CN116179459A - 一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多酶协同表达重组基因工程菌，以及其在生物催化制备L‑2‑氨基丁酸中的应用。本发明通过构建亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因共表达体系，转化至表达菌中得到重组基因工程菌，以经发酵培养的重组基因工程菌活细胞作为催化剂应用于制备L‑2‑氨基丁酸的催化反应体系中，生产效率高，当L‑苏氨酸投料量为300g/L时，反应12h，转化率达99％以上，有效提高了催化高浓度底物生成L‑2‑氨基丁酸的能力。本发明使用全细胞作为催化剂，避免了酶的纯化，避免了破碎细胞，操作简便；两个酶在一个细胞中，可减少空间位阻，加快反应速度；以去离子水为反应介质构成反应体系，反应产物提纯方便；反应过程中底物浓度高，节约生产成本和时间。

Description

一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种多酶协同表达重组基因工程菌，以及其在生物催化制备L-2-氨基丁酸中的应用。
(二)背景技术
L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyricacid，L-ABA)是一种非天然氨基酸，可以提高葡萄糖磷酸酯酶活性，促进脑细胞新陈代谢，医学临床用于无痛去龋和脑血管病后遗症，并且具有降压功效。此外，L-2-氨基丁酸还是一种重要的化工原料和医药中间体，可通过酰胺化制备(S)-2-氨基丁酰胺盐，是合成抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体，也可通过还原末端羧基用于制备(S)-2-氨基丁醇，并被用来合成乙胺丁醇。L-2-氨基丁酸的工业化生产技术已成为制药工程研究的热点。
L-2-氨基丁酸的制备方法主要包括化学合成法、生物合成法两种。其中化学法包括脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原法等。化学合成策略存在明显的缺点，如选择性差、反应条件苛刻、副产物种类繁多、分离纯化难度大等。
L-2-氨基丁酸的生物合成方法包括微生物发酵法、酶的手性拆分法及酶转化法三种。微生物发酵法是以葡萄糖为营养物质，通过改造后的大肠杆菌生产L-2-氨基丁酸。手性拆分法是将混旋型的DL-2-氨基丁酸通过D-氨基氧化酶作用将D-2-氨基丁酸氧化掉生成酮酸，再用转氨酶或氨基酸脱氢酶催化使酮酸重新转化成L-2-氨基丁酸，使得原先的混旋物变成光学纯的L-2-氨基丁酸。L-2-氨基丁酸的合成大部分研究都集中在酶转化法。通过以L-苏氨酸为底物，通过转氨酶的作用转化为2-酮丁酸，在通过脱氢酶的作用将其转化成L-2-氨基丁酸，同时再偶联辅酶循环体系，提高辅酶的利用率可以极大的提高产量。酶转化法由于其转化效率高、原料价格便宜、无副产物生成、产品易于提取、环境友好等特点，被越来越多的研究和应用。
核糖体结合位点是指起始密码子AUG上游的一段富含嘌呤的非翻译区，在RBS中有SD(Shine-Dalg-arno)序列，长度一般为5个核苷酸，富含G,A，该序列与核糖体16SrRNA的3'端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离。SD与AUG之间相距一般以4～10个核苷酸为佳，9个核苷酸最佳。
(三)发明内容
本发明目的是提供了一种酶表达量高，底物转化率高的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组基因工程菌，将其应用于L-2-氨基丁酸的工业化生产中，利用细胞多酶协同表达系统，实现反应过程中对高浓度底物的催化反应。
本发明采用的技术方案是：
一种多酶协同表达重组基因工程菌，由如下方法构建获得：采用单质粒双基因表达载体，在其多克隆位点插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，并将其限制性酶位点前的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT，转化宿主细胞，得到所述多酶协同表达重组基因工程菌；所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述单质粒双基因表达载体为pACYCDuet、pCDFDuet、pETDuet或pRSFDuet之一。所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
优选的，所述单质粒双基因表达载体为pRSFDuet，在其MCS1和MCS2中插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，获得pRSFDuet-fdh-Leudh，并将其MCS1的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT。
本发明还涉及所述的重组基因工程菌在生物催化制备L-2-氨基丁酸中的应用。
具体的，所述应用为：以所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的活细胞为催化剂，以L-苏氨酸为起始底物、甲酸铵作为辅酶循环再生的辅底物，并添加苏氨酸脱氨酶，以去离子水为反应介质构成反应体系，进行酶催化反应，反应结束后，得到含L-2-氨基丁酸的反应液，反应液经过分离纯化，得到所述L-2-氨基丁酸。
重组基因工程菌的发酵培养方法为：将重组基因工程菌接种于含有抗生素的培养基中培养，获得种子液，经扩大培养获得OD600达到0.6～0.9的菌液，加入IPTG作为诱导剂，22-28℃诱导10-18h，发酵培养结束后，收集湿菌体。
培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选为TB培养基，TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，丙三醇5g/L，三水合磷酸二氢钾2.312g/L，无水磷酸氢二钾12.54g/L，加蒸馏水溶解，pH7.0。
种子液培养的条件为37℃，180r/min条件下培养12h。扩大培养的条件为37℃，180r/min。
摇瓶培养重组基因工程菌时，采用IPTG作为诱导剂，终浓度0.06-0.12mmol/L，诱导温度22-30℃，诱导时间10-16h。作为优选，诱导温度为28℃，诱导剂浓度为0.1mmol/L的IPTG，诱导时间为14h。
发酵罐培养基因工程菌时，采用乳糖作为诱导剂，往菌液中加到质量终浓度≥4g/L的乳糖，诱导培养13-19h。作为优选，乳糖最佳诱导浓度为8g/L，诱导时间为17h。
所述反应体系中，L-苏氨酸质量浓度为100～500g/L，甲酸铵质量浓度为100～200g/L，苏氨酸脱氨酶浓度为20000～30000U/L，重组基因工程菌活细胞以菌体湿重计为10～50g/L，酶催化的温度为25～40℃，反应时间为2～16h，反应开始20～30min后加入0.1～1.0g/L辅酶NAD+。
更为优选，最优的反应体系中，L-苏氨酸质量浓度为300g/L，甲酸铵质量浓度为158g/L，苏氨酸脱氨酶浓度为25000U/L，重组基因工程菌活细胞以菌体湿重计25g/L，辅酶添加量为0.20g/L；酶催化的温度为35℃，反应时间为12h，转化率为99％以上，e.e.值在99.5％以上，催化效率高。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明通过构建亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因共表达体系，转化至表达菌中得到重组基因工程菌，以经发酵培养的重组基因工程菌活细胞作为催化剂应用于制备L-2-氨基丁酸的催化反应体系中，生产效率高，当L-苏氨酸投料量为300g/L时，反应12h，转化率达99％以上。该菌株能有效提高催化高浓度底物生成L-2-氨基丁酸的能力。
(2)本发明使用全细胞作为催化剂，避免了酶的纯化，避免了破碎细胞，操作简便；两个酶在一个细胞中，可减少空间位阻，加快反应速度；以去离子水为反应介质构成反应体系，反应产物提纯方便；反应过程中底物浓度高，节约生产成本和时间。
(四)附图说明
图1为共表达质粒构建示意图；其中(A)为pACYCDuet-leudh-fdh，(B)为pACYCDuet-fdh-leudh，(C)为pCDFDuet-leudh-fdh，(D)为pCDFDuet-fdh-leudh，(E)为pETDuet-leudh-fdh，(F)为pETDuet-fdh-leudh，(G)为pRSFDuet-leudh-fdh，(H)为pRSFDuet-fdh-leudh。
图2为替换RBS序列对pRSFDuet-fdh-leudh的SDS-PAGE(A)和底物转化率(B)的影响，(A)中A-G分别是在不同预测翻译起始速率下诱导培养的菌体破碎上清物，a-g相对应的沉淀物。
图3为诱导温度对pRSFDuet-fdh-leudh的SDS-PAGE(A)和底物转化率(B)的影响，(A)中A-E分别是在诱导温度22、24、26、28和30℃下诱导培养的菌体破碎上清物，a-e相对应的沉淀物。
图4为诱导剂浓度对pRSFDuet-fdh-leudh的SDS-PAGE(A)和底物转化率(B)的影响，(A)中A-E分别是在诱导剂浓度0.06、0.08、0.1、0.12和0.14mmol/L下诱导培养的菌体破碎上清物，a-e相对应的沉淀物。
图5为诱导时间对pRSFDuet-fdh-leudh的SDS-PAGE(A)和底物转化率(B)的影响，(A)中A-D分别是在诱导时间10、12、14和16下诱导培养的菌体破碎上清物，a-d相对应的沉淀物。
图6为催化反应温度对制备L-2-氨基丁酸的影响。
图7为发酵罐培养诱导剂浓度对催化反应进程的影响。
图8为发酵罐培养诱导时间对催化反应进程的影响。
图9利用pRSFDuet-fdh-leudh菌株制备L-2-氨基丁酸的反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：亮氨酸脱氢酶基因(LeuDH)和甲酸脱氢酶基因(FDH)克隆及共表达重组体系构建
亮氨酸脱氢酶的基因来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomycesintermedius)的全基因组序列。为了使该基因连接到载体pET-28b后可以表达带有His-tag的蛋白，切除其终止密码子，并以B.subtilis168的密码子偏好性为参照对其序列和常用限制性内切酶识别位点BamHI、XhoI、PstI、HindIII和NcoI进行序列优化，获得新的亮氨酸脱氢酶基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2)，已在专利申请(201610867380.8)中公开，并已将新的亮氨酸脱氢酶基因连接于表达载体pET-28b上，即为pET-28b-leudh。
甲酸脱氢酶基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4)来源于禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，已连接于表达载体pET-28b上，即为pET-28b-fdh。
以pET-28b-leudh为模板，PCR扩增得到亮氨酸脱氢酶基因片段。
上游引物(引物1)：5’-CCATGGGTAAAATCTTCGACTACATG-3’(SEQ ID NO.5)，
下游引物(引物2)：5’-AAGCTTTTATTTGTTGTTGAAGTTGA-3’(SEQ ID NO.6)；
以pET-28b-fdh为模板，PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段。
上游引物(引物3)：
5’-CATATGGGTAAAATTGTACTGGTTCTGTATGAC-3’(SEQ ID NO.7)，
下游引物(引物4)：
5’-CTCGAGTTATTTCTTGTCGTGTTTACCGTAC-3’(SEQ ID NO.8)。
PCR反应体系(50μL)为：2×Taqpolymerasebuffer 25μL，dNTPMixture 2μL；Taqpolymerase DNA聚合酶2μL；模板质粒1μL；上下游引物各1μL；无菌水18μL。
采用Bio-RadPCR仪，反应的程序为95℃预变性10min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min(32个循环)；72℃延伸10min。
获得PCR扩增产物采用回收试剂盒(Axygen,美国爱思进)回收，纯化后的片段分别标记为片段leudh，片段fdh。
利用一步克隆法将pACYCDuet质粒线性化，标记为V-pACYCDuet。
利用一步克隆法将获得的酶片段与线性化载体连接。
连接体系(20μL)为：线性化载体V-pACYCDuet 1μL，片段leudh 1μL，5×CEⅡbuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，无菌水12μL
采用Bio-RadPCR仪，37℃，连接30min，即构建得到含有本发明的亮氨酸脱氢酶基因片段的单质粒重组共表达载体pACYCDuet-leudh-MCS2，将构建好的pACYCDuet-leudh-MCS2进行载体线性化，再利用如上连接体系将甲酸脱氢酶基因片段连接到载体上，获得pACYCDuet-leudh-fdh。
采用相同策略构建得到的单质粒共表达体系为：pACYCDuet-leudh-fdh，pACYCDuet-fdh-leudh，pCDFDuet-leudh-fdh，pCDFDuet-fdh-leudh，pETDuet-leudh-fdh，pETDuet-fdh-leudh，pRSFDuet-leudh-fdh，pRSFDuet-fdh-leudh。
将共表达体系共转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，转化方法为：质粒1～2μL，加入到100μLE.coliBL21(DE3)感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管置于42℃水浴热击90s，然后立即转移到冰上冷却5min；向管中加入600μLLB液体培养基，置于37℃、200r/min恒温摇床上培养45min，然后涂布于含有相应抗性的LB固体平板上，37℃培养12～18h。
实施例2：核糖体结合位点(RBS)序列的替换
如上所知，选择E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh为优选工程菌用于后续研究，通过实验可知，在本催化反应中，fdh为限速酶，为了提高催化效率，本实验通过在RBS文库网站进行计算，合成7段不同预测翻译起始速率的RBS序列，并且通过一部克隆的方法将合成RBS序列替换pRSFDuet-fdh-leudh载体MCS1前的RBS序列，所述替换的RBS序列如表2所示。
表2：不同预测翻译起始速率的RBS序列
Figure BDA0004024543040000071
以RBS-1为例，但不局限于本发明。以pRSFDuet-fdh-leudh为模板，将RBS-1序列合成在引物内，通过一步克隆法，将原始的RBS序列替换为RBS-1。
上游引物(引物5)：
5’-TGTACCCTCTTTTATATAAATTTGAGTTGAGGACCCTTTTTatataccATGGCC-3’(SEQ IDNO.9)，
下游引物(引物6)：
5’-AAAAAGGGTCCTCAACTCAAATTTATATAAAAGAGGGTACAattaaagttaaaca aaa-3’(SEQID NO.10)；
PCR反应体系(50μL)为：2×Taqpolymerasebuffer 25μL，dNTPMixture 2μL；Taqpolymerase DNA聚合酶2μL；模板质粒1μL；上下游引物各1μL；无菌水18μL。
采用Bio-RadPCR仪，反应的程序为95℃预变性10min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s(30个循环)；72℃延伸10min，获得RCR产物标记为RBS-1。
将RBS-1转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，转化方法为：质粒1～2μL，加入到100μLE.coliBL21(DE3)感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管置于42℃水浴热击90s，然后立即转移到冰上冷却5min；向管中加入600μLLB液体培养基，置于37℃、200r/min恒温摇床上培养45min，然后涂布于含有相应抗性的LB固体平板上，37℃培养12～18h。
在涂布有RBS-1LB固体平板上，挑菌送测，检测是否成功，保藏成功的菌株，记为E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-1)，后续的RBS序列替换如上。
将替换好的菌株标记为pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-1)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-2)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-4)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-5)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-6)、pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-7)。
实施例3：不同共表达体系亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的表达
将上述实施例1和实施例2构建的不同共表达菌株，接种至装有10mL LB液体培养基的试管，并加入相应的抗性，在37℃，150r/min条件下摇床培养12h，获得种子液，种子液以体积分数1％(v/v)的接种量转接至100mL LB液体培养基中，并添加抗性，37℃，180r/min培养至OD600达到0.6～0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol/L，诱导温度28℃，诱导时间14h。发酵结束后4℃，8000r/min，10min离心，弃上清，生理盐水洗涤两次，收集菌体，4℃保存备用。
实施例4：不同共表达菌株生产L-2-氨基丁酸的效率
样品检测方法：美国Thermo Fisher Scientific高效液相色谱仪，色谱柱EclipseXD8-C18(5μm4.6mm×250mm)，流动相：0.02mol/L的磷酸氢二钠(pH7.2):乙腈＝70:30，流速:1.0mL/min，柱温：30℃，紫外检测波长：360nm。
样品衍生化条件：取100μL待测样品，与100μL 0.5mol/L的NaHCO3溶液和100μL1％(v/v)2,4-二硝基氟苯乙腈溶液混合，60℃避光保温1h，反应结束后冷却至室温，再加入700μLNaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(0.2mol/L，pH7.0)。原理：氨基酸的游离末端NH2在碱性环境中可与2,4-二硝基氟苯发生亲核芳环取代反应，可用HPLC定量检测生成的二硝基苯氨基酸衍生物。在上述条件下，2,4-二硝基氟苯和L-2-氨基丁酸的保留时间分别为4.1分钟和5.8分钟，如图2所示。
优势菌株的筛选：反应体系为240g/L底物L-苏氨酸，126g/L辅底物甲酸铵，20000U/L苏氨酸脱氨酶粗酶液，20g/L菌体(实施例2获得的各个菌体)，于去离子水中构成100mL反应体系，在35℃、600r/min条件下进行酶催化反应12h，反应30min后加入0.20g/LNAD+。反应过程中定时取样，用浓盐酸终止反应，样品用于液相色谱分析。具体测定结果示于表1。
通过生产L-2-氨基丁酸的效率来衡量共表达菌株的优劣，催化效率较高的共表达菌株如下：pCDFDuet-leudh-fdh，pRSFDuet-leudh-fdh，pRSFDuet-fdh-leudh，pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)。其中pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)的催化效率最高，底物转化率达99.5％。故选择E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)为优选工程菌用于后续研究。
表1：不同共表达体系构建菌株的催化性能
Figure BDA0004024543040000091
Figure BDA0004024543040000101
注：表示在反应体系为240g/L底物L-苏氨酸，126g/L辅底物甲酸铵，20000U/L苏氨酸脱氨酶粗酶液，20g/L菌体(实施例1和实施例2获得的各个菌体)，于去离子水中构成100mL反应体系，在35℃、600r/min条件下进行酶催化反应12h，反应30min后加入0.20g/LNAD+。
实施例5：E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)菌株摇瓶培养发酵条件优化
反应体系同上述优势菌株的筛选条件，优化E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)摇瓶培养的发酵条件，选择SDS-PAGE和底物转化率作为参考指标。首先优化了诱导温度，诱导时加入0.1mmol/L的IPTG，分别在22、24、26、28、30℃条件下诱导14h，结果见图3，由图可知，28℃为最佳的诱导温度。
进一步考察IPTG浓度对产酶的影响，诱导时分别添加0.06、0.08、0.1、0.12、0.14mmol/L诱导剂IPTG，28℃条件下诱导14h，结果见图4，最终确定最佳IPTG浓度为0.1mmol/L。
进一步考察了诱导时间对产酶的影响，诱导时加入0.1mmol/L的IPTG，28℃条件下分别诱导10、12、14、16h，由图5可知，最佳诱导时间为14h。
实施例6：反应温度对制备L-2-氨基丁酸的影响
反应温度对制备L-2-氨基丁酸的影响，在反应体系为240g/L底物L-苏氨酸，126g/L辅底物甲酸铵，20000U/L苏氨酸脱氨酶粗酶液，20g/L菌体(E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3))，于去离子水中构成100mL反应体系，在35℃、600r/min条件下进行酶催化反应12h，反应30min后加入0.20g/L NAD+，分别在25、30、35、40、45℃，600r/min条件下进行酶催化反应12h，结果见图6。在35℃之前，随着反应温度的提高，转化率也提高，当反应温度为35℃时，转化率达到最高，继续升高反应温度，转化率急剧下降，可能是因为过高的反应温度使酶失活，综合实验结果，确定35℃为最佳反应温度。
实施例7：E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)菌株发酵罐培养发酵条件优化
在摇瓶培养发酵的基础上，进行大规模发酵罐培养发酵，以验证E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)菌株工业化应用能力。首先考察乳糖浓度对催化反应进程的影响，将共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组基因工程菌接种至装有100mL LB液体培养基的摇瓶，并分别添加终浓度为50mg/L的卡那霉素，在37℃，150r/min条件下摇床培养12h，作为种子液，种子液以体积分数10％(v/v)的接种量转接至3L发酵培养基中，并分别添加终浓度为50mg/L的卡那霉素，通气量0.6vvm，pH7.0(用体积分数50％的甘油水溶液和氨水水溶液调节)，37℃，450r/min培养至OD600达到8～10，分别添加质量浓度为6、8、10、12g/L的乳糖，诱导温度28℃，诱导时间17h。发酵结束后4℃，8000r/min，10min离心，弃上清，生理盐水洗涤两次，收集菌体，4℃保存备用。
反应体系为240g/L底物L-苏氨酸，126g/L辅底物甲酸铵，20000U/L苏氨酸脱氨酶粗酶液，20g/L菌体，于去离子水中构成100mL反应体系，在35℃、600r/min条件下进行酶催化反应12h，反应30min后加入0.20g/L NAD+，结果见图7，由图7可知，过低的乳糖添加量不利于反应的进行，使底物完全转化的最低乳糖浓度为8g/L，继续提高乳糖浓度对反应的进程没有明显影响，确定最适的乳糖质量浓度为8g/L。
进一步考察诱导时间对催化反应进程的影响，随着诱导时间的延长，酶蛋白的表达量会有一定程度的增加，为了确定最适诱导时间，诱导时添加质量浓度为8g/L的乳糖，诱导温度28℃，分别在降温诱导13、15、17、19h后取样检测，其余培养条件和反应条件同上，结果见图8，由图8可知，随着诱导时间的延长，目的蛋白酶的催化能力逐渐升高，诱导17h后，催化能力基本达到稳定，其后增长不明显。最终确定诱导时间为17h。
实施例8：利用E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)菌株制备L-2-氨基丁酸的反应进程
将E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-fdh-leudh(RBS-3)接种至装有100mL LB液体培养基的摇瓶，并分别添加终浓度为50mg/L的卡那霉素，在37℃，150r/min条件下摇床培养12h，作为种子液，种子液以体积分数10％(v/v)的接种量转接至3L发酵培养基中，并分别添加终浓度为50mg/L的卡那霉素，通气量0.6vvm，pH7.0(用体积分数50％的甘油水溶液和氨水水溶液调节)，37℃，450r/min培养至OD600达到8～10，加入质量浓度为8g/L的诱导剂乳糖，诱导温度28℃，诱导时间17h。发酵结束后4℃，8000r/min，10min离心，弃上清，生理盐水洗涤两次，收集菌体，4℃保存备用。
反应体系1L：300g/L底物L-苏氨酸，158g/L辅底物甲酸铵，25000U/L苏氨酸脱氨酶粗酶液，25g/L菌体，于去离子水中构成1000mL反应体系，在35℃、600r/min条件下进行酶催化反应12h，反应30min后加入0.25g/L NAD+。反应过程中定时取样，用浓盐酸终止反应，样品用于液相色谱分析。反应进程见图9，L-2-氨基丁酸在反应2h内生成的速度较快，之后反应速度放缓。反应至12h基本结束，此时底物转化率99％以上，e.e.值99.5％以上。

Claims (6)

1.一种多酶协同表达重组基因工程菌，由如下方法构建获得：采用单质粒双基因表达载体，在其多克隆位点插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，并将其限制性酶位点前的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT，转化宿主细胞，得到所述多酶协同表达重组基因工程菌；所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于所述单质粒双基因表达载体为pACYCDuet、pCDFDuet、pETDuet或pRSFDuet之一。
3.如权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于所述单质粒双基因表达载体为pRSFDuet，在其MCS1和MCS2中插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，获得pRSFDuet-fdh-Leudh，并将其MCS1的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT。
4.权利要求1～3之一所述的重组基因工程菌在生物催化制备L-2-氨基丁酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：以所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的活细胞为催化剂，以L-苏氨酸为起始底物、甲酸铵作为辅酶循环再生的辅底物，并添加苏氨酸脱氨酶，以去离子水为反应介质构成反应体系，进行酶催化反应，反应结束后，得到含L-2-氨基丁酸的反应液，反应液经过分离纯化，得到所述L-2-氨基丁酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，L-苏氨酸质量浓度为100～500g/L，甲酸铵质量浓度为100～200g/L，苏氨酸脱氨酶浓度为20000～30000U/L，重组基因工程菌活细胞以菌体湿重计为10～50g/L，酶催化的温度为25～40℃，反应时间为2～16h，反应开始20～30min后加入0.1～1.0g/L辅酶NAD+。
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