CN114891707A

CN114891707A - 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法

Info

Publication number: CN114891707A
Application number: CN202210568351.7A
Authority: CN
Inventors: 朱俊歌; 吴胜; 陶勇; 翟丽萍
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2022-05-20
Filing date: 2022-05-20
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-05-20
Also published as: CN114891707B

Abstract

本发明属于生物催化技术领域。本发明公开了一株重组菌株HO‑BVR‑GDH pZG‑BW25113及其利用该菌株全细胞催化生产胆红素的方法，所述重组菌株HO‑BVR‑GDH pZG‑BW25113是将质粒pBAD‑HO‑BVR‑GDH转化至底盘细胞pZG‑BW25113中获得。本发明的方法通过构建辅因子循环再生体系，无需额外添加辅因子，进一步降低生产成本；同时具有底物原料充足，生产成本低、反应温和、转化率高、生产效率高等特点，适合胆红素的工业化生产。

Description

重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域。

背景技术

胆红素(bilirubin，C₃₃H₃₆N₄O₈，CAS:635-65-4)是一个具有直链四吡咯结构的二烯胆素类化合物，是胆汁中的主要色素，为淡橙色或深红棕色的单斜晶体，是哺乳类动物体内血红蛋白辅基血红素的代谢产物，具有很多重要的药理作用。它不仅能够镇静，镇惊，降压，解热等作用，还可治疗血清肝炎，肝硬化等疾病。近年来研究发现其还具有促进红细胞新生、抗癌、抗病毒和抗氧化作用等，在化妆品，保健品等领域也逐渐开发应用。

天然牛黄是牛的胆结石，在我国具有二千多年的药用历史，是一味珍贵的中药材，在我国很多中药名方中，天然牛黄都起着不可替代的作用，如安宫牛黄丸、回天再造丸等。目前市场上的牛黄有天然牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄等。鉴于天然牛黄、体外培育牛黄来之不易以及价格居高不下，所以国内牛黄市场以人工牛黄的应用为主，其中国内约650种中成药含有人工牛黄。因此，人工牛黄的应用市场前景广阔。

胆红素是天然牛黄、体外培育牛黄的主要有效成份和人工牛黄不可缺少的原料。经研究，人工牛黄中胆红素含量约0.7％，远低于天然牛黄(＞25％)和体外培育牛黄(＞35％)中胆红素的含量标准，因此，人工牛黄的药效明显差于天然牛黄和体外培育牛黄的药用价值。鉴于胆红素的来源有限，药物配制中主要以价格适中，原料易得的人工牛黄的广泛使用为主。

胆红素以钾、钠、钙盐的形式存在于猪、牛、羊、马等动物的胆汁或胆结石中，且含量甚微。如猪胆汁中含量约0.5‰，受目前广泛使用的技术所限，提取1公斤高纯度的胆红素需要近于4吨的粗猪胆，导致生产胆红素的成本较高，价格昂贵，因此急需开发合适的替代工艺实现大规模生产。

全球胆红素市场年需求量约5吨。由于胆红素的空间结构复杂，关于其化学合成的工艺至今尚未成熟开发。目前围绕胆红素的生产方法主要有两种：一种方法是物理提取，即以猪胆等动物胆汁作为原料通过有机溶剂提取，是目前市场上胆红素的主要获取方法。该模式几乎是目前国内胆红素生产厂家采用的通用方法。鉴于胆红素在动物胆汁中的含量甚微，这种方法需要消耗大量的胆源，从而导致生产成本居高不下，纯利润低。另一种方法是酶催化，用纯酶或粗酶液催化新鲜的动物血液或者血红素生产胆红素，目前关于酶催化的研究侧重于文章发表，专利较少，但共同不足之处在于底物投料量低，成本高，产业化前景渺茫。如公开号CN 103114110A的中国专利以血红素为底物，在外加辅因子NADPH下，用固定化的血红素加氧酶和胆绿素还原酶催化0.1mM血红素转变成胆红素。由于投料量低且需要额外添加昂贵的辅因子，由此导致成本并无明显下降。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113，所述重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113是将质粒pBAD-HO-BVR-GDH转化至底盘细胞pZG-BW25113中获得；所述质粒pBAD-HO-BVR-GDH是用T4DNA连接酶连接HO基因片段、BVR基因片段、GDH基因片段和pBAD线性载体后获得；所述HO基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述BVR基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GDH基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述底盘细胞pZG-BW25113是由大肠杆菌BW25113菌株敲除pgi基因、在zwf基因前插入araC启动子基因和在gndA基因前插入araC启动子基因获得；所述pgi基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述zwf基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述gndA基因的氨基酸序列如SEQID NO.4所示；所述araC启动子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

同时，本发明还提供了一种全细胞催化生产胆红素的方法，包括如下步骤：重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113在葡萄糖和PB缓冲溶液中催化羟高铁血红素变成胆红素。

在本发明的具体实施例中，所述重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113加入量为1g。

在本发明的具体实施例中，所述羟高铁血红素的终浓度为1g/L。

在本发明的具体实施例中，所述加入葡萄糖与羟高铁血红素的物质量比为1:2。

在本发明的具体实施例中，所述PB缓冲溶液为50mM。

在本发明的具体实施例中，所述催化的反应条件为：pH为7.0。

在本发明的具体实施例中，所述催化的反应条件为：温度为25℃。

本发明具有以下有益效果：

(1)底物投料量高，反应时间短，操作简单，产物转化率高，且无任何副产物生成；

(2)实现了辅酶NAPDH/NADP⁺再生的高效全细胞催化生产胆红素，无需额外添加昂贵的辅酶，比现有已报道的生物催化的成本明显减低；

(3)解除原料匮乏对胆红素生产的影响，胆红素的产业化生产不再受猪胆等原料的限制。本发明的实施将为胆红素的规模化生产开辟新的道路。

附图说明

图1.全细胞催化生产胆红素的路线图。

图2.胆红素的液-质色谱分析图。

图3.胆红素的液-质色谱分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

大肠杆菌BW25113菌株购自上海泽叶生物科技有限公司。

Escherichia coli K-12、pKD46和pCP20质粒购自北京润泽康生物科技有限公司。

pBAD载体购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

5×蛋白胶上样缓冲液购自北京华博德亿生物技术有限公司，

SDS-PAGE蛋白分离胶制备参考《分子生物学实验指南》。

未特别说明的实验步骤均按照试剂说明书或参考《分子生物学实验指南》操作。

实施例1

底盘菌株pZG-BW25113的构建

利用Red-同源重组技术，将按照以下步骤构建相应底盘菌株。

1.构建Δpgi BW25113底盘菌株

(1)准备打靶片段。

以大肠杆菌BW25113菌株为模板，设计基于pgi基因的PCR扩增引物。所述pgi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

打靶片段的PCR扩增引物上下游均含有长约30bp的同源序列，且含有卡那抗性基因用于LB平板阳性克隆筛选。

(2)制备pKD46-BW25113电转感受态细胞。

将质粒pKD46转入BW25113感受态细胞中，后涂于氨苄抗性LB平板，30℃培养过夜。次日随机挑取单菌落，转入50ml LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀约0.5时离心收集菌体，按照电转化操作流程，获得pKD46-BW25113电转感受态细胞。

(3)电转化打靶片段。

按照电转操作流程，将打靶片段转入制备的pKD46-BW25113感受态细胞中，30℃、150r/min培养1h后，涂含卡那霉素抗性的LB平板，30℃静置培养过夜。随后挑取单克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证打靶片段整合成功的单菌落涂无抗性LB平板，42℃静置培养过夜。

(4)消除抗性。

按照化转感受态制备过程获得kana-ΔmazG BW25113感受态细胞，转入含氨苄抗性pCP20质粒，LB平板静置培养过夜后，随机挑取单菌落转入5mlLLB液体试管中，加入质量浓度0.5％L-阿拉伯糖培养10h后涂卡那霉素抗性LB平板，无菌斑明显出现的平板表明Δpgi基因敲除成功。

2.构建paraC zwf-Δpgi BW25113底盘菌株

(1)准备打靶片段。

以Δpgi BW25113底盘菌株为模板，设计基于zwf基因的PCR扩增引物。所述zwf基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

打靶片段的PCR扩增引物上下游均含有长约30bp的同源序列，含有araC启动子基因序列以及卡那霉素抗性基因序列用于LB平板阳性克隆筛选。所述araC启动子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

(2)制备pKD46-Δpgi BW25113电转感受态细胞。

将氨苄抗性的质粒pKD46转入大肠杆菌Δpgi BW25113底盘菌株中，后涂于氨苄抗性LB平板，30℃培养过夜。次日随机挑取单菌落，转入50ml LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀约0.5时离心收集菌体，按照电转感受态操作步骤，获得pKD46-ΔpgiBW25113电转感受态细胞。(3)电转化打靶片段。

按照电转操作流程，将打靶片段转入pKD46-Δpgi BW25113感受态细胞中，30℃、150r/min培养1h后，涂含卡那霉素抗性的LB平板，30℃静置培养过夜。

(4)消除抗性。

按照化转感受态制备过程获得kana-paraC zwf-Δpgi BW25113感受态细胞，转入含氨苄抗性pCP20质粒，LB平板静置培养过夜后，随机挑取单菌落转入5mlLLB液体试管中，加入质量浓度0.5％L-阿拉伯糖培养10h后涂卡那霉素抗性LB平板，无菌斑明显出现的平板表明paraC zwf-Δpgi BW25113底盘菌株构建成功。

2.构建pZG BW25113底盘菌株

(1)准备打靶片段。

以paraC zwf-Δpgi BW25113底盘菌株为模板，设计基于gndA基因的PCR扩增引物。所述gndA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

打靶片段的PCR扩增引物上下游均含有长约30bp的同源序列，含有araC启动子基因序列以及卡那霉素抗性基因用于LB平板阳性克隆筛选。所述araC启动子基因的碱基序列如SEQ ID NO.11。

(2)制备pKD46-paraC zwf-Δpgi BW25113电转感受态细胞。

按照电转感受态操作步骤，获得pKD46-paraC zwf-Δpgi BW25113电转感受态细胞。

(3)按照电转操作流程，将打靶片段转入制备的pKD46-paraC zwf-Δpgi BW25113感受态细胞中，30℃、150r/min培养1h后，涂含卡那霉素抗性的LB平板，30℃静置培养过夜。

(4)消除抗性。

按照化转感受态制备过程获得kana-paraC zwf-paraC gndA-Δpgi BW25113感受态细胞，转入含氨苄抗性pCP20质粒，LB平板静置培养过夜后，随机挑取单菌落转入5mlLLB液体试管中，加入0.5％L-阿拉伯糖培养10h后涂卡那霉素抗性LB平板，无菌斑明显出现的平板表明pZG-BW25113底盘菌株构建成功。

实施例2

重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113的构建

1.血红素加氧酶HO、胆绿素还原酶BVR和葡萄糖脱氢酶GDH共表达载体pBAD-HO-BVR-GDH的构建

来源于Macaca mulatta的血红素加氧酶HO基因，其基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5，氨基酸序列如SEQ ID NO.6；

设计引物对如下：

5’-ctagctagcatgtcagcggaagtggaaacc-3’，

和5’-ccatcgattcacatgtagtaccaggccaag-3’；

来源于Epinephelus lanceolatus(LOC117254844)的胆绿素还原酶BVR基因，其基因序列如SEQ ID NO.7，氨基酸序列如SEQ ID NO.8；

设计引物对如下：

5’-ccatcgattctagagaaagaggggacaaactagatggagacagagaagaagactcagcca-3’，

和5’-ccctcgagttaaaaagcaaaggctcctacgctgactgtggccagaaccacaaaaagtcct-3’；

来源于Bacillus megaterium(ATCC 14581)的葡萄糖脱氢酶GDH基因，其基因序列如SEQ ID NO.9，氨基酸序列如SEQ ID NO.10；

设计引物对如下：

5’-ccctcgagtctagagaaagatccgatgtactagatgtatacagatttaaaagataaagta-3’，

和5’-cgggtaccttagcctcttcctgcttggaaagaagggtacagcgtcataccaccatcagc-3’；

通过PCR进行扩增，用NcoI和NheI、NheI和XhoI、XhoI和KpnI分别进行酶切基因片段，PCR得到的基因序列两端分别带有NcoI和NheI、NheI和XhoI、XhoI和KpnI两个酶切位点，PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

NcoI、KpnI酶切pBAD质粒载体，用T4 DNA连接酶连接HO基因片段、BVR基因片段、GDH基因片段和pBAD线性载体，连接产物转化DH5α后涂氨苄霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑单菌落至装有5mL LB的试管培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，PCR扩增验证基因片段大小正确后送测序，测序正确的质粒命名为质粒pBAD-HO-BVR-GDH。

2.重组菌株的转化

按照化转操作流程，将质粒pBAD-HO-BVR-GDH转化至底盘细胞pZG-BW25113中，获得重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113，并以甘油菌菌种形式保存，得甘油管菌种HO-BVR-GDH pZG-BW25113。

实施例3

重组菌株的发酵培养

吸取少量实施例2中的甘油菌种HO-BVR-GDH pZG-