CN114517173B - 合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，包括：宿主菌和转入该宿主菌的质粒载体，该质粒载体中导入了编码赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α‑氨基己二酸半醛脱氢酶的基因。所述宿主菌还敲除ldcC和cadA基因，整合dapA突变基因与lysC突变基因为T7强启动子，敲除了pgi基因，还整合了谷氨酸棒杆菌中多功能酶的编码基因ddh到dapD基因所在位置，并在ddh基因的上游整合T7强启动子。所述重组质粒载体上还连接有MscCG基因。本发明还提供一种上述合成高谷氨酸的工程菌的构建方法和应用。利用上述合成高谷氨酸的工程菌，以葡萄糖为碳源来生产高谷氨酸，实现了高谷氨酸的高效生物合成。

Description

合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
高谷氨酸即α-氨基己二酸(α-Aminoadipic acid)，是一种非蛋白氨基酸，分子量161.16，分子式C6H11NO4，白色结晶体或者白色结晶粉末，是合成有机膦羧酸类药剂α-氨基己二酸-N，N-二甲叉膦酸，抗风湿药甲氨蝶呤衍生物以及青霉素和头孢菌素等β-内酰胺抗生素的前体。还可用作生理活性肽(如肽抗生素和肽激素)的末端修饰剂。高谷氨酸对星形胶质细胞具有特异毒性，是研究星形胶质细胞在发育和疾病中的作用的重要工具。现阶段高谷氨酸的合成依赖于化学合成法，生物合成的方法并没有相关报道。
目前合成高谷氨酸主要为化学合成法，主要有三条合成路线。第一条路线：以3-氰基丙醛为原料，在哌啶存在条件下和N-乙酰基-2-硫代乙内酰脲反应，再与磷、氢碘酸加热，最后通过水解得到产物；该方法的成本较高，收率低，不适合工业化生产。第二条路线：以2-氨基-6-羟基-己酸(赖氨酸)作为原料，由于原料成本较高，应用价值不高。第三条路线：以2-N-乙酰基-6-6氨基己酸乙酯作为原料，收率为60％。由此可见，采用化学方法合成高谷氨酸存在成本髙、收率低以及环境污染等问题，因此，有必要寻找一种新的方法来合成高谷氨酸。
发明内容
有鉴于此，本发明确有必要提供一种合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。
本发明的主要目的是从大量生物或微生物体内能够合成高谷氨酸的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现高谷氨酸的异源合成。为此，本发明选择了来源于细菌的赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶的相关基因，通过酶的表达，构建合成高谷氨酸的工程菌，实现联合赖氨酸生物合成高谷氨酸，进而实现利用简单碳源从头生物合成高谷氨酸。
为了实现上述目的，本发明提供了一种合成高谷氨酸的工程菌，包括：宿主菌和转入该宿主菌的质粒载体，该质粒载体中导入了编码赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因。
基于上述，所述宿主菌中敲除了编码赖氨酸脱羧酶基因的ldcC和cadA。所述合成高谷氨酸的工程菌中的宿主菌敲除了ldcC和cadA基因，能够抑制赖氨酸合成尸胺，减少了赖氨酸的损耗。
基于上述，所述宿主菌中包括编码天冬氨酸激酶的lysC突变基因和编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶的dapA突变基因，其中，所述lysC突变基因是将lysC原始基因中的第352位苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)，所述dapA突变基因是将dapA原始基因中的第118位组氨酸(His)突变为酪氨酸(Tyr)。进一步，所述宿主菌在进行重组的过程中，lysC突变基因与dapA突变基因的启动子为T7强启动子。所述宿主菌中包括lysC突变基因和dapA突变基因，可以有效解除赖氨酸对基因表达的反馈抑制作用。
基于上述，所述宿主菌中同时还敲除了糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶的基因pgi。
基于上述，所述宿主菌中还整合了谷氨酸棒杆菌中多功能酶的编码基因ddh到大肠杆菌基因组的四氢二吡啶琥珀酰酶编码基因dapD所在位置，并在ddh基因序列的上游整合T7强启动子；即，所述宿主菌敲除了编码四氢二吡啶琥珀酰酶编码基因dapD，并在基因dapD的原位上嵌入基因ddh。用一个异源多功能酶催化菌株原有的四步酶催化反应，缩短代谢途径。
基于上述，所述质粒载体中还导入谷氨酸棒杆菌中编码谷氨酸外排的基因MscCG。
本发明还提供一种上述生产高谷氨酸的工程菌的构建方法，包括步骤：
重组表达质粒将编码赖氨酸酮戊二酸还原酶的基因、编码酵母氨酸脱氢酶和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因连接至所述表达质粒上进行重组，获得质粒载体；
构建工程菌将所述质粒载体转化到所述宿主菌中，得到生产高谷氨酸的工程菌。
其中，所述表达质粒可以为pCS27、pSA74、pZE12-luc。优选地，模块优化后将编码赖氨酸酮戊二酸还原酶的基因构建至质粒pSA74；编码酵母氨酸脱氢酶与α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因构建至pZE12-luc，且在所述重组表达质粒的步骤中，编码酵母氨酸脱氢酶和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因采用PCR扩增处理替换强启动子Tac。
所述构建工程菌的步骤，在将所述质粒载体转化到所述宿主菌中之前，先利用Red同源重组法，敲除所述宿主菌中编码赖氨酸脱羧酶基因的ldcC和cadA。
所述构建工程菌的步骤，在将所述质粒载体转化到所述宿主菌中之前，在所述宿主菌内过表达所述lysC突变基因和所述dapA突变基因，且在宿主菌基因组上整合所述lysC突变基因和所述dapA突变基因为T7强启动子。
所述构建工程菌的步骤，在将所述质粒载体转化到所述宿主菌中之前，利用Red同源重组法，所述宿主菌同时还敲除了糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶的基因pgi；所述宿主菌还整合了谷氨酸棒杆菌中多功能酶的编码基因ddh到大肠杆菌基因组的四氢二吡啶琥珀酰酶dapD基因所在位置，并在ddh基因序列的上游整合T7强启动子。
所述重组表达质粒的步骤中还包括将过表达编码谷氨酸外排的基因MscCG，同时连接至所述表达质粒上进行重组获得所述质粒载体。
本发明还提供一种上述生产高谷氨酸的工程菌的应用，其中，按照体积比1％～5％的接种量，将上述生产高谷氨酸的工程菌接种到培养基中，在30℃～37℃、pH为5～8的条件下进行发酵处理，制得高谷氨酸；所述培养基中的碳源为葡萄糖。优选地，所述培养基包括：10～30g/L葡萄糖、1～3g/L酵母粉、12～20g/L(NH4)2SO4、1～3g/L KH2PO4、0～1.5g/LMgSO4、0～1.5g/L NaCl、0～4g/L NH4Cl、0～13g/L CaCO3、10～18mg/L CaCl2·2H2O。
基于上述，所述生产高谷氨酸的工程菌接种到培养基中进行发酵培养的过程中，添加3～10g/L的赖氨酸。优选地，赖氨酸在所述生产高谷氨酸的工程菌于所述培养基中发酵1～2.5h后加入。
本发明提供的上述生产高谷氨酸的工程菌联合赖氨酸合成高谷氨酸的途径可参考图1，上述生产高谷氨酸的工程菌在发酵过程中产生α-酮戊二酸，α-酮戊二酸和赖氨酸在赖氨酸酮戊二酸还原酶的作用下合成酵母氨酸，酵母氨酸在酵母氨酸脱氢酶的作用下形成谷氨酸和α-氨基己二酸半醛，其中α-氨基己二酸半醛在α-氨基己二酸半醛脱氢酶的作用下合成高谷氨酸，从而实现了联合赖氨酸生物合成高谷氨酸。
如图1所示，在本发明提供的上述生产高谷氨酸的工程菌中，葡萄糖经过磷酸戊糖途径然后进入三羧酸循环，从其中的草酰乙酸出发再经过二氨基庚二酸途径(DAP)可得到赖氨酸，经过外源赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶而实现以葡萄糖为简单碳源从头生物合成高谷氨酸，高谷氨酸的初始产量为249.93mg/L。
本发明提供的上述生产高谷氨酸的工程菌引入了基因调控策略，利用Red同源重组进行敲除，敲除了编码赖氨酸脱羧酶基因的ldcC和cadA，抑制尸胺合成，增加了赖氨酸的积累；整合了上游关键酶天冬氨酸激酶的lysC突变基因和编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶的dapA突变基因为T7强启动子，增加赖氨酸的前体供应；同时敲除糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶基因的pgi，使通量从糖酵解途径更多走向磷酸戊糖途径，通过增加NADPH的供应增加赖氨酸的积累量从而提高高谷氨酸产量。
进一步，本发明提供的上述生产高谷氨酸的工程菌中还敲除了宿主菌中编码四氢二吡啶琥珀酰酶的基因dapD，阻断大肠杆菌中的原有四步酶路径，同时在基因dapD的原位上整合入谷氨酸棒杆菌来源的编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh，并在ddh基因序列的上游整合T7强启动子，以更大程度增强ddh基因的表达量从而缩短代谢路径提高效率。
进一步，本发明提供的上述生产高谷氨酸的工程菌中引入谷氨酸棒杆菌中编码谷氨酸外排的基因MscCG，由于高谷氨酸与谷氨酸结构类似，通过增加其外排效率提高产量，最终产量达到2.39g/L。
因此，通过筛选出在体外具有活性的酶，获得本发明提供的上述合成高谷氨酸的工程菌；以该工程菌为基础，设计出如图1所示的高谷氨酸的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现高谷氨酸的高效生物合成。
附图说明
图1是本发明提供的生物合成高谷氨酸的路径图，其中，该图中的“虚线箭头”代表多步反应，“实线箭头”代表一步反应。
图2是本发明实施例1提供的工程菌BW1联合赖氨酸生产高谷氨酸的发酵结果图。
图3是本发明实施例采用的高谷氨酸标品的HPLC检测图。
图4是本发明实施例1中提供的工程菌BW1联合赖氨酸生产高谷氨酸的发酵产物的HPLC检测图。
图5是本发明实施例提供的工程菌BW1～BW3联合赖氨酸生产高谷氨酸的发酵结果图。
图6是本发明实施例3利用工程菌BW3从头合成生产高谷氨酸的发酵产物的HPLC检测图。
图7是本发明实施例3利用工程菌BW3从头合成生产高谷氨酸的发酵结果图。
图8是本发明实施例4提供的工程菌BW4生产高谷氨酸的发酵结果图。
图9是利用实施例4提供的工程菌BW5生产高谷氨酸的发酵结果图。
图10是本发明实施例4提供的工程菌BW6生产高谷氨酸的发酵结果图。
图11是本发明实施例4提供的工程菌BW7生产高谷氨酸的发酵结果图。
图12是本发明实施例5提供的工程菌株BW8生产高谷氨酸的发酵结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，替换启动子，敲除基因的方法、基因突变方法等，之后不再赘述。本发明中涉及的各种酶均来源于常用的物质。
以下实施例中，大肠杆菌菌株BW25113，trans5α和BL21(DE3)均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中trans5α用于载体构建，BL21(DE3)用于蛋白表达，BW25113则作为发酵用菌株。
实施例1联合赖氨酸生产高谷氨酸
重组质粒：pCS-lys1-lys9-reAASADH
本实施例提供的重组质粒pCS-lys1-lys9-reAASADH主要是将编码赖氨酸酮戊二酸还原酶Lys1的基因、编码酵母氨酸脱氢酶Lys9和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶reAASADH的基因连接至大肠杆菌表达载体pCS27获得，其中，所述赖氨酸酮戊二酸还原酶Lys1、酵母氨酸脱氢酶Lys9的基因来源于酿酒酵母，α-氨基己二酸半醛脱氢酶reAASADH来源于红球菌。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于细菌编码赖氨酸酮戊二酸还原酶Lys1、编码酵母氨酸脱氢酶Lys9和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶reAASADH的基因。通过将目的基因进行PCR扩增获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pCS27，获得pCS-lys1-lys9-reAASADH重组质粒(见表2)。
合成高谷氨酸的工程菌：重组大肠杆菌BW1
本实施例提供的重组大肠杆菌BW1(见表2)为含有pCS-lys1-lys9-reAASADH重组质粒的大肠杆菌菌株。本发明提供的合成高谷氨酸的工程菌对用于构建表达质粒的宿主菌株种类没有特殊要求，本发明实施例采用了BW25113菌株作为构建质粒的初始宿主。
重组大肠杆菌BW1的构建方法：首先挑取新鲜的BW25113菌落接种到4mL LB培养基中，37℃培养8～12h后，取1mL接种到100mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10mL 10％预冷的甘油洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10％甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90μL感受态加入2μL重组质粒pCS-lys1-lys9-reAASADH，冰上放置两分钟，电转后加入600μL LB培养基，洗出电转后细胞，37℃复苏1h，涂布到氨苄抗性平板，于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有卡纳抗性的4mL LB培养基中37℃培养8～10h，即可获得生产高谷氨酸的工程菌：含有重组质粒pCS-lys1-lys9-reAASADH的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌BW1表示。
重组大肠杆菌BW1的应用：联合赖氨酸通过发酵培养生产高谷氨酸
重组大肠杆菌BW1在生产高谷氨酸中的应用包括：在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW1工程单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M9培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度37℃，转速220rpm；其中，所述M9培养基包括：15g/L葡萄糖、2g/L酵母粉、1g/L KH2PO4、13.9g/L(NH4)2SO4、246.5mg/L MgSO4·7H2O、14.7mg/L CaCl2·2H2O、1g/L NaCl和3g/L NH4Cl，并根据实际情况加入相应抗生素。发酵2h后加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，并添加5g/L的赖氨酸，取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图2所示。从图2中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得409.03mg/L的高谷氨酸。
样品需进行柱前衍生化，具体衍生化方法如下：
衍生化试剂：第一种试剂为三乙胺溶液，使用移液枪吸取三乙胺溶液1.4mL于15mL离心管中(通风橱中操作)，再用吸取乙腈8.6mL并加入其中，将混合液涡旋均匀并存放于4℃冰箱中。第二种试剂为异硫氰酸苯酯溶液，使用精细天平称取异硫氰酸苯酯溶液135.18mg于15mL离心管中(通风橱中操作)，再用移液枪吸取乙腈10mL并加入其中，将混合液涡旋均匀并存放于4℃冰箱中。
衍生化方法：取样品(上清液)200μL(如果目标产物浓度较大，则需要先对样品进行稀释)。加入100μL试剂1三乙胺进行衍生化催化，再加入100μL试剂2异硫氰酸苯酯溶液进行反应，加入后进行震荡混匀，然后静置反应1h使衍生化反应充分进行。待上述反应结束后加入200μL正己烷终止反应进行萃取分离，充分震荡混匀，然后离心。目标产物在上述分层液体中下层，用一次性注射器吸取上述下层液，并将液体过膜后注入液相小导管中，再放置于液相小瓶中，盖上液相小瓶盖，做好标记，备用HPLC分析。
采用HPLC分析方法对目标产物进行检测，检测条件如下：
色谱柱：分离柱：Diamonsil C18，ID 5μm，250×4.6mm；
流动相：A为甲醇，B为1‰甲酸水溶液，柱温40℃，流速1mL/min检测波长为254nm。梯度洗脱程序如下表1所示：
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 20 80
10 40 60
20 80 20
25 80 20
27 20 80
30 20 80
配制高谷氨酸标准溶液，浓度分别为0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L，经上述衍生化处理和HPLC检测，图3为500mg/L高谷氨酸标品的HPLC图，出峰时间为19.2min，图4为发酵产物的HPLC图，19.2min左右出峰与标品峰出峰时间一致，可以证明：本实施例提供的重组大肠杆菌BW1联合赖氨酸通过发酵培养可以生产高谷氨酸。
实施例2通过模块优化，选择最优质粒拷贝组合实现联合赖氨酸合成高谷氨酸
本实施例提供的重组质粒pCS-lys1和pSA-lys1主要是将编码赖氨酸酮戊二酸还原酶lys1的基因分别连接至大肠杆菌表达载体pCS27、pSA74获得。pZE-tac-lys9-reAASADH是将编码酵母氨酸脱氢酶Lys9和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶reAASADH的基因插入pZE12-luc，并采用Tac启动子获得。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于酿酒酵母的编码赖氨酸酮戊二酸还原酶Lys1的基因，通过将目的基因进行PCR扩增获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pCS27获得pCS-lys1重组质粒，插入pSA74获得pSA-lys1(见表2)。通过设计引物两次PCR，将原有Lac启动子替换为Tac启动子，并将来源于酿酒酵母酵母氨酸脱氢酶的基因lys9和来源于红球菌的α-氨基己二酸半醛脱氢酶基因reAASADH插入pZE-tac。
本发明实施例采用了BW25113菌株作为构建质粒的初始宿主。首先挑取新鲜的BW25113菌落接种到4mL LB培养基中，37℃培养8～12h后，取1mL接种到100mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10mL 10％预冷的甘油洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10％甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90μL感受态分别加入2μL重组质粒pCS-lys1和1μL pZE-tac-lys9-reAASADH，3μL pSA-lys1和1μL pZE-tac-lys9-reAASADH，冰上放置两分钟，电转后加入600μL LB培养基，洗出电转后细胞，37℃复苏1h，涂布到氨苄抗性平板,于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有卡纳抗性的4mL LB培养基中37℃培养8～10h，即可获得生产高谷氨酸的工程菌：含有重组质粒pCS-lys1和pZE-tac-lys9-reAASADH的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌BW2表示。含有重组质粒pSA-lys1和pZE-tac-lys9-reAASADH的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌BW3表示。
重组大肠杆菌BW2和BW3的应用：联合赖氨酸通过发酵培养生产高谷氨酸
重组大肠杆菌BW2和BW3在生产高谷氨酸中的应用包括：在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW2和BW3的工程单菌落分别接种到对应的4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL实施例1提供的M9培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度37℃，转速220rpm。发酵2小时后加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，并添加5g/L的赖氨酸，温度设为30℃。分别在发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图5所示。从图5中可以看出：采用本实施例提供的方法，菌株BW3可获得574.38mg/L的高谷氨酸。
实施例3以葡萄糖为碳源从头合成高谷氨酸
采用实施例2提供的重组大肠杆菌BW3，在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW3工程单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M10培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度37℃，转速220rpm；发酵3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，发酵所述M10培养基包括：葡萄糖25g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 1g/L，CaCO3 10g/L和14.7mg/L CaCl2·2H2O，并根据实际情况加入相应抗生素。分别在发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量。参照实施例1提供的方法，HPLC液相检测结果如图6所示，发酵结果如图7所示。结合图3和图6，图6在19.2min左右也形成有峰，所以本实施例利用重组大肠杆菌BW3发酵可以实现以葡萄糖为碳源，从头合成合成高谷氨酸。从图7中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得249.93mg/L高谷氨酸。
