CN115725535B - 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 - Google Patents
一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115725535B CN115725535B CN202211517289.5A CN202211517289A CN115725535B CN 115725535 B CN115725535 B CN 115725535B CN 202211517289 A CN202211517289 A CN 202211517289A CN 115725535 B CN115725535 B CN 115725535B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- fluoro
- recombinant
- deoxyribotransferase
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种N‑脱氧核糖转移酶,重组菌株经诱导表达重组N‑脱氧核糖转移酶,并将发酵液直接加入反应物,通过生物催化法高效制备2'‑氟‑2'‑脱氧鸟苷。本发明所述的催化工艺简单易操作,底物转化率可达80%以上,产率高,成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶工程技术领域,具体涉及一种2'-氟-2'-脱氧鸟苷的生物催化制备方法。
背景技术
糖基上带有氟原子的核苷类化合物作为一种修饰性核苷,具有优越的生理和药理活性,在临床上被广泛用作抗癌和抗病毒药物。2'-氟-2'-脱氧鸟苷(2'-Fluoro-2'-Deoxyguanosine),是2'-脱氧鸟苷在糖基2'号位的氟化修饰产物,其化学结构式如式1所示。
2'-氟-2'-脱氧鸟苷作为一类新颖的核苷衍生物,可有效防止核酸酶的降解,在血清中的半衰期高达6个小时,因此具有良好的化学、酶稳定性,也是小核酸药物生产所需的基础物料之一。近几年,随着小核酸药物的迅速崛起,作为小核酸药物的重要结构性原料,2'-氟-2'-脱氧鸟苷的市场需求量也在急速增长。一般而言,由于氟原子的特性,氟代核苷化合物的合成都较为困难,对于化合物2'-氟-2'-脱氧鸟苷而言,已公开的合成方法均为耗时、昂贵、低效的多步骤化学合成路线,存在使用大量危险化学品、对环境不友好、不适合大规模工业化生产的问题。
N-脱氧核糖转移酶能够催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移,近年来出现了通过酶催化制备脱氧核苷类药物和中间体的报道。中国专利申请CN105754899A公开了一种N-脱氧核糖转移酶酶法合成脱氧核苷的方法,其将重组表达与纯化的N-脱氧核糖转移酶粗酶液,加入反应体系进行酶催化反应。中国专利申请CN114231522A公开了一种固定化的N-脱氧核糖转移酶和脱氧核苷的制备方法,其通过亲和标签固定N-脱氧核糖转移酶,并将固定化的N-脱氧核糖转移酶加入所述反应体系,制备脱氧核苷。可见目前的用于催化的N-脱氧核糖转移酶存在表达量低和/或比活力低等问题,所以催化过程需要进行酶纯化或者固定,致使脱氧核苷的制备过程成本高、反应效率低、反应周期长、产物抑制等。因此,在酶法生产脱氧核苷,包括2'-氟-2'-脱氧鸟苷的过程中,筛选获得高表达量、高催化活性、高稳定性及不容易出现产物抑制的酶,并且开发工艺简单、底物转化率高,环境友好的催化工艺,是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述技术问题,本发明采用分子生物学和过程优化手段对来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的脱氧核糖转移酶基因序列进行改造得到N-脱氧核糖转移酶改造基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该N-脱氧核糖转移酶改造基因在大肠杆菌中可较好的表达。
本发明还提供上述N-脱氧核糖转移酶改造基因编码的蛋白,该蛋白即为N-脱氧核糖转移酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,该N-脱氧核糖转移酶对底物转化效率高且稳定性较好,在70℃下保存48h能够保留60%的活性。
本发明还提供了表达上述N-脱氧核糖转移酶的工程菌,该工程菌可以高效表达上述N-脱氧核糖转移酶,解决了现有技术中N-脱氧核糖转移酶表达量低、催化活性低、催化反应所需时间长的问题。
优选技术方案中,所述工程菌由重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌获得,所述重组质粒由SEQ ID NO:1所示的基因克隆到质粒载体上获得。进一步的,所述大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和Shuffle T7中的一种;所述质粒载体为pET28a、pET32a和pET39a中的一种。
本发明提供上述N-脱氧核糖转移酶、重组表达载体或重组菌在合成脱氧核苷、特别是2'-氟-2'-脱氧鸟苷中的应用,优选技术方案为所述的重组菌或重组菌的培养物或N-脱氧核糖转移酶直接催化底物合成而来。
本发明提供一种生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷的方法,表达上述N-脱氧核糖转移酶的工程菌经发酵培养后,发酵液直接作为催化剂转化底物生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷。
优选技术方案中,应用上述N-脱氧核糖转移酶生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷的方法,包括以下步骤:
S1:向含有脱氧核糖转移酶的发酵液中加入氯化镁和缓冲盐,制备成反应体系,并向反应体系中加入催化底物;
S2:反应液在35~80℃下反应,用碱调节反应液pH至7.0;
S3:反应结束后,煮沸5min终止反应。
进一步的,所述步骤S1中,底物为2'-氟-2'-脱氧尿苷,及鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.2~0.5mol/L,鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种浓度为0.3~0.8mol/L,氯化镁的浓度为0.05-0.2g/L。
