CN113817761B - 一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用。该大肠杆菌底盘菌的制备方法为：提高宿主菌(大肠杆菌或突变型大肠杆菌)中四氢吡啶二羧酸：N‑乙酰转移酶、N‑乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N‑乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O‑乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O‑乙酰转移酶的表达量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N‑琥珀酰转移酶和同型丝氨酸：O‑琥珀酰转移酶的表达量和/或活性，从而获得无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌。实验证明，该大肠杆菌底盘菌可以减少碳丢失率，提高以中心代谢中间产物(如乙酰辅酶A、丙酮酸、α‑酮戊二酸)为前体合成目标产品的能力。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用。
背景技术
三羧酸循环(TCA cycle)是大肠杆菌中心碳代谢的重要组成部分。众多生物基化学品的生物合成都依赖于三羧酸循环中间代谢物α-酮戊二酸。同时敲除大肠杆菌三羧酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA)，迫使更多α-酮戊二酸流向目的产物合成，是促进目标产品合成的最佳方式。
大肠杆菌在无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行有氧生长时，三羧酸循环承担着彻底氧化碳源为细胞生长提供能量与还原力的功能，也提供了众多的细胞生长必需的代谢物。如果同时敲除α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA)，或敲除sucA，破坏三羧酸循环代谢，往往导致菌株生长缓慢，特别是在无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源的有氧生长受到限制。目前，解决的主要策略有两种：一是对α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)的表达进行动态调控，在细胞生长和目标产品的合成中进行开关调控，这种策略中的调控元件过于复杂，往往影响了目的产物合成途径，而且过程复杂难以进行工业化应用；二是利用α-酮戊二酸依赖的双加氧酶重构三羧酸循环，将目标产品的生产与工程菌的生长关联起来，这对α-酮戊二酸依赖的双加氧酶活力有较高要求，而且不适用于生产有一定细胞毒性的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，使菌株在三羧酸循环中断或无三羧酸循环的情况下，在无机盐基础培养基中能以葡萄糖或甘油为唯一碳源的有氧生长。
本发明首先保护制备无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的方法，可包括如下步骤：提高宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的表达量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶和同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的表达量和/或活性，从而获得无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌；
所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。
上述方法中，所述无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可在无机盐基础培养基以葡萄糖或甘油为唯一碳源有氧生长。
上述方法中，所述四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、所述O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和所述同型丝氨酸：O-乙酰转移酶均来源于Bacillus subtilis subsp.subtilis 168。
上述方法中，所述“提高宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的表达量和/或活性”是通过向所述宿主菌中导入四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶的编码基因、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶的编码基因和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的编码基因来实现的。
上述方法中，所述“降低所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶和同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的表达量和/或活性”是通过敲除所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶的编码基因和同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的编码基因来实现的。
上述任一所述四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶的编码基因dapH的Gene ID为939193。上述任一所述四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶的Genbank protein ID为NP_389301.2。
上述任一所述N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶的编码基因dapL的GeneID为938805。上述任一所述N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶的Genbank protein ID为NP_389302.1。
上述任一所述N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶的编码基因patA的GeneID为939235。上述任一所述N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶的Genbank protein ID为NP_389283.2。
上述任一所述O-乙酰同型丝氨酸硫解酶的编码基因yjcI的GeneID为939812。上述任一所述O-乙酰同型丝氨酸硫解酶的Genbank protein ID为NP_389069.1。
上述任一所述同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的编码基因metA的GeneID为939083。上述任一所述同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的Genbank protein ID为NP_390074.2。
上述任一所述四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶的编码基因dapD的Gene ID为944862。上述任一所述四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶的Genbank protein ID为NP_414708.1。
上述任一所述同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的编码基因metA的Gene ID为948513。上述任一所述同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的Genbank protein ID为NP_418437.1。
上述方法中，所述突变型大肠杆菌的制备方法可为：“降低大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰转移酶中至少一个的表达量和/或活性”和/或“向大肠杆菌中导入T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件”，得到的突变型大肠杆菌。
所述T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件是以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA(NCBI Reference Sequence：NC_012892.2)为模板，采用引物P22：5’-cgtttgctctggcagctatc-3’和引物P23：5’-gaagctagccctcaggcatttgagcgttacgcgaacgcgaagtc-3’组成的引物对进行PCR扩增，获得的DNA片段。
上述方法中，所述“降低大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰转移酶中至少一个的表达量和/或活性”是通过敲除所述大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶的编码基因、琥珀酰辅酶A合成酶的编码基因、异柠檬酸裂解酶的编码基因、丙酮酸氧化酶的编码基因和磷酸乙酰转移酶的编码基因中至少一个来实现的。
上述任一所述α-酮戊二酸脱氢酶可为α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ和/或α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ。
上述任一所述琥珀酰辅酶A合成酶可为琥珀酰辅酶A合成酶亚基α和/或琥珀酰辅酶A合成酶亚基β。
上述任一所述α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ的编码基因sucA的Gene ID为945303。上述任一所述α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ的Genbank protein ID为NP_415254.1。
上述任一所述α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ的编码基因sucB的Gene ID为945307。上述任一所述α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ的Genbank protein ID为NP_415255.1。
上述任一所述琥珀酰辅酶A合成酶亚基α的编码基因sucD的Gene ID为945314。上述任一所述琥珀酰辅酶A合成酶亚基α的Genbank protein ID为NP_415257.1。
上述任一所述琥珀酰辅酶A合成酶亚基β的编码基因sucC的Gene ID为945312。上述任一所述琥珀酰辅酶A合成酶亚基β的Genbank protein ID为NP_415256.1。
上述任一所述异柠檬酸裂解酶的编码基因aceA的Gene ID为948517。上述任一所述异柠檬酸裂解酶的Genbank protein ID为NP_418439.1。
上述任一所述丙酮酸氧化酶的编码基因的poxB的Gene ID为946132。上述任一所述丙酮酸氧化酶的Genbank protein ID为NP_415392.1。
上述任一所述磷酸乙酰转移酶的编码基因的pta的Gene ID为946778。上述任一所述磷酸乙酰基转移酶的Genbank protein ID为NP_416800.1。
上述任一所述无机盐基础培养基具体可为M9无机盐基础培养基。M9无机盐基础培养基可为：将17.1gNa2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、0.5g NaCl和1g NH4Cl溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30min，自然冷却；使用前，加入无菌CaCl2溶液、无菌MgSO4·7H2O和1mL微量元素溶液，得到M9无机盐基础培养基。M9无机盐基础培养基中，CaCl2的浓度为0.1mM，MgSO4的浓度为2mM。上述任一所述大肠杆菌具体可为BW25113菌株。
具体的，所述突变型大肠杆菌可为HS01、HS02、HS03、HS04、HS06或HS07。
向BW25113菌株中导入敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ的编码基因sucA的片段和敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因aceA的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS01。
向BW25113菌株中导入整体敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)、α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ编码基因(sucB)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基α编码基因(sucD)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基β编码基因(sucC)的片段和敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS02。
向BW25113菌株中导入整体敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)、α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ编码基因(sucB)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基α编码基因(sucD)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基β编码基因(sucC)的片段、敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)、敲除丙酮酸氧化酶编码基因(poxB)和敲除磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS03。
向BW25113菌株中导入整合T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS04。
向BW25113菌株中导入整体敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)、α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ编码基因(sucB)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基α编码基因(sucD)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基β编码基因(sucC)的片段、敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)和整合T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS06。
向BW25113菌株中导入整体敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)、α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ编码基因(sucB)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基α编码基因(sucD)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基β编码基因(sucC)的片段、敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)、敲除丙酮酸氧化酶编码基因(poxB)、敲除磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)的片段和整合T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件的片段，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS07。
具体的，无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可为CS02(宿主菌为HS01)、CS03(宿主菌为HS02)、CS04(宿主菌为HS03)、CS06(宿主菌为HS06)或CS07(宿主菌为HS07)。
由上述任一所述的方法制备得到的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌也属于本发明的保护范围。
所述产谷氨酸的工程菌可用于制备产谷氨酸的全细胞催化剂。
所述合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌可用于制备合成脱乙酰氧基头孢菌素的全细胞催化剂。
所述合成乙酰谷氨酸的工程菌可用于制备合成乙酰谷氨酸的全细胞催化剂。
本发明还保护上述任一所述的方法制备得到的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的应用，为a1)-a4)中的至少一种：
a1)合成以α-酮戊二酸为前体的目的产物；
a2)用于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成目的产物；
a3)合成以乙酰辅酶A为前体的目的产物；
a4)合成丙酮酸或以丙酮酸为前体的目的产物。
上述应用中，所述以α-酮戊二酸为前体的目的产物可为谷氨酸。
上述应用中，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成的目的产物可为脱乙酰氧基头孢菌素。
上述应用中，所述以乙酰辅酶A为前体的目的产物可为乙酰谷氨酸。
本发明还保护(B)或(C)或(D)或(E)。
本发明保护(B)一种合成谷氨酸的方法，可包括如下步骤：
(b1)提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达量和/或活性，得到产谷氨酸的工程菌；
(b2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养产谷氨酸的工程菌，收集发酵产物，从中获得谷氨酸。
上述方法中，所述“提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入谷氨酸脱氢酶的编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因来实现的。
上述方法中，所述“提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入含有谷氨酸脱氢酶的编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因的质粒来实现的。
上述任一所述谷氨酸脱氢酶的编码基因gdhA的Gene ID为946802。谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_416275.1。
上述任一所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因ppc的Gene ID为948457。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_418391.1。
上述任一所述含有谷氨酸脱氢酶的编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因的质粒具体可为实施例提及的重组质粒pSC5s-gdhA-ppc。
上述任一所述产谷氨酸的工程菌具体可为实施例提及的ES03(宿主菌为CS06)、ES01(宿主菌为HS04)或ES02(宿主菌为CS05)。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养的培养基具体可为含15-25mM(如15-20mM、20-25mM、15mM、20mM或25mM)葡萄糖和链霉素的M9无机盐基础培养基。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养的条件为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养。
上述任一所述的方法中，所述收集发酵产物可为收集发酵上清。
本发明保护(C)一种合成脱乙酰氧基头孢菌素的方法，可包括如下步骤：
(c1)提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的表达量和/或活性且降低所述大肠杆菌底盘菌中β-内酰胺酶的表达量和/或活性，获得合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌；
(c2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌，收集发酵产物，从中获得脱乙酰氧基头孢菌素。
上述方法中，所述“提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因来实现的。
上述方法中，所述“提高上述任一所述大肠杆菌底盘菌中脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入含有脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因的质粒来实现的。
上述任一所述的方法中，所述脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因可为以质粒pDB1s-DAOCS(记载于中国发明专利文献，公开号为CN104805047A)为模板，采用引物P31：5’-taagaaggagatataccatggacacgacggtgc-3’和引物P32：5’-tcagtggtggtggtggtggtgcttactatgccttggatgtgc-3’进行PCR扩增，得到约960bp的DNA片段所示。
上述任一所述的方法中，所述含有脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因的质粒具体可为实施例提及的重组质粒pET-28(+)b-DAOCS。
上述方法中，所述“降低所述大肠杆菌底盘菌中β-内酰胺酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入敲除β-内酰胺酶编码基因的片段实现的。
所述β-内酰胺酶的编码基因ampC的Gene ID为948669。β-内酰胺酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_418574.1。
上述任一所述合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌具体可为实施例提及的ES04(宿主菌为HS04)、ES05(宿主菌为CS05)、ES06(宿主菌为CS06)或ES07(宿主菌为CS07)。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养过程为：将上述任一所述合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌接种至发酵培养基，28-32℃(如28-30℃、30-32℃、28℃、30℃或32℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养，得到OD600nm值为0.5-0.7的菌液；加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.4-0.6mM(如0.4-0.5mM、0.5-0.6mM、0.4mM、0.5mM或0.6mM)，28-32℃(如28-30℃、30-32℃、28℃、30℃或32℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养4-10h(如4-6h、6-9h、9-10h、4h、6h、9h或10h)。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养基具体可为含15-25mM(如15-20mM、20-25mM、15mM、20mM或25mM)葡萄糖和卡那霉素的M9无机盐基础培养基。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养基具体可为70-90mM(如70-80mM、80-90mM、70mM、80mM或90mM)甘油和卡那霉素的M9无机盐基础培养基。
上述任一所述的方法中，所述收集发酵产物可为收集发酵菌体。
本发明保护(D)一种合成乙酰谷氨酸的方法，可包括如下步骤：
(d1)降低上述任一所述大肠杆菌底盘菌中乙酰谷氨酸激酶的表达量和/或活性且导入质粒pNAG06(记载于中国发明专利，公开号为CN 110734887A)，获得合成乙酰谷氨酸的工程菌；
(d2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养合成乙酰谷氨酸的工程菌,收集发酵产物，从中获得乙酰谷氨酸。
上述方法中，所述“降低上述任一所述大肠杆菌底盘菌中乙酰谷氨酸激酶的表达量和/或活性”是通过向上述任一所述大肠杆菌底盘菌中导入敲除乙酰谷氨酸激酶编码基因的片段实现的。
所述乙酰谷氨酸激酶的编码基因argB的Gene ID为948464。乙酰谷氨酸激酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_418394.3。
上述任一所述合成乙酰谷氨酸的工程菌具体可为实施例提及的ES08(宿主菌为HS04)、ES09(宿主菌为CS05)或ES10(宿主菌为CS07)。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养过程为：将上述任一所述合成乙酰谷氨酸的工程菌接种至全细胞发酵培养基，28-32℃(如28-30℃、30-32℃、28℃、30℃或32℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养，得到OD600nm值为0.5-0.7的菌液；加入L-阿拉伯糖并使其在体系中的浓度为0.1-0.3g/L(如0.1-0.2g/L、0.2-0.3g/L、0.1g/L、0.2g/L或0.3g/L)，28-32℃(如28-30℃、30-32℃、28℃、30℃或32℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养。
上述任一所述的方法中，所述全细胞发酵培养基具体可为70-90mM(如70-80mM、80-90mM、70mM、80mM或90mM)甘油、4-6mM(如4-5mM、5-6mM、4mM、5mM或6mM)精氨酸和链霉素的M9无机盐基础培养基。
上述任一所述的方法中，所述收集发酵产物可为收集发酵上清。
本发明保护(E)一种合成丙酮酸的方法，可包括如下步骤：以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养上述任一所述大肠杆菌底盘菌，收集发酵产物，从中获得丙酮酸。
上述方法中，所述发酵培养过程为：将上述任一所述大肠杆菌底盘菌至发酵培养基，35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养；收集沉淀并用全细胞催化反应液重悬；取重悬液，35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、200-240rpm(如200-220rpm、220-240rpm、200rpm、220rpm或240rpm)培养。
上述任一所述大肠杆菌底盘菌具体可为实施例提及的HS04、CS05或CS07。
上述任一所述的方法中，所述收集发酵产物可为收集发酵上清。
上述任一所述产谷氨酸的工程菌、上述任一所述合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌和/或上述任一所述合成乙酰谷氨酸的工程菌也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明提供的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，使菌株在三羧酸循环中断或无三羧酸循环(同时敲除α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA))的情况下，在无机盐基础培养基中能以葡萄糖或甘油为唯一碳源的有氧生长。无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在α-酮戊二酸依赖性酶催化反应中提高酶催化效率，促进目的产物合成，同时该菌可以在无机盐培养基中生长。无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，可以减少碳丢失率，因此可以提高以中心代谢中间产物(如乙酰辅酶A、丙酮酸、α-酮戊二酸)为前体的目的产物的合成。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为菌群生长曲线。
图2为载体pSC5s的图谱。
图3为不同工程菌产谷氨酸的情况。
图4为葡萄糖为碳源培养不同工程菌制备全细胞催化剂合成G-7-ADCA的情况。
图5为甘油为碳源培养不同工程菌制备全细胞催化剂合成G-7-ADCA的情况。
图6为不同工程菌转化谷氨酸合成乙酰谷氨酸(NAG)的情况。
图7为不同工程菌代谢葡萄糖积累丙酮酸的情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌K12株系BW25113菌株记载于如下文献中：Baba T，AraT，Hasegawa M，Takai Y，Okumura Y，Baba M，Datsenko KA，Tomita M，Wanner BL，Mori H:Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol 2006，2:2006.0008.大肠杆菌K12株系BW25113菌株(以下简称BW25113菌株)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。BW25113菌株的全基因组序列的GenBank Accession为CP009273.1(GI：545778205)。
M9无机盐基础培养基：将17.1gNa2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、0.5g NaCl和1g NH4Cl溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30min，自然冷却；使用前，加入无菌CaCl2溶液、无菌MgSO4·7H2O和1mL微量元素溶液，得到M9无机盐基础培养基。M9无机盐基础培养基中，CaCl2的浓度为0.1mM，MgSO4的浓度为2mM。
微量元素溶液：制备含50mmol/L的FeCl3·6H2O、20mmol/L的CaCl2·2H2O、10mmol/L的MnCl2·4H2O、10mmol/L的ZnSO4·7H2O、2mmol/L的CoCl2·6H2O、2mmol/L的CuCl2·2H2O、2mmol/L的NiCl2·6H2O、2mmol/L的Na2MoO4·2H2O和2mmol/L的Na2SeO3的H3BO3溶液，然后用0.22μm孔径的无菌滤膜除菌。
下述实施例中的无机盐基础培养基具体可为M9无机盐基础培养基。
下述实施例中涉及的引物名称及其核苷酸序列见表1。
表1
实施例1、构建可以在无机盐基础培养基中生长的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌
一、构建无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌
1、PCR扩增获取可消除的抗性基因选择标记元件lox71-kanR-lox66
以质粒pKD13(GenBank:AY048744.1)为模板，采用引物P1和引物P2组成的引物对进行PCR扩增，得到携带卡那霉素抗性基因的选择标记元件lox71-kanR-lox66。其中，lox71序列由引物P1引入，lox66序列由引物P2引入，PCR片段大小约1300bp，与目的片段相符。
2、体外组装打靶片段dapH-dapL-patA-lox71-kanR-lox66
(1)以Bacillus subtilis subsp.subtilis 168的染色体基因组DNA为模板，采用引物P3和引物P4组成的引物对进行PCR扩增，得到四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶编码基因dapH(Gene ID:939193)和N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶编码基因dapL(GeneID:938805)构成的多顺反子dapH-dapL表达元件(含核糖体结合位点)。片段大小约2000bp，与目的片段相符。
(2)以Bacillus subtilis subsp.subtilis 168的染色体基因组DNA为模板，采用引物P5和引物P6组成的引物对进行PCR扩增，得到N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶编码基因patA的表达元件(含核糖体结合位点)(GeneID:939235)。片段大小约1200bp，与目的片段相符。
(3)将多顺反子dapH-dapL的表达元件、基因patA的表达元件、选择标记元件lox71-kanR-lox66混合进行Gibson组装(Gibson,D.G.et al.Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods 6，343-345(2009))，以反应液为模板，采用引物P3和引物P7组成的引物对进行PCR扩增，获得打靶片段dapH-dapL-patA-lox71-kanR-lox66(靶向宿主菌的四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶编码基因dapD)。片段大小约4500bp，与目的片段相符。
3、体外组装打靶片段yjcI-metA-lox71-kanR-lox66
(1)以Bacillus subtilis subsp.subtilis 168的染色体基因组DNA为模板，采用引物P8和引物P9组成的引物对进行PCR扩增，得到O-乙酰同型丝氨酸硫解酶编码基因yjcI的表达元件(GeneID:939812)。片段大小约1200bp，与目的片段相符。
(2)以Bacillus subtilis subsp.subtilis 168的染色体基因组DNA为模板，采用引物P10和引物P11组成的引物对进行PCR扩增，得到同型丝氨酸：O-乙酰转移酶编码基因metA的表达元件(GeneID:939083)。片段大小约1000bp，与目的片段相符。
(3)将基因yjcI的表达元件、基因metA的表达元件、选择标记元件lox71-kanR-lox66混合进行Gibson组装，以反应液为模板，采用引物P8和引物P12组成的引物对进行PCR扩增，获得打靶片段yjcI-metA-lox71-kanR-lox66(靶向宿主菌的同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶编码基因metA)。片段大小约3200bp，与目的片段相符。
4、多顺反子dapH-dapL-patA替换宿主菌的四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶编码基因
采用Cre/LoxP的方法(Fukiya，S.；Mizoguchi，H.；Mori，H.；An improved methodfor deleting large regions of Escherichia coli K-12chromosome using acombination of Cre/loxP and lambda Red.FEMS Microbiol Lett 2004，234(2)，325-31.)电转化打靶片段dapH-dapL-patA-lox71-kanR-lox66替换宿主菌的四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶编码基因dapD(Gene ID:944862)，然后消除卡那霉素抗性基因的选择标记。
5、多顺反子yjcI-metA替换宿主菌的同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶编码基因
采用Cre/LoxP的方法电转化打靶片段yjcI-metA-lox71-kanR-lox66替换宿主菌的同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶编码基因metA(Gene ID:948513)，然后消除卡那霉素抗性基因的选择标记。
6、构建突变型大肠杆菌BW25113菌株
a1、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P13和引物P14组成的引物对进行PCR扩增，得到敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)(Gene ID:945303)的打靶片段。
a2、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P13和引物P15组成的引物对进行PCR扩增，得到一次性整体敲除α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因(sucA)(Gene ID:945303)、α-酮戊二酸脱氢酶Ⅱ编码基因(sucB)(Gene ID:945307)、琥珀酰辅酶A合成酶亚基α编码基因(sucD)(Gene ID:945314)和琥珀酰辅酶A合成酶亚基β编码基因(sucC)(GeneID:945312)的打靶片段。PCR片段大小约1400bp，与目的片段相符。
a3、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P16和引物P17组成的引物对进行PCR扩增，得到敲除异柠檬酸裂解酶编码基因(aceA)(Gene ID:948517)的打靶片段。
a4、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P18和引物P19组成的引物对进行PCR扩增，得到敲除丙酮酸氧化酶编码基因(poxB)(Gene ID:946132)的打靶片段。
a5、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P20和引物P21组成的引物对进行PCR扩增，得到敲除磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)(Gene ID:946778)的打靶片段。
a6、以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA(NCBI Reference Sequence:NC_012892.2)为模板，采用引物P22和引物P23组成的引物对进行PCR扩增，获得T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件DE3'；再与选择标记元件lox71-kanR-lox66混合进行Gibson组装，以反应液为模板，采用引物P22和引物P24组成的引物对进行PCR扩增，获得整合T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件DE3'的打靶片段DE3'-lox71-kanR-lox66，片段大小约6800bp，与目的片段相符。
采用Cre/LoxP的方法(Fukiya，S.；Mizoguchi，H.；Mori，H.；An improved methodfor deleting large regions of Escherichia coli K-12chromosome using acombination of Cre/loxP and lambda Red.FEMS Microbiol Lett 2004，234(2)，325-31.)向BW25113菌株电转化上述打靶片段，消除卡那霉素抗性基因的选择标记，得到突变型大肠杆菌BW25113菌株。
导入a1和a3，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS01。
导入a2和a3，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS02。
导入a2、a3、a4、a5，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS03。
导入a6，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS04。
导入a2、a3和a6，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS06。
导入a2、a3、a4、a5和a6，获得的突变型大肠杆菌BW25113菌株命名为HS07。
按照步骤1-5改造宿主菌得到不同的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，具体为底盘菌CS02、CS03、CS04、CS06、CS07，其基因型如表2所示。宿主菌为BW25113菌株或按照步骤6得到的突变型大肠杆菌BW25113菌株。
表2.无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的基因型
底盘菌 底盘菌基因型 宿主菌
CS01 BW25113ΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA BW25113
CS02 BW25113ΔsucAΔaceAΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS01
CS03 BW25113ΔsucABCDΔaceAΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS02
CS04 BW25113ΔsucABCDΔaceAΔpoxBΔptaΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS03
CS05 BW25113(DE3')ΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS04
CS06 BW25113(DE3')ΔsucABCDΔaceAΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS06
CS07 BW25113(DE3')ΔsucABCDΔaceAΔpoxBΔptaΔdapD::dapH-dapL-patAΔmetA::yjcI-metA HS07
二、考察无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在无机盐基础培养基中的生长
LB液体培养基：含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母抽提物和10g/L NaCl的水溶液，115℃灭菌30min。
1、取装有4mL LB液体培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，分别接入表2所示的宿主菌BW25113、HS01和底盘菌CS01、CS02、CS03，37℃、220rpm培养12h，得到培养菌液。
2、完成步骤1后，取培养菌液，室温、8000g离心2min，收集菌体。
3、完成步骤2后，取菌体，用M9无机盐基础培养基洗涤2次，之后用M9无机盐基础培养基重悬，得到菌悬液。
4、完成步骤3后，将菌悬液接种至新鲜的M9无机盐基础培养基，添加葡萄糖母液(115℃灭菌30min)至葡萄糖终浓度为20mM，得到OD600nm值约为0.01的初始菌液。
5、取96孔板，每孔加入150μL初始菌液，37℃、90％湿度、800rpm高频振荡条件培养。培养期间，每隔1h检测菌液的OD600nm值。使用干重密度(gDCW/L)对生物量进行评估，换算系数为1.0OD600nm值＝0.32gDCW/L。
以培养时间为横坐标，干重密度为纵坐标，绘制菌群生长曲线。
宿主菌BW25113、HS01和底盘菌CS01、CS02、CS03生长曲线见图1。结果表明，同时缺失α-酮戊二酸脱氢酶Ⅰ编码基因sucA和异柠檬酸裂解酶编码基因aceA的大肠杆菌突变体BW25113ΔsucAΔaceA(即宿主菌HS01)不可以在M9无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源有氧生长；同时缺失基因sucA和aceA的底盘菌CS02、CS03可以在M9无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源有氧生长，它们的生长曲线接近BW25113菌株和底盘菌CS01，即通过导入源于枯草芽孢杆菌的四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶编码基因、同型丝氨酸：O-乙酰转移酶编码基因、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶编码基因，可以构建无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌。
实施例2、无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在合成以α-酮戊二酸为前体的目的产物中的应用(以谷氨酸为例)
α-酮戊二酸是谷氨酰胺、谷氨酸等多种重要的氨基酸的前体。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，发生还原氨基化反应，生成谷氨酸。无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可以广泛适用于以α-酮戊二酸为前体的目的产物合成。下面以谷氨酸合成为例，说明无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在以α-酮戊二酸为前体的目的产物合成中的应用。
一、构建产谷氨酸的工程菌
1、以BW25113菌株的基因组DNA为模板，采用引物P25和引物P26进行PCR扩增，得到谷氨酸脱氢酶编码基因(gdhA)(Gene ID：946802)表达元件(含核糖体结合位点)。片段大小约为1400bp，与目的片段相符。
2、以BW25113菌株的基因组DNA为模板，采用引物P27和引物P28进行PCR扩增，得到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(ppc)(Gene ID：948457)表达元件(含核糖体结合位点)。片段大小约为2700bp，与目的片段相符。
3、以载体pSC5s为模板，采用引物P29和引物P30进行PCR扩增，得到线性化的载体pSC5s。片段大小约为3700bp，与目的片段相符。
载体pSC5s的图谱见图2，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4、将gdhA表达元件、ppc表达元件和线性化的载体pSC5s进行Gibson组装，转化大肠杆菌感受态细胞后，提取阳性克隆质粒，进行测序验证。结果表明，gdhA表达元件和ppc表达元件均正确插入到载体pSC5s。重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为重组质粒pSC5s-gdhA-ppc。
5、将重组质粒pSC5s-gdhA-ppc转化至实施例1构建的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌(表2)，得到产谷氨酸的工程菌，其基因型如表3所示。
表3.产谷氨酸工程菌的基因型
工程菌 底盘菌 携带质粒
ES01 HS04 pSC5s-gdhA-ppc
ES02 CS05 pSC5s-gdhA-ppc
ES03 CS06 pSC5s-gdhA-ppc
二、利用产谷氨酸的工程菌摇瓶发酵合成谷氨酸
HPLC采用Agilent 1260高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：Agilent C18 column(4.6×150mm，5μm)；流动相：10％乙腈，90％50mM乙酸钠；流速：1mL/min，柱温25℃；进样量10μL，检测波长360nm。
1、取装有4mL含20mM葡萄糖和50μg/ml链霉素的M9无机盐基础培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，加入构建的产谷氨酸的工程菌(表3中的ES01、ES02或ES03)的单菌落，37℃、220rpm培养36h，得到菌液1。每个单菌落做3组平行实验，取平均值。
2、将菌液1接种至装有100mL含20mM葡萄糖和50μg/ml链霉素的M9无机盐基础培养基的250mL三角瓶，得到初始OD600nm值约为0.02的菌液2；然后37℃、220rpm培养36h。培养期间，分别于6h、12h、14h和20h收集菌液。
检测菌液中的谷氨酸含量。检测步骤如下：
(1)取菌液，12000rpm离心5min，收集上清；之后用去离子水稀释2倍，得到稀释液。
(2)取100uL稀释液，加100uL的0.5M碳酸氢钠和50uL的DNFB(2，4-二硝基苯酚)溶液(1g DNFB溶于100mL乙腈)，混匀后于60℃反应1h，之后加入750uL 0.01M磷酸二氢钾溶液，混匀，用0.22μm的滤膜过滤，得到滤液。
(4)HPLC检测滤液，得到相应的峰面积；之后根据谷氨酸标准曲线，得到滤液中谷氨酸的产量。
检测结果见图3。结果表明，基于无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌CS06菌株构建的工程菌ES03，其谷氨酸产量显著高于工程菌ES01和ES02，即实施例1所构建的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌有利于合成谷氨酸。实施例1构建的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌也可用于其他以α-酮戊二酸为前体的目的产物合成。
实施例3、无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化的合成反应中的应用(以合成脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为例)
α-酮戊二酸是羟化酶、扩环酶等一系列α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的共底物，无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可以广泛适用于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化的合成反应。下面以G-7-ADCA合成为例，说明无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化的合成反应中的应用。
一、工程菌株的构建
1、以质粒pDB1s-DAOCS(记载于中国发明专利文献，公开号为CN104805047A)为模板，采用引物P31和引物P32进行PCR扩增，得到脱乙酰氧基头孢菌素合成酶scDAOCS的编码基因。片段大小约为960bp，与目的片段相符。
2、用限制性内切酶NcoI和XhoI酶切载体pET-28(+)b，回收约5200bp的载体骨架。
3、将步骤1得到的DNA片段和步骤2回收的载体骨架混合，进行Gibson组装，转化大肠杆菌感受态细胞后，提取阳性克隆质粒，进行测序验证。
结果表明，scDAOCS的编码基因正确插入到载体pET-28(+)b的NcoI和XhoI的酶切位点。重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为重组质粒pET-28(+)b-DAOCS。
4、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P33和引物P34进行PCR扩增，得到敲除β-内酰胺酶编码基因ampC(Gene ID：948669)的打靶片段。
β-内酰胺酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_418574.1。
5、采用Cre/LoxP的方法(Fukiya，S.；Mizoguchi，H.；Mori，H.；An improvedmethod for deleting large regions of Escherichia coli K-12chromosome using acombination of Cre/loxP and lambda Red.FEMS Microbiol Lett 2004，234(2)，325-31.)向表2所示HS04、CS05、CS06或CS07菌株电转化敲除β-内酰胺酶编码基因ampC的打靶片段，消除卡那霉素抗性基因的选择标记，得到表4所示的缺失基因ampC的宿主菌。
6、将重组质粒pET-28(+)b-DAOCS转化至步骤5得到的宿主菌，得到合成脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)的工程菌，其基因型如表4所示。
表4.合成脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)的工程菌的基因型
工程菌 宿主菌 携带质粒
ES04 HS04ΔampC pET-28(+)b-DAOCS
ES05 CS05ΔampC pET-28(+)b-DAOCS
ES06 CS06ΔampC pET-28(+)b-DAOCS
ES07 CS07ΔampC pET-28(+)b-DAOCS
二、全细胞催化合成脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)
1、取装有4mL含20mM葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的M9无机盐基础培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，加入工程菌ES04、ES05或ES06的单菌落，37℃、220rpm培养24h，得到菌液1。每个单菌落做3组平行实验，取平均值。
2、取菌液1，按照1％(v/v)接种至装有100mL含20mM葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的M9无机盐基础培养基的三角瓶(规格为250mL)，30℃、220rpm培养，得到OD600nm值为0.5-0.7的菌液2。
3、取菌液2，加入IPTG，得到培养体系1；培养体系1中，IPTG的浓度为0.5mM。
4、取培养体系1，30℃、220rpm诱导培养6h，得到菌液3。
5、取装有4mL含80mM甘油和50μg/ml卡那霉素的M9无机盐基础培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，加入工程菌ES04、ES05、ES06或ES07的单菌落，37℃、220rpm培养24h，得到菌液4。每个单菌落做3组平行实验，取平均值。
6、取菌液4，按照1％(v/v)接种至装有100mL含80mM甘油和50μg/ml卡那霉素的M9无机盐基础培养基的三角瓶(规格为250mL)，30℃、220rpm培养，得到OD600nm值为0.5-0.7的菌液5。
7、取菌液5，加入IPTG，得到培养体系2；培养体系2中，IPTG的浓度为0.5mM。
8、取培养体系2，30℃、220rpm诱导培养9h，得到菌液6。
9、按照文献(中国发明专利文献，公开号为CN104805047A)的方法，收集菌液3或菌液6的菌体，以50mM青霉素G和25mM葡萄糖全细胞催化合成G-7-ADCA，并检测G-7-ADCA产量。
菌液3收集的菌体的检测结果见图4。
菌液6收集的菌体的检测结果见图5。
结果表明，基于无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌构建的工程菌株ES06和ES07，其全细胞催化合成G-7-ADCA的水平明显高于有三羧酸循环的工程菌株ES04和ES05；即构建的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌适用于合成G-7-ADCA。
对于文献(中国发明专利文献，公开号为CN104805047A)中的菌株，如果采用富营养培养基，则发酵成本较高；如果采用无机盐基础培养基，则菌株不能生长或生长极其缓慢。而实施例1构建的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可以在无机盐基础培养基条件下生长，且具有促进产物(如G-7-ADCA)合成的效果。
实施例4、无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在乙酰辅酶A为前体的产物合成中的应用
无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，减少C丢失，有利于保障乙酰辅酶A的供给，用于以乙酰辅酶A为前体的产物合成。下面以乙酰谷氨酸的合成为例，证明无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在乙酰辅酶A为前体的产物合成中的应用潜力。
一、工程菌株的构建
1、以选择标记元件lox71-kanR-lox66为模板，采用引物P35和引物P36进行PCR扩增，得到敲除乙酰谷氨酸激酶编码基因argB(Gene ID：948464)的打靶片段。
乙酰谷氨酸激酶的氨基酸序列的Genebank号为NP_418394.3。
2、采用Cre/LoxP的方法(Fukiya，S.；Mizoguchi，H.；Mori，H.；An improvedmethod for deleting large regions of Escherichia coli K-12chromosome using acombination of Cre/loxP and lambda Red.FEMS Microbiol Lett 2004，234(2)，325-31.)向表2所述HS04、CS05或CS07菌株电转化敲除乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的打靶片段，消除卡那霉素抗性基因的选择标记，得到表5所示宿主菌。
3、将质粒pNAG06(记载于中国发明专利，公开号为CN 110734887A)转化至步骤2得到的宿主菌，得到合成乙酰谷氨酸(NAG)的工程菌，其基因型如表5所示。
表5.合成乙酰谷氨酸(NAG)的工程菌的基因型
工程菌 宿主菌 携带质粒
ES08 HS04ΔargB pNAG06
ES09 CS05ΔargB pNAG06
ES10 CS07ΔargB pNAG06
二、全细胞催化合成脱乙酰谷氨酸(NAG)
1、取装有4mL含80mM甘油、5mM精氨酸和50μg/ml链霉素的M9无机盐基础培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，加入工程菌ES08、ES09或ES10的单菌落，37℃、220rpm培养24h，得到菌液1。每个单菌落做3组平行实验，取平均值。
2、取菌液1，按照1％(v/v)接种至装有100mL含80mM甘油、5mM精氨酸和50μg/ml链霉素的M9无机盐基础培养基的三角瓶(规格为250mL)，30℃、220rpm培养，得到OD600nm值为0.5-0.7的菌液2。
3、取菌液2，加入L-阿拉伯糖，得到培养体系；培养体系中，L-阿拉伯糖的浓度为0.2g/L。
4、取培养体系2，30℃、220rpm诱导培养2h，得到菌液3。
5、取菌液3，4℃、5000g离心，收集沉淀并用生理盐水重悬洗涤2次。
6、取完成步骤5的沉淀，用全细胞催化反应液重悬，得到OD600nm值为20的菌悬液。
全细胞催化反应液：含25mmol/L的葡萄糖和50mmol/L的谷氨酸钠的100mmol/L的MOPS缓冲液(pH7.2)。
7、取无菌试管(规格为2cm×20cm)，每支加入2mL菌悬液，在摇床中30℃、200rpm进行催化反应。反应第8h或第20h时，取样室温、12000g离心5min，收集上清液并用0.22μm孔径滤膜过滤，得到滤液。之后按照文献(中国发明专利，公开号为CN 110734887A)中高效液相色谱(HPLC)方法检测乙酰谷氨酸(NAG)的浓度。
各个工程菌合成NAG的结果见图6。
结果表明，基于无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌构建的工程菌株ES10，其全细胞催化合成NAG的水平明显高于有三羧酸循环的工程菌株ES08和ES09；即实施例1构建的无三羧酸循环大肠杆菌底盘菌，再进一步的弱化其乙酸代谢，适用于合成NAG等以乙酰辅酶A为前体的产品。
实施例5、无需三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌在丙酮酸为前体的产物合成中的应用
丙酮酸是重要的生物合成前体物。因此，无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，减少C丢失，有利于丙酮酸积累和以丙酮酸为前体的产品合成。
1、取装有4mL含25mM葡萄糖的M9无机盐基础培养基的无菌试管(规格为2cm×20cm)，加入HS04、CS05或CS07的单菌落，37℃、220rpm培养，得到菌液1。其中，HS04和CS05培养12h，CS07培养18h。每个单菌落做3组平行实验，取平均值。
2、取菌液1，4℃、5000g离心，收集沉淀并用生理盐水重悬洗涤2次。
3、取完成步骤2的沉淀，用全细胞催化反应液重悬，得到OD600nm值为20的菌悬液。
全细胞催化反应液：含0.5％(m/v)葡萄糖的M9无机盐基础培养基。
4、取无菌试管(规格为1cm×15cm)，每支加入1mL菌悬液，在摇床中37℃、220rpm催化反应6h，得到反应液。
5、采用高效液相色谱(HPLC)检测反应液中的葡萄糖和丙酮酸浓度。具体步骤如下：
HPLC方法：安捷伦1260液相工作站，检测波长为210nm，RID检测器参比池温度为40℃，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司)。
(1)取丙酮酸标准品，用无机盐基础培养基配制，去离子水稀释，最后用0.22μm孔径滤膜过滤，得到不同浓度的丙酮酸标准品溶液。将不同浓度的丙酮酸标准品溶液进行HPLC，获得相应的峰面积。以丙酮酸标准品溶液的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)取反应液，室温、12000g离心5min，收集上清液并用去离子水稀释，之后用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液。将滤液进行HPLC；根据标准曲线获得滤液中丙酮酸的浓度。
各个底盘菌积累丙酮酸的结果见图7。
结果表明，无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌CS07，其全细胞催化积累丙酮酸的水平明显优于HS04和CS05；即构建无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的方法，适用于构建工程菌，用于合成丙酮酸以及以丙酮酸为前体的产品。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3774
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc tgccctaggt ctatgagtgg ttgctggata 60
acttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaggg agaccacaac ggtttccctc 120
tacaaataat tttgtttaac tttcgcgcgc gtaacaggag gaattaacca tgggtacctc 180
tcatcatcat catcatcaca gcagcggcct ggtgccgcgc ggcagcctcg agggtagatc 240
tggtactagt ggtgaattcg gtgagctcgg tctgcagctg gtgccgcgcg gcagccacca 300
ccaccaccac cactaaggat cctaagcggc cgcaagtcct gcaggaagtg gcgcgccaag 360
tcgccggcga taatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg 420
cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc 480
cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca 540
aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcaa gcttgtttaa acatttaaat 600
cgatatcgca ggtgagtact gtcgaccaga cccgccataa aacgccctga gaagcccgtg 660
acgggctttt cttgtattat gggtagtttc cttgcatgaa tccataaaag gcgcctgtag 720
tgccatttac ccccattcac tgccagagcc gtgagcgcag cgaactgaat gtcacgaaaa 780
agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga gacaaaagga atattcagcg atttgcccga 840
gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg gttttaaggt ctgttttgta gaggagcaaa 900
cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg cggaactgac taaagtagtg agttatacac 960
agggctggga tctattcttt ttatcttttt ttattctttc tttattctat aaattataac 1020
cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa aggtctagcg gaatttacag agggtctagc 1080
agaatttaca agttttccag caaaggtcta gcagaattta cagataccca caactcaaag 1140
gaaaaggtct agtaattatc attgactagc ccatctcaat tggtatagtg attaaaatca 1200
cctagaccaa ttgagatgta tgtctgaatt agttgttttc aaagcaaatg aactagcgat 1260
tagtcgctat gacttaacgg agcatgaaac caagctaatt ttatgctgtg tggcactact 1320
caaccccacg attgaaaacc ctacaaggaa agaacggacg gtatcgttca cttataacca 1380
atacgctcag atgatgaaca tcagtaggga aaatgcttat ggtgtattag ctaaagcaac 1440
cagagagctg atgacgagaa ctgtggaaat caggaatcct ttggttaaag gctttgagat 1500
tttccagtgg acaaactatg ccaagttctc aagcgaaaaa ttagaattag tttttagtga 1560
agagatattg ccttatcttt tccagttaaa aaaattcata aaatataatc tggaacatgt 1620
taagtctttt gaaaacaaat actctatgag gatttatgag tggttattaa aagaactaac 1680
acaaaagaaa actcacaagg caaatataga gattagcctt gatgaattta agttcatgtt 1740
aatgcttgaa aataactacc atgagtttaa aaggcttaac caatgggttt tgaaaccaat 1800
aagtaaagat ttaaacactt acagcaatat gaaattggtg gttgataagc gaggccgccc 1860
gactgatacg ttgattttcc aagttgaact agatagacaa atggatctcg taaccgaact 1920
tgagaacaac cagataaaaa tgaatggtga caaaatacca acaaccatta catcagattc 1980
ctacctacgt aacggactaa gaaaaacact acacgatgct ttaactgcaa aaattcagct 2040
caccagtttt gaggcaaaat ttttgagtga catgcaaagt aagcatgatc tcaatggttc 2100
gttctcatgg ctcacgcaaa aacaacgaac cacactagag aacatactgg ctaaatacgg 2160
aaggatctga ggttcttatg gctcttgtat ctatcagtga agcatcaaga ctaacaaaca 2220
aaagtagaac aactgttcac cgttagatat caaagggaaa actgtcgata tgcacagatg 2280
aaaacggtgt aaaaaagata gatacatcag agcttttacg agtttttggt gcatttaaag 2340
ctgttcacca tgaacagatc gacaatgtaa cagatgaaca gcatgtaaca cctaatagaa 2400
caggtgaaac cagtaaaaca aagcaactag aacatgaaat tgaacacctg agacaacttg 2460
ttacagctca acagtcacac atagacagcc tgaaacaggc gatgctgctt atcgaatcaa 2520
agctgccgac aacacgggag ccagtgacgc ctcccgtggg gaaaaaatca tggcaattct 2580
ggaagaaata gcgctttcag ccggcaaacc tgaagccgga tctgcgattc tgataacaaa 2640
ctagcaacac cagaacagcc cgtttgcggg cagcaaaacc cgcggcccgc tagccctatt 2700
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 2760
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg 2820
actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc 2880
gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg 2940
ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt 3000
ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt 3060
gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga 3120
gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat 3180
ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg 3240
gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta 3300
acgctatgga actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg 3360
tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac 3420
tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct 3480
tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc 3540
cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aatgtctaac aattcgttca 3600
agccgagggg ccgcaagatc cggccacgat gacccggtcg tcggttcagg gcagggtcgt 3660
taaatagccg cttatgtcta ttgctggttt accggtttat tgactaccgg aagcagtgtg 3720
accgtgtgct tctcaaatgc ctgaggtttc agcctcagct taattaaggc atgc 3774

Claims (14)

1.制备无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的方法，包括如下步骤：向宿主菌中导入四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶的编码基因、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶的编码基因和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的编码基因且敲除所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶的编码基因和同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的编码基因，从而获得无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌；
所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌的制备方法为：降低大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰转移酶中至少一个的表达量和/或活性和/或向大肠杆菌中导入T7噬菌体RNA聚合酶编码基因的表达元件，得到的突变型大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述降低大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰转移酶中至少一个的表达量和/或活性是通过敲除所述大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶的编码基因、琥珀酰辅酶A合成酶的编码基因、异柠檬酸裂解酶的编码基因、丙酮酸氧化酶的编码基因和磷酸乙酰转移酶的编码基因中至少一个来实现的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为BW25113菌株。
5.由权利要求1至4中任一所述的方法制备得到的无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌。
6.权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌的应用，为a1)-a4)中的至少一种：
a1)合成以α-酮戊二酸为前体的目的产物；
a2)用于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成目的产物；
a3)合成以乙酰辅酶A为前体的目的产物；
a4)合成丙酮酸或以丙酮酸为前体的目的产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述以α-酮戊二酸为前体的目的产物为谷氨酸；
所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成的目的产物为脱乙酰氧基头孢菌素；
所述以乙酰辅酶A为前体的目的产物为乙酰谷氨酸。
8.一种合成谷氨酸的方法，包括如下步骤：
(b1)向权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中导入谷氨酸脱氢酶的编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因，得到产谷氨酸的工程菌；
(b2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养产谷氨酸的工程菌，收集发酵产物，从中获得谷氨酸。
9.一种合成脱乙酰氧基头孢菌素的方法，包括如下步骤：
(c1)向权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中导入脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因且敲除β-内酰胺酶的编码基因，获得合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌；
(c2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌，收集发酵产物，从中获得脱乙酰氧基头孢菌素。
10.一种合成乙酰谷氨酸的方法，包括如下步骤：
(d1)敲除权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中乙酰谷氨酸激酶的编码基因且导入质粒pNAG06，获得合成乙酰谷氨酸的工程菌；
(d2)以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养合成乙酰谷氨酸的工程菌，收集发酵产物，从中获得乙酰谷氨酸。
11.一种合成丙酮酸的方法，可包括如下步骤：以葡萄糖或甘油为碳源，发酵培养权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌，收集发酵产物，从中获得丙酮酸。
12.一种产谷氨酸的工程菌，其制备方法包括如下步骤：向权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中导入谷氨酸脱氢酶的编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因，从而获得产谷氨酸的工程菌。
13.一种合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌，其制备方法包括如下步骤：向权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中导入脱乙酰氧基头孢菌素合成酶的编码基因且敲除β-内酰胺酶的编码基因，从而获得合成脱乙酰氧基头孢菌素的工程菌。
14.一种合成乙酰谷氨酸的工程菌，其制备方法包括如下步骤：敲除权利要求5中所述大肠杆菌底盘菌中乙酰谷氨酸激酶的编码基因且导入质粒pNAG06，从而获得合成乙酰谷氨酸的工程菌。
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