实施例4通过增加赖氨酸积累提高以葡萄糖源头合成高谷氨酸的产量
本实施例通过以下调控策略实现增加赖氨酸的积累：
(1)利用RED同源重组敲除BW25113中赖氨酸脱羧酶的ldcC和cadA基因，获得菌株BW△ldcC△cadA，将质粒pSA-lys1与pZE-tac-lys9-reAASADH电转入BW△ldcC△cadA进行发酵实验，获得从头合成高谷氨酸的工程菌株BW4(见表2)。
重组质粒pSA-lysC-dapA-lys1主要是将编码二氢吡啶二羧酸合酶的编码基因dapA与二氢吡啶二羧酸还原酶的编码基因lysC插入pSA-lys1获得。将pSA-lysC-dapA-lys1与pZE-tac-lys9-reAASADH电转入BW△ldcC△cadA，获得从头合成高谷氨酸的工程菌株BW5(见表2)。
参照实施例3提供的合成高谷氨酸的工程菌的应用，在上述重组大肠杆菌BW4和BW5平板上挑取新鲜单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M10培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度37℃，转速220rpm。分别在发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图8和图9所示。从图8中可以看出，利用合成高谷氨酸的工程菌株BW4可获得初始浓度305.38mg/L的高谷氨酸；本实施例提供的合成高谷氨酸的工程菌株BW5经过表达上游关键酶基因lysC和dapA，高谷氨酸产量达到453.73mg/L，如图9所示。
(2)基于上述，利用RED同源重组技术，在菌株BW△ldcC△cadA的基础上整合上游关键酶编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶的dapA突变基因与编码天冬氨酸激酶的lysC突变基因的启动子为T7强启动子，其中，所述dapA突变基因是将dapA原始基因中的第118位组氨酸(His)突变为酪氨酸(Tyr)，所述lysC突变基因是将lysC原始基因中的第352位苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)；同时敲除编码磷酸葡萄糖异构酶基因的pgi使通量从糖酵解途径更多走向磷酸戊糖途径增加NADPH的供应，获得菌株BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi。将质粒pSA-lys1和pZE-tac-lys9-reAASADH电转入BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi中，获得从头合成高谷氨酸的菌株BW6(见表2)。
参照实施例3提供的合成高谷氨酸的工程菌的应用，在上述重组大肠杆菌BW6平板上挑取新鲜单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M10培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度30℃或37℃，转速220rpm。分别在发酵12h、24h、48h、72h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图10所示。从图10中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得1.88g/L的高谷氨酸。
(3)利用RED同源重组技术，在菌株BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi的基础上删除基因dapD，从而阻断从四氢二吡啶生成顺-二氨基庚二酸需要4个酶催化进行四步反应，其中，该四步反应利用的四个酶的编码基因分别为dapD、dapC、dapE和dapF，在敲除的dapD基因的原位上整合入编码谷氨酸棒杆菌中编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh以缩短代谢途径，并整合ddh启动子为T7强启动子，获得菌株BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi-::T7ddh。将质粒pSA-lys1和pZE-tac-lys9-reAASADH电转入BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi-::T7ddh，获得菌株BW7(见表2)。
参照实施例3提供的合成高谷氨酸的工程菌的应用，在上述重组大肠杆菌BW7平板上挑取新鲜单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M10培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度30℃或37℃，转速220rpm。分别在发酵12h、24h、48h、72h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图11所示。从图11中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得2.07g/L的高谷氨酸。
实施例5过表达外排谷氨酸蛋白，加快目标产物高谷氨酸的产出速度
本实施例提供的重组质粒pSA-lys1-MscCG主要是将编码谷氨酸外排酶的基因MscCG插入质粒pSA-lys1获得。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。PCR扩增来源于谷氨酸棒杆菌的MscCG基因，获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒质粒pSA-lys1，获得pSA-lys1-MscCG重组质粒(见表2)。将质粒pSA-lys1-MscCG电转导入BW△cadA△ldcC-::T7(dapA)-::T7(lysC)-△pgi-::T7ddh，获得菌株BW8(见表2)。
参照实施例3提供的合成高谷氨酸的工程菌的应用，在上述重组大肠杆菌BW8平板上挑取三个平行的新鲜单菌落接种到4mL含有相应抗生素的LB试管中，37℃培养12h后，转入含有相应抗生素的50mL M10培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1％，发酵温度30℃或37℃，转速220rpm。分别在发酵12h、24h、48h、72h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图12所示。从图12中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得2.39g/L的高谷氨酸。
表1本发明各实施例中使用的质粒和菌株列表
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，包括：宿主菌和转入该宿主菌的质粒载体，该质粒载体中导入了编码赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因，所述宿主菌为大肠杆菌BW25113菌株，所述赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶均来源于酿酒酵母，所述α-氨基己二酸半醛脱氢酶来源于红球菌。
2.根据权利要求1所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中敲除了编码赖氨酸脱羧酶基因的ldcC和cadA。
3.根据权利要求1或2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中包括编码天冬氨酸激酶的lysC突变基因和编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶的dapA突变基因，并且在所述lysC突变基因和dapA突变基因序列上游整合T7强启动子；其中，所述lysC突变基因是将lysC原始基因中的第352位苏氨酸突变为异亮氨酸，所述dapA突变基因是将dapA原始基因中的第118位组氨酸突变为酪氨酸。
4.根据权利要求2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中同时还敲除了糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶的基因pgi。
5.根据权利要求2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中还整合了谷氨酸棒杆菌中多功能酶的编码基因ddh到大肠杆菌基因组的四氢二吡啶琥珀酰酶编码基因dapD所在位置，并在ddh基因序列的上游整合T7强启动子。
6.根据权利要求1或2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述质粒载体中还导入谷氨酸棒杆菌中编码谷氨酸外排的基因MscCG。
7.一种权利要求1～6任一项所述的生产高谷氨酸的工程菌的构建方法，包括步骤：
重组表达质粒 将编码赖氨酸酮戊二酸还原酶的基因、编码酵母氨酸脱氢酶和编码α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因连接至所述表达质粒上进行重组，获得质粒载体；
构建工程菌 将所述质粒载体转化到所述宿主菌中，得到生产高谷氨酸的工程菌。
8.根据权利要求7所述的生产高谷氨酸的工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组表达质粒的步骤中还包括将过表达编码谷氨酸外排的基因MscCG，同时连接至所述表达质粒上进行重组获得所述质粒载体。
9.一种权利要求1～6任一项所述的生产高谷氨酸的工程菌的应用，其特征在于，按照体积比1%～5%的接种量，将上述生产高谷氨酸的工程菌接种到培养基中，在30℃～37℃、pH为5～8的条件下进行发酵处理，制得高谷氨酸；所述培养基中的碳源为葡萄糖。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生产高谷氨酸的工程菌接种到培养基中进行发酵培养的过程中，添加3～10 g/L的赖氨酸。
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