进一步的,所述步骤S1中缓冲盐可以是磷酸盐和Tris-HCl中的一种,其中,磷酸盐优选为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,两者浓度均为0.05~0.5mol/L,优选为所述的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等物质量加入。
进一步的,所述Tris-HCl的浓度为0.05-0.5mol/L。
进一步的,所述步骤S2具体为将反应器皿置于水浴锅中调控反应温度,使反应液在35~80℃下反应,每隔4~6h用2mol/L氢氧化钠调节反应液pH,反应时间为48~120h。
进一步的,反应温度优选50℃,催化时间优选96h内。
2'-氟-2'-脱氧鸟苷的最高积累量可突破100g/L,底物转化率最高可达80%以上,极大地克服了现有技术中存在的底物转化率低及催化反应时间长等问题。
上述技术方案的有益效果为:
(1)本发明通过基因改造方式得到的N-脱氧核糖转移酶改造基因,能在宿主菌,特别是大肠杆菌工程菌中高效表达,提高工程菌重组表达N-脱氧核糖转移酶的能力。
(2)本发明的N-脱氧核糖转移酶活性强且稳定性好,对底物浓度耐受性较好,最高底物浓度可以达到100g/L以上,底物转化率高达80%以上,远高于现有的N-脱氧核糖转移酶。
(3)本发明重组工程菌经发酵培养后,发酵液直接作为催化剂转化底物生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷,不需要对脱氧核糖转移酶进行分离纯化操作,使后续脱氧核苷的催化工艺简单易操作,效率高且环境友好。
具体实施方式
除非下文另外定义,本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
实施例1基因工程菌的构建与培养
本发明通过基因组数据库挖掘和同源序列比对等方法,结合分子生物学手段从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中获得N-脱氧核糖转移酶基因序列,同时采用分子生物学和过程优化手段对N-脱氧核糖转移酶基因序列进行改造得到如SEQ ID NO:1所示的N-脱氧核糖转移酶改造基因。
S1:将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行人工合成(委托南京擎科生物科技有限公司合成),得到改造N-脱氧核糖转移酶基因;
S2:采用NcoI和XhoI双酶切N-脱氧核糖转移酶基因和pET28a质粒载体(pET28a质粒载体购自南京擎科生物科技有限公司),对酶切产物进行胶回收;
S3:用T4连接酶连接酶切产物,并将连接产物转化到BL21(DE3)宿主大肠杆菌(BL21(DE3)宿主大肠杆菌购自南京擎科生物科技有限公司);
S4:挑取单菌落接种到装有LB液体培养基的试管中,37℃,250rpm下培养6-10h;提取重组质粒;
S5:进行酶切验证,将含有N-脱氧核糖转移酶基因的重组质粒进行测序验证(测序送到南京擎科生物科技有限公司进行,测序结果显示重组基因序列完整的菌株,即为携带N-脱氧核糖转移酶基因重组质粒的菌株),选出N-脱氧核糖转移酶基因正确的菌株,即为表达N-脱氧核糖转移酶的基因工程菌。
实施例2N-脱氧核糖转移酶的诱导表达
S1:将实施例1筛选出的基因工程菌接入含有80mg/L卡那霉素的LB平板37℃培养14-18h;
S2:挑取单菌落至含有80mg/L卡那霉素的LB培养基中,37℃、250rpm培养10-15h,形成种子液;
S3:将种子液以5%的接种量转接至含有80mg/L卡那霉素的LB培养基中,37℃、250rpm培养至OD600nm为1.5;
S4:加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG,在23℃下诱导发酵,诱导5h后,结束发酵,发酵液即为N-脱氧核糖转移酶液。
实施例3催化生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷
S1:向实施例2所得发酵液中加入氯化镁和缓冲盐磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,使催化反应体系中氯化镁的浓度为0.05g/L,缓冲盐磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的浓度均为0.05mol/L,制成催化反应体系,并向反应体系中加入催化底物2'-氟-2'-脱氧尿苷和鸟嘌呤,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.3mol/L,鸟嘌呤浓度为0.4mol/L;
S2:反应液在80℃下反应,每隔4-6h用2mol/L氢氧化钠调节反应液pH至7.0;
S3:持续催化反应48h后,煮沸5min终止反应,取终止反应液离心,获取上清液,稀释一定倍数后,进行液相检测,检测结果表明,产物2'-氟-2'-脱氧鸟苷的浓度为0.234mol/L(66.74g/L),转化率为78%。
实施例4催化生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷
S1:向实施例2所得发酵液中加入氯化镁和缓冲盐磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,使催化反应体系中氯化镁的浓度为0.1g/L,缓冲盐磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的浓度均为0.5mol/L,制成催化反应体系,并向反应体系中加入催化底物2'-氟-2'-脱氧尿苷和鸟苷,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.5mol/L,鸟苷浓度为0.8mol/L;
S2:反应液在50℃下反应,每隔4-6h用2mol/L氢氧化钠调节反应液pH至7.0;
S3:持续催化反应120h后,煮沸5min终止反应,取终止反应液离心,获取上清液,稀释一定倍数后,进行液相检测,检测结果表明,产物2'-氟-2'-脱氧鸟苷的浓度为0.41mol/L(117g/L),转化率为81%。
实施例5催化生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷的方法
S1:向实施例2所得发酵液中加入氯化镁和缓冲盐磷酸Tris-HCl,使催化反应体系中氯化镁的浓度为0.2g/L,缓冲盐Tris-HCl的浓度为0.5mol/L,制成催化反应体系,并向反应体系中加入催化底物2'-氟-2'-脱氧尿苷和单磷酸鸟苷,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.4mol/L,单磷酸鸟苷浓度为0.6mol/L;
S2:反应液在35℃下反应,每隔4-6h用2mol/L氢氧化钠调节反应液pH至7.0;
S3:持续催化反应96h后,煮沸5min终止反应,取终止反应液离心,获取上清液,稀释一定倍数后,进行液相检测,检测结果表明,产物2'-氟-2'-脱氧鸟苷的浓度为0.33mol/L(94.1g/L),转化率为82.5%。
实施例6对比例
S1:参照实施例1和实施例2的方法,将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中N-脱氧核糖转移酶原始基因序列进行基因工程菌的异源表达,并经发酵后,获得未经突变的N-脱氧核糖转移酶发酵液;
S2:向未经突变的N-脱氧核糖转移酶发酵液中加入氯化镁和缓冲盐Tris-HCl,使催化反应体系中氯化镁的浓度为0.2g/L,缓冲盐Tris-HCl的浓度为0.5mol/L,制成催化反应体系,并向反应体系中加入催化底物2'-氟-2'-脱氧尿苷和单磷酸鸟苷,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.4mol/L,单磷酸鸟苷浓度为0.6mol/L;
S3:反应液在35℃下反应,每隔4-6h用氢氧化钠调节反应液pH至7.0;
S4:持续催化反应96h后,煮沸5min终止反应,取终止反应液离心,获取上清液,稀释一定倍数后,进行液相检测,检测结果表明,产物2'-氟-2'-脱氧鸟苷的浓度为0.04mol/L(11.4g/L),转化率为10%。
实施例6与实施例5对比可知,未经突变的原始N-脱氧核糖转移酶活性与突变后的酶活性具有显著差异,从而证明突变后,N-脱氧核糖转移酶的活性得到极大提升,利于2'-氟-2'-脱氧鸟苷的催化合成。
Claims (16)
1.一种N-脱氧核糖转移酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述N-脱氧核糖转移酶的编码核苷酸序列,其序列如SEQ ID NO:1所示。
3.含有权利要求2所述编码核苷酸序列的重组表达载体或重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体或重组菌,其特征在于,所述表达载体为质粒;重组菌为大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌,其特征在于,所述质粒为pET28a、pET32a和pET39a中的一种;所述大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和ShuffleT7中的一种。
6.根据权利要求4所述的重组菌,其特征在于,所述重组菌由重组表达质粒转化大肠杆菌获得。
7.权利要求1所述N-脱氧核糖转移酶、权利要求3-6所述重组表达载体或重组菌在合成脱氧核苷中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述脱氧核苷为2'-氟-2'-脱氧鸟苷。
9.根据权利要求7-8所述应用,其特征在于,所述脱氧核苷为权利要求3-6所述的重组菌或包含权利要求3-6所述重组菌的发酵液或权利要求1所述N-脱氧核糖转移酶直接催化合成而来。
10.一种生产2'-氟-2'-脱氧鸟苷的方法,其特征在于,将包含权利要求3-6所述重组菌的发酵液制成反应体系,一步反应生成2'-氟-2'-脱氧鸟苷。
11.根据权利要求10所述的生产方法,其特征在于,反应体系还包含氯化镁、缓冲盐和催化底物,反应体系pH为5.5~8.0;反应结束后,煮沸终止反应。
12.根据权利要求11所述的生产方法,其特征在于,所述氯化镁的浓度为0.05~0.2g/L;所述缓冲盐为磷酸盐或Tris-HCl;所述催化底物为2'-氟-2'-脱氧尿苷,及鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种,其中,2'-氟-2'-脱氧尿苷浓度为0.2~0.5 mol/L,鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种浓度为0.3~0.8mol/L。
13.根据权利要求12所述的生产方法,其特征在于,所述磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,浓度均为0.05~0.5 mol/L。
14.根据权利要求13所述的生产方法,其特征在于,所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等物质的量加入。
15.根据权利要求12所述的生产方法,其特征在于,所述Tris-HCl浓度为0.05~0.5mol/L。
16.根据权利要求10-15所述的生产方法,其特征在于,所述反应体系置于水浴锅中调控反应温度,使反应在35~80℃下发生;每隔4~6h用碱调节反应体系pH至7.0;反应时间为48~120h;调节pH所用的碱为2mol/L氢氧化钠。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211517289.5A CN115725535B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211517289.5A CN115725535B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115725535A CN115725535A (zh) | 2023-03-03 |
CN115725535B true CN115725535B (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=85299287
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211517289.5A Active CN115725535B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115725535B (zh) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7781394B2 (en) * | 2006-11-13 | 2010-08-24 | Institut Pasteur | Methods for identifying anti-tumor and/or anti-angiogenesis drugs with deoxynucleoside 5′-monophosphate N-glycosidase as the target |
JP2016518838A (ja) * | 2013-04-29 | 2016-06-30 | プラズミア バイオテック,エス.エル. | 活性医薬成分としてのヌクレオシドアナログの生体触媒生成 |
CN105754899B (zh) * | 2016-04-08 | 2019-06-21 | 南京工业大学 | 一种n-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用 |
KR102000927B1 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-07-17 | 에스티팜 주식회사 | N-데옥시리보실 트랜스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 뉴클레오시드의 제조방법 |
CN108018252B (zh) * | 2017-12-12 | 2021-07-30 | 山东格得生物科技有限公司 | 一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法 |
CN109295026B (zh) * | 2018-10-18 | 2021-08-24 | 清华大学 | 一种n-脱氧核糖转移酶ii定向进化改造和生物催化应用 |
CN110819604B (zh) * | 2019-12-05 | 2021-07-27 | 上海兆维科技发展有限公司 | 脱氧核糖转移酶突变体及其应用 |
-
2022
- 2022-11-30 CN CN202211517289.5A patent/CN115725535B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115725535A (zh) | 2023-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109402158B (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法 | |
CN111601888B (zh) | 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法 | |
CN113652385B (zh) | 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用 | |
CN114774343A (zh) | 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用 | |
CN112662637B (zh) | 一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用 | |
CN111394292A (zh) | 一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN114874964A (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
CN115725535B (zh) | 一种n-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用 | |
JPWO2004009830A1 (ja) | Cmp−n−アセチルノイラミン酸の製造法 | |
CN113684163B (zh) | 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法 | |
CN114806991A (zh) | 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法 | |
CN116676243A (zh) | 产2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 | |
JP2003093091A (ja) | Cmp−n−アセチルノイラミン酸の製造法 | |
CN112553174B (zh) | 一种脱氢酶在(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用 | |
CN111575258B (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 | |
CN114940985B (zh) | 兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白及应用 | |
CN114875087B (zh) | 以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用 | |
CN111321178B (zh) | 一种l-2-氨基丁酰胺的制备方法 | |
CN118064525A (zh) | 一种双酶蛋白组合及其一锅法制备胞苷三磷酸的方法 | |
CN107201355B (zh) | 一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用 | |
CN117965484A (zh) | 高效合成乳酰-n-岩藻糖基五糖-ⅴ的工程大肠杆菌的构建方法及应用 | |
CN117025497A (zh) | 催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用 | |
CN115925980A (zh) | 融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及n-乙酰神经氨酸的生产方法 | |
CN118272331A (zh) | 一种烯还原酶突变体及其在(r)-香茅醛合成中的应用 | |
CN116179459A (zh) | 一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |