9)将步骤(8)构建的生产菌株E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm和E.coliW3110M2-lysA-GTG/pAm，按照实施例1方法进行摇瓶发酵和检测，以E.coli W3110 M2/pAm为对照组。OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图2所示，图2中M2代表E.coli W3110M2/pAm，M2(lysA-ATG)代表菌株E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm，M2(lysA-GTG)代表菌株E.coli W3110 M2-lysA-GTG/pAm。
由图2可见，本实施例中出发菌株M2为实验室前期构建的赖氨酸敲除菌，在培养基中补加赖氨酸的情况下，L-甲硫氨酸的摇瓶发酵产量可以达到2.44g/L，当在基因组上回补lysA基因后，获得ATG和GTG回补菌株，两株菌在没有外源添加赖氨酸的情况下仍然生长良好，OD600可以分别达到9.98和9.43，尤其是回补ATG后其生长显著高于M2菌株。但是L-甲硫氨酸产量明显降低，分别降为1.54g/L和1.78g/L，说明lysA基因回补后碳源更多地代谢合成赖氨酸，并进一步被菌体利用进行生长，从而影响了L-甲硫氨酸的合成，这进一步证明了lysA基因的削弱对L-甲硫氨酸产量有极大的影响，也为后期对lysA基因节点的改造起到指导作用。
实施例3：构建有效菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-lysA-2质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模板，以表2中lysA-PAM-F-2/lysA-PAM-R-2为引物PCR扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，接种至含50mg/L壮观霉素的LB平板，37℃培养12h，筛选能够生长的菌落，测序验证获得正确的pTarget-lysA-2质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-lysA-2质粒：以E.coli W3110基因组为模板，L-fliA-up-F、L-fliA-up-R、L-fliA-down-F、L-fliA-down-R为引物获得带有PfliA启动子调控lysA基因的上下游两个PCR产物，Clean up试剂盒回收后进行融合PCR获得donor DNA，以步骤(1)构建的pTarget-lysA-2质粒为模板，以表2中pTD-Line-F/pTD-Line-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收，得到线性化pTarget-lysA-2质粒；按照(Onestep clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pTarget-lysA-2质粒、donor DNA片段连接在一起，通过测序验证，得到pTD-lysA-2质粒。
(3)构建pTD-lysA-3质粒：以E.coli W3110基因组为模板，L-fliA-up-F、L-fliC-up-R、L-fliC-down-F、L-fliA-down-R为引物获得带有PfliC启动子调控lysA基因的上下游两个PCR产物，Clean up试剂盒回收后进行融合PCR获得donor DNA。以步骤(1)构建的pTarget-lysA-2质粒为模板，以表2中pTD-Line-F/pTD-Line-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收，得到线性化pTarget-lysA-2质粒；按照(Onestep clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pTarget-lysA-2质粒、donor DNA片段连接在一起，通过测序验证，得到pTD-lysA-3质粒。
(4)构建pTD-lysA-4质粒：以E.coli W3110基因组为模板，L-fliA-up-F、L-flgC-up-R、L-flgC-down-F、L-fliA-down-R为引物获得带有PflgC启动子调控lysA基因的上下游两个PCR产物，Clean up试剂盒回收后进行融合PCR获得donor DNA。以步骤(1)构建的pTarget-lysA-2质粒为模板，以表2中pTD-Line-F/pTD-Line-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收，得到线性化pTarget-lysA-2质粒；按照(Onestep clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pTarget-lysA-2质粒、donor DNA片段连接在一起，通过测序验证，得到pTD-lysA-4质粒。
(5)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入按实施例2方法制备的E.coliW3110 M2-lysA-ATG感受态中，并将pTD-lysA-2质粒、pTD-lysA-3质粒、pTD-lysA-4质粒导入到电转感受态细胞中，分别得到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA、E.coli W3110M2-PfliC-lysA、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA菌株。
(6)构建分别得到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA、E.coli W3110 M2-PfliC-lysA、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA阳性菌落，构建方法同实施例2步骤(6)。
(7)质粒消除：实施方法同实施例2步骤(7)，获得无质粒菌株E.coli W3110M2-PfliA-lysA、E.coli W3110 M2-PfliC-lysA、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA。
(8)将pAm质粒分别导入步骤(7)的采用实施例2步骤(4)方法制备的E.coli W3110M2-PfliA-lysA、E.coli W3110 M2-PfliC-lysA、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA感受态中，得到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm、E.coli W3110 M2-PfliC-lysA/pAm、E.coliW3110 M2-PflgC-lysA/pAm。
(9)将E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm、E.coli W3110 M2-PfliC-lysA/pAm、E.coli W3110 M2-PflgC-lysA/pAm根据实施例1方法进行发酵及检测，以E.coli W3110M2-lysA-ATG/pAm为对照组，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图3所示，图3中，M2(lysA)代表E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm，AM代表E.coli W3110M2-PfliA-lysA/pAm，CM代表E.coli W3110 M2-PfliC-lysA/pAm，GM代表E.coli W3110M2-PflgC-lysA/pAm。
由图3可见，动态启动子PfliA替换lysA启动子后，菌体在没有外源添加赖氨酸的情况下，L-甲硫氨酸产量从1.54g/L增加到2.38g/L，相比于另外2个动态调节启动子更优，这说明PfliA动态启动子的调控可有效动态调弱赖氨酸的合成，从而有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例4：构建有效菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA及其摇瓶发酵
(1)构建pAm gltA质粒：以pAm质粒为模板，以表2中gltAXIAN-F/gltAXIAN-R为引物，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，获得线性化pAm-Line质粒。以E.coli W3110基因组为模板，表2中gltA-F/gltA-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，得到gltA片段；按照(One stepclonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pAm-Line质粒、gltA片段连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到E.coli DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过引物Trc99A-VF/Trc99A-VR测序验证，获得pAm gltA质粒。
(2)制备E.coli W3110 M2-PfliA-lysA化学转化感受态，详细过程见(MolecularCloning:A Laboratory Manual,3ed Edition,99-102)的描述。
(3)将构建好的pAm gltA质粒，通过化学转化法转化到E.coli W3110M2-PfliA-lysA感受态中，获得E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA。
(4)将构建的生产菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA按照实施例1进行摇瓶发酵和检测，以E.coli W3110 M2-PfilA-lysA/pAm对照组，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图4所示，图4中AM代表E.coli W3110 M2-PfilA-lysA/pAm，AMA代表E.coliW3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA 。
由图4可见，在质粒上过表达gltA，菌体在没有外源添加赖氨酸的情况下，L-甲硫氨酸产量从2.38g/L增加到2.72g/L，这说明过表达gltA有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例5：构建有效菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY及其摇瓶发酵
(1)构建pAm gltA malY质粒：以实施例4构建的pAm gltA质粒为模板，以表2中malYXIAN-F/malYXIAN-R为引物，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，获得线性化pAm gltA-Line质粒；以E.coli W3110基因组为模板，表2中malY-F/malY-R为引物扩增，PCR产物经过DpnⅠ在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，得到malY片段；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing,China)说明书将线性化pAm-Line质粒、malY片段连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到E.coli DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过引物Trc99A-VF/Trc99A-VR测序验证，获得pAm gltA malY质粒。
(2)将构建好的pAm gltA malY质粒，通过化学转化法转化到E.coli W3110M2-PfliA-lysA感受态中，获得E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY。
(3)将构建的生产菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY，按照实施例1进行摇瓶发酵和检测，以E.coli W3110 M2-PfilA-lysA/pAm gltA对照组，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图5所示，图5中AMA代表E.coli W3110M2-PfilA-lysA/pAmgltA，AMAY代表E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY。
由图5可见，在质粒上过表达malY，菌体在没有外源添加赖氨酸的情况下，L-甲硫氨酸产量从2.72g/L增加到2.96g/L，这说明过表达malY有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
acccctcatt tcacccacta atcgtccgat taaaaaccct gcagaaacgg ataatcatgc 60
cgataactca tataacgcag ggctgtttat c 91
<210> 2
<211> 1263
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atgccacatt cactgttcag caccgatacc gatctcaccg ccgaaaatct gctgcgtttg 60
cccgctgaat ttggctgccc ggtgtgggtc tacgatgcgc aaattattcg tcggcagatt 120
gcagcgctga aacagtttga tgtggtgcgc tttgcacaga aagcctgttc caatattcat 180
attttgcgct taatgcgtga gcagggcgtg aaagtggatt ccgtctcgtt aggcgaaata 240
gagcgtgcgt tggcggcggg ttacaatccg caaacgcacc ccgatgatat tgtttttacg 300
gcagatgtta tcgatcaggc gacgcttgaa cgcgtcagtg aattgcaaat tccggtgaat 360
gcgggttctg ttgatatgct cgaccaactg ggccaggttt cgccagggca tcgggtatgg 420
ctgcgcgtta atccggggtt tggtcacgga catagccaaa aaaccaatac cggtggcgaa 480
aacagcaagc acggtatctg gtacaccgat ctgcccgccg cactggacgt gatacaacgt 540
catcatctgc agctggtcgg cattcacatg cacattggtt ctggcgttga ttatgcccat 600
ctggaacagg tgtgtggtgc tatggtgcgt caggtcatcg aattcggtca ggatttacag 660
gctatttctg cgggcggtgg gctttctgtt ccttatcaac agggtgaaga ggcggttgat 720
accgaacatt attatggtct gtggaatgcc gcgcgtgagc aaatcgcccg ccatttgggc 780
caccctgtga aactggaaat tgaaccgggt cgcttcctgg tagcgcagtc tggcgtatta 840
attactcagg tgcggagcgt caaacaaatg gggagccgcc actttgtgct ggttgatgcc 900
gggttcaacg atctgatgcg cccggcaatg tacggtagtt accaccatat cagtgccctg 960
gcagctgatg gtcgttctct ggaacacgcg ccaacggtgg aaaccgtcgt cgccggaccg 1020
ttatgtgaat cgggcgatgt ctttacccag caggaagggg gaaatgttga aacccgcgcc 1080
ttgccggaag tgaaggcagg tgattatctg gtactgcatg atacaggggc atatggcgca 1140
tcaatgtcat ccaactacaa tagccgtccg ctgttaccag aagttctgtt tgataatggt 1200
caggcgcggt tgattcgccg tcgccagacc atcgaagaat tactggcgct ggaattgctt 1260
taa 1263
<210> 3
<211> 1284
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60
ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120
ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180
gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240
tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300
tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360
ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420
gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480
gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540
attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600
atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660
gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720
accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780
tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840
tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900
ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960
gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020
atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080
aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140
accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200
agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260
tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284
<210> 4
<211> 1173
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atgttcgatt tttcaaaggt cgtggatcgt catggcacat ggtgtacaca gtgggattat 60
gtcgctgacc gtttcggcac tgctgacctg ttaccgttca cgatttcaga catggatttt 120
gccactgccc cctgcattat cgaggcgctg aatcagcgcc tgatgcacgg cgtatttggc 180
tacagccgct ggaaaaacga tgagtttctc gcggctattg cccactggtt ttccacccag 240
cattacaccg ccatcgattc tcagacggtg gtgtatggcc cttctgtcat ctatatggtt 300
tcagaactga ttcgtcagtg gtctgaaaca ggtgaaggcg tggtgatcca cacacccgcc 360
tatgacgcat tttacaaggc cattgaaggt aaccagcgca cagtaatgcc cgttgcttta 420
gagaagcagg ctgatggttg gttttgcgat atgggcaagt tggaagccgt gttggcgaaa 480
ccagaatgta aaattatgct cctgtgtagc ccacagaatc ctaccgggaa agtgtggacg 540
tgcgatgagc tggagatcat ggctgacctg tgcgagcgtc atggtgtgcg ggttatttcc 600
gatgaaatcc atatggatat ggtttggggc gagcagccgc atattccctg gagtaatgtg 660
gctcgcggag actgggcgtt gctaacgtcg ggctcgaaaa gtttcaatat tcccgccctg 720
accggtgctt acgggattat agaaaatagc agtagccgcg atgcctattt atcggcactg 780
aaaggccgtg atgggctttc ttccccttcg gtactggcgt taactgccca tatcgccgcc 840
tatcagcaag gcgcgccgtg gctggatgcc ttacgcatct atctgaaaga taacctgacg 900
tatatcgcag ataaaatgaa cgccgcgttt cctgaactca actggcagat cccacaatcc 960
acttatctgg catggcttga tttacgtccg ttgaatattg acgacaacgc gttgcaaaaa 1020
gcacttatcg aacaagaaaa agtcgcgatc atgccggggt atacctacgg tgaagaaggt 1080
cgtggttttg tccgtctcaa tgccggctgc ccacgttcga aactggaaaa aggtgtggct 1140
ggattaatta acgccatccg cgctgttcgt taa 1173
Claims (5)
1.一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌以E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株，在基因组上对lysA基因进行原位回补，并将lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，再在pAm的质粒上过表达gltA基因和malY基因获得的；
所述出发菌株E.coli W3110 M2/pAm基因型为E. coli W3110 ΔmetJ ΔmetI ΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pAm，质粒pAm为用ptrc99A质粒的trc强启动子增强metAfbr、yjeH、serAfbr基因；
所述PfliA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述lysA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，gltA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，malY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌按如下步骤构建：
（1）以E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将该工程菌基因组中lysA基因进行原位回补，得到工程菌E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm；
（2）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2-lysA-ATG/pAm基因组中lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，得到工程菌E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm；
（3）以菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的gltA基因，将质粒转化到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA中得到工程菌E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA；
（4）以菌株E.coli W3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的malY基因，将质粒转化到E.coli W3110 M2-PfliA-lysA中得到重组大肠杆菌E.coliW3110 M2-PfliA-lysA/pAm gltA malY。
3.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在无外源氨基酸作用下生产L-甲硫氨酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在25-35℃、100-200rpm条件下发酵培养，获得含L-甲硫氨酸的发酵液；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L，CaCO3 10g/L、VB12 0.2μg/L、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然，其中CaCO3和VB12 在接种时加入；微量元素溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为去离子水。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述重组大肠杆菌接种前先进行扩大培养，再将扩大培养的种子液以体积浓度1-5%的接种量接种到发酵培养基，所述扩大培养是将所述重组大肠杆菌接种到含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃培养8-12h，获得扩大培养液；所述LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
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| CN (1) | CN114606253B (zh) |
Citations (6)
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-
2022
- 2022-03-14 CN CN202210244457.1A patent/CN114606253B/zh active Active
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| CN114606253A (zh) | 2022-06-10 |
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