CN117965484A - 高效合成乳酰-n-岩藻糖基五糖-ⅴ的工程大肠杆菌的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高效合成乳酰‑N‑岩藻糖基五糖‑Ⅴ的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。以高效生产乳酰‑N‑四糖(LNT)的大肠杆菌为起始菌株，引入具有底物特异性的α1,3/4‑岩藻糖基转移酶，实现LNFP V的高效合成。从九个候选酶中选择脆弱拟杆菌α1,3/4‑岩藻糖基转移酶作为体内合成LNFP V的最佳酶，其LNFP V产量最高，副产物积累最低。通过计算机辅助的定点突变，获得了一种有益的突变体K128D，进一步提高了LNFPV的产量，构建得到的重组大肠杆菌通过分批补料培养可以产生25.68g/L的LNFP V，为进一步工业化生产与合成其他复杂母乳低聚糖奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及高效合成乳酰-N-岩藻糖基五糖-Ⅴ的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。
背景技术
通过微生物高效合成母乳寡糖正在受到人们的广泛关注，因为母乳寡糖正在成为商业婴儿配方奶粉的新金标准。然而，目前大多数研究集中在短链母乳寡糖上，如三糖和四糖，而对于长链母乳寡糖的微生物合成研究不多。乳酰-N-岩藻糖基五糖-Ⅴ(LNFP V)是一种典型的母乳五糖。迄今为止，二百多种母乳寡糖的结构已经被确定。目前已经积累了各种纯化的母乳寡糖对于健康的作用研究，但对于LNFP V对健康的影响研究较少，其原因可能为难以获得足够的纯化的LNFP V，而LNFPV的生物合成为其提供了可能。
目前，乳酰-N-岩藻糖基五糖-Ⅴ的合成方法分为化学合成法、酶法合成法和细胞工厂法。化学合成因其过程复杂且有毒性，无法进一步大规模生产。酶法合成需要昂贵的核苷酸糖底物和辅因子的加入，限制了其工业化生产。LNFP V是在乳糖-N-新四糖(LNT)的末端葡萄糖上通过α1,3键连接一个岩藻糖。利用来自脆弱拟杆菌NCTC 9343和幽门螺旋杆菌DMS 6709两种微生物的α1,3/4岩藻糖基转移酶通过体内酶法合成LNFP V。然而，这两种岩藻糖基转移酶都具有α1,4岩藻糖基转移酶的活性，能够以LNFPV为底物进一步合成乳酰-N-二型六糖-Ⅱ(LNDFH II)，产生LNFP V和LNDFH II的混合物。微生物合成是大量生产母乳寡糖的最常用方法。
发明内容
本发明在之前能够高产LNT的底盘菌株的基础上，引入了能够产生GDP-岩藻糖的酶和能够使LNT生成LNFP V的岩藻糖基转移酶。本发明通过构建完整的LNFPV的生物合成途径实现了LNFP V的高效稳定合成。
本发明提供了一种α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体，所述突变体以Bacteroidesfragilis NCTC 9343的Bf13FT为野生型酶，对第55位酪氨酸、第57位半胱氨酸、第60位苏氨酸、第78位缬氨酸或第128位赖氨酸进行突变。
在一种实施方式中，所述突变体以Bacteroidesfragilis NCTC 9343的Bf13FT为野生型酶，将第55位酪氨酸突变为苯丙氨酸、第57位半胱氨酸突变为蛋氨酸、第60位苏氨酸突变为蛋氨酸或半胱氨酸、第78位缬氨酸突变为精氨酸、或第128位赖氨酸突变为天冬氨酸。
本发明提供了编码所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体的基因。
本发明提供了表达所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体或所述基因的重组载体。
本发明提供了携带所述基因或所述重组载体的宿主细胞。
本发明提供了一种制备LNFP V的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，以大肠杆菌为宿主，敲除基因组上的wecB，nagB，lacZ，ugD，整合表达基因galE和基因lgtA，游离表达wbgO、manB、manC、gmd、wcaG和编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgO，采用pRSFDuet-1质粒表达编码磷酸甘露糖酶的基因manB、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶的基因manC、编码鸟苷二磷酸-甘露糖-4,6-脱水酶的基因gmd和编码鸟苷二磷酸-岩藻糖合酶的基因wcaG，采用pETDuet-1质粒表达所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，在基因组上的recA位点整合基因galE，在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点，IS186-2位点，IS186-4位点和IS186-5位点整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖-2-差向异构酶wecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6-磷酸脱-氨酶nagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶lacZ的NCBI序列号为NP_414878.1，尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶ugD的NCBI序列号为WP_000704860.1。
在本发明的一种实施方式中，所述galE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因wbgO的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述recA位点的GenBank号为ACT44368.1。
在本发明的一种实施方式中，在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因组上染色体IS186基因座的1位点的NCBI登录号为Gene-ID:8180773，2位点的NCBI登录号为Gene-ID:8180306，4位点的NCBI登录号为Gene-ID:8180040，5位点的NCBI登录号为Gene-ID:8183431。
在本发明的一种实施方式中，所述编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶的基因选自来源于脆弱拟杆菌Bacteroidesfragilis NCTC 9343的基因Bf13FT及所述编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因Bf13FT的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明提供了一种制备LNFP V的方法，所述方法为以甘油为碳源，以乳糖为底物，以所述大肠杆菌基因工程菌为生产菌株生物合成LNFP V。
本发明还提供了所述大肠杆菌基因工程菌在制备LNFP V或含有LNFP V的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明在之前生产LNT的底盘菌株的基础上，引入了能够产生GDP-岩藻糖的酶和能够使LNT生成LNFP V的岩藻糖基转移酶。本发明通过构建完整的LNFPV的生物合成途径实现了LNFP V的高效稳定合成。Bf13FT体内合成LNFP V的能力最强，通过计算机辅助的定点突变获得一个有益的突变体K128D，提高了LNFP V的产量。在摇瓶发酵实验中，最佳的菌株EW10生产的LNFP V可达到2.44g/L，在5L生物反应器体系中，重组大肠杆菌在分批补料培养后，LNFPV产量可达到25.68g/L，具备良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为工程大肠杆菌生物合成LNFP V代谢通路图。
图2为不同菌株发酵生产LNFP V的产量比较图。
图3为不同整合菌株发酵生产LNFP V的产量比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明进一步阐述。
本发明所有使用的PCR扩增酶、质粒、DNA凝胶回收试剂盒和柱式质粒抽提盒等商业化产品，具体操作均按照试剂盒说明书进行。
大肠杆菌感受态制备：TAKARA试剂盒；核酸琼脂糖凝胶电泳、水浴热激转化、感受态细胞制备、菌落PCR和质粒抽提等常规分子生物学实验操作根据Molecular-Cloing：ALaboratory-Manua(Fourth-Edition)进行。构建质粒和PCR扩增产物的测序工作均由苏州安升达公司完成。
下述实施例中涉及到的生物材料：
菌株ENP05公开于文献中Li Z,Zhu Y,Huang Z,Zhang P,Zhang W,MuW.Engineering Escherichia coli for high-level production oflacto-N-fucopentaose I by stepwise de novo pathway construction.CarbohydrPolym.2023Sep 1；315:121028.
菌株ENP4L2公开于公开号为CN116536232A的中国申请文件中。
质粒pRSF-CBGW公开于公开号为CN114874964A的中国发明专利申请文件中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，15g/L琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨。
发酵培养基(Defined-medium，DM)：20g/L甘油，1.7g/L柠檬酸，13.5g/L磷酸二氢钾，1.4g/L七水硫酸镁，4.0g/L磷酸氢二氨和10ml/L微量金属元素，再用氢氧化钠调节pH至6.8；
微量金属元素：2.25g/L七水硫酸锌，10g/L硫酸亚铁，0.35g/L一水硫酸锰，1.0g/L无水硫酸铜，0.23g/L十水硼酸钠，2.0g/L二水氯化钙，0.11g/L钼酸铵，溶于5M盐酸。
抗生素浓度：50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素，200mg/L氨苄青霉素(固体培养基)，100mg/L氨苄青霉素(液体培养基)。
诱导剂浓度：在摇瓶发酵过程中，异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的添加终浓度为0.5mM。
下述实施例中所涉及的菌株培养及发酵如下：
摇瓶发酵：在发酵过程中，在相应的LB固体平板上，挑取菌落形态正常的单菌落至4mL试管LB培养液体中(含有对应的抗生素)，培养10-12h后，将试管中的种子液以2％(v/v)的接种量转接到20mL摇瓶DM培养基中，培养条件为37℃，200rpm。当菌体生长密度达到0.6-0.8时，添加终浓度为0.5mM的IPTG和5g/L的乳糖，发酵温度调整至25℃。发酵时长达到72h后，取发酵液并制备样品，进行产物的检测。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
LNFP V的产量检测：取发酵液1ml煮沸10min，以20000g的离心速度离心20分钟，再将上清液稀释一定倍数，后通过0.22μm水系针筒式过滤器，将样品用高效液相色谱仪(沃特世公司)进行检测，LNFP V、LNDFH II、和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)采用Zorbax氨基柱进行检测，流动相为60％乙腈，柱温为35℃，流速为1.0mL/min。其他化合物如LNT、乳酰-N-三糖II(LNTri II)、乳糖、甘油采用Rezex-ROA有机酸柱进行检测，流动相为5mM H2SO4，柱温为60℃，流速为0.6mL/min。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。
表1：引物序列及靶向质粒信息
下述实施例中所涉及的重叠延伸PCR体系如表2所示：
表2：重叠延伸PCR体系
重叠延伸PCR反应体系条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2kb/min；32个循环，4℃保存，取部分的PCR产物进行核酸电泳验证，后利用去甲基化酶Dpn I进行酶切去除模板质粒，再进行转化验证。
表3：不同菌株的构建
实施例1：不同酶筛选
在生产乳酰-N-四糖的底盘菌株ENP05的基础上，引入两个质粒pRSF-CBGW和不同的α1-,3/4-岩藻糖基转移酶，所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶选自来源于脆弱拟杆菌Bacteroidesfragilis NCTC 9343的Bf13FT(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)，来源于幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori DMS 6709的fucT14(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，来源于幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori26695的futB(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，来源于幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori NCTC 11639的HpfucT(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，来源于幽门螺旋杆菌HelicobacterpyloriJ99的fucU(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，来源于幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori 26695的futA(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，来源于幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori J99的fucT-J99(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，来源于拟杆菌Bacteroidesgallinaceum的futM2(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)或来源于幽门螺旋杆菌HelicobacterpyloriNCTC11637的FT1-H9D(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)。
将编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶的基因构建至质粒pETDuet-1的NdeI酶切位点，获得一系列质粒pET-Bf13FT、pET-FucT14、pET-FutB、pET-HpFucT、pET-FucU、pET-FutA、pET-FucT-J99、pET-FT1-H9D、pET-FutM2。并将上述质粒分别转化至含有质粒pRSF-CBGW的菌株ENP05中，得到9个不同的菌株分别为EW01、EW02、EW03、EW04、EW05、EW06、EW07、EW08、EW09。
将EW01～EW09重组菌株分别接种于含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取400μL种子液接入20mL发酵培养基，37℃，200rpm，培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG和5g/L的乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，20,000rpm，煮沸10min，离心20min，取上清，用于HPLC测定。
结果如表4所示，不同α1-,3/4-岩藻糖基转移酶在体内合成LNFP V能力有显著差异，菌株EW01制备的LNFP V产量最高，为1.94g/L(图2)，EW03和EW04制备的LNFPV产量也可以达到1g/L，其他α1-,3/4-岩藻糖基转移酶LNFP V的产量均小于1g/L，说明这些酶将LNT转化为LNFP V的活性较低。fucT14、futA和futM2具有较高的α1-,4-岩藻糖基转移酶活性，可以进一步将LNFP V转化为LNDFH II，不适合用于LNFP V合成菌株的构建。相比之下，Bf13FT对于LNFP V合成能力最高，且几乎没有副产物的积累(图1)。
表4不同重组大肠杆菌摇瓶发酵详细信息
实施例2：Bf13FT突变体构建
为了提高乳酰-N-岩藻糖基五糖-Ⅴ的生产效率，通过多重筛选构建了一个包含14个潜在有益单点突变的文库，包括Y242Q、Y55F、G89C、G89F、G89R、V78R、S131N、S131D、K128D、T60C、T60M、C57M、T60D和Y242K，用于对Bf13FT进行分子修饰。
设计不同突变位点引物，如表1所示，以实施例1构建的pET-Bf13FT质粒为模板，进行重叠延伸PCR并经测序成功后得到14个突变质粒pET-Bf13FT-K128D、pET-Bf13FT-Y55F、pET-Bf13FT-T60C、pET-Bf13FT-T60M、pET-Bf13FT-V78R、pET-Bf13FT-C57M、pET-Bf13FT-Y242Q、pET-Bf13FT-T60D、pET-Bf13FT-S131D、pET-Bf13FT-Y242K、pET-Bf13FT-S131N、pET-Bf13FT-G89R、pET-Bf13FT-G89C和pET-Bf13FT-G89F。
实施例3：突变体菌株发酵生产乳酰-N-岩藻糖基五糖-Ⅴ
同样将pRSF-CBGW和14个不同突变体质粒包括pET-Bf13FT-K128D、pET-Bf13FT-Y55F、pET-Bf13FT-T60C、pET-Bf13FT-T60M、pET-Bf13FT-V78R、pET-Bf13FT-C57M、pET-Bf13FT-Y242Q、pET-Bf13FT-T60D、pET-Bf13FT-S131D、pET-Bf13FT-Y242K、pET-Bf13FT-S131N、pET-Bf13FT-G89R、pET-Bf13FT-G89C和pET-Bf13FT-G89F转入含有质粒pRSF-CBGW的ENP05菌株，得到14个不同重组菌株，依次为EW10、EW11、EW12、EW13、EW14、EW15、EW16、EW17、EW18、EW19、EW20、EW21、EW22和EW23。
将EW10～EW23重组菌株分别接种于含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取400μL种子液接入20mL发酵培养基，37℃，200rpm，培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG和5g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，20,000rpm，煮沸10min，离心20min，取上清，用于HPLC测定。
结果如表5所示，其中6个突变体提高了LNFPV的合成，包括K128D、Y55F、T60C、T60M、V78R、和C57M，其中K128D是最有利的突变体，LNFP V的产量为2.44g/L(图3)，几乎没有副产物的产生。
表5不同重组大肠杆菌摇瓶发酵详细信息
实施例4：发酵罐分批补料培养生产LNFPV
选取实施例3构建的菌株EW10进行5L发酵罐的LNFP V的分批补料发酵实验。
从平板上挑取重组大肠杆菌EW10的单菌落接种到含有氨苄青霉素、链霉素和卡那霉素的4mL LB培养基中过夜培养，作为一级种子液；将1.5mL一级种子液接种到150mL发酵培养基中在37℃，200rpm条件下扩大培养，培养至OD600约为2后转移至5L发酵罐培养。分批补料发酵在含有1.5L发酵罐培养基的5L发酵罐中进行。初始温度保持在37℃，当OD600达到约15时，降温至25℃，并加入终浓度0.1mM的IPTG和10g/L乳糖进行基因的诱导表达。后续通过流加分批补料发酵补料液(600g/L的甘氨酸和20g/L的MgSO47H2O和0.2g/L的维生素B)保证甘油维持在终浓度6-15g/L，通过流加乳糖保持终浓度不小于3g/L。pH全程保持在6.8±0.2，并通过添加消泡剂控制泡沫。通过调节搅拌速度(100～900rpm)和通气量(2～8vvm)控制溶氧为30％。在经过了45h的发酵后，LNFP V的产量达到25.68g/L，OD600最高达到了136.6。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体以Bacteroidesfragilis NCTC 9343的Bf13FT为野生型酶，对第55位酪氨酸、第57位半胱氨酸、第60位苏氨酸、第78位缬氨酸或第128位赖氨酸进行突变。
2.根据权利要求1所述的α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体以Bacteroides fragilis NCTC 9343的Bf13FT为野生型酶，将第55位酪氨酸突变为苯丙氨酸、第57位半胱氨酸突变为蛋氨酸、第60位苏氨酸突变为蛋氨酸或半胱氨酸、第78位缬氨酸突变为精氨酸、或第128位赖氨酸突变为天冬氨酸。
3.编码权利要求1或2所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体的基因。
4.表达权利要求1或2所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体或权利要求3所述基因的重组载体。
5.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体的宿主细胞。
6.一种制备LNFP V的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，以大肠杆菌为宿主，敲除基因组上的wecB，nagB，lacZ，ugD，整合表达基因galE和基因lgtA，游离表达wbgO、manB、manC、gmd、wcaG和编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶的基因。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶的基因选自来源于脆弱拟杆菌Bacteroidesfragilis NCTC 9343的基因Bf13FT及权利要求2所述编码α1-,3/4-岩藻糖基转移酶突变体的基因。
8.根据权利要求6所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，采用pCDFDuet-1质粒表达wbgO，采用pRSFDuet-1质粒表达manB、manC、gmd和wcaG，采用pETDuet-1质粒表达所述α1-,3/4-岩藻糖基转移酶；进一步的，在基因组上的recA位点整合基因galE，在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点，IS186-2位点，IS186-4位点和IS186-5位点整合基因lgtA。
9.一种制备LNFP V的方法，其特征在于，所述方法为以甘油为碳源，以乳糖为底物，以权利要求6～8任一所述大肠杆菌基因工程菌为生产菌株生物合成LNFPV。
10.权利要求6～8任一所述大肠杆菌基因工程菌在制备LNFP V或含有LNFPV的产品中的应用。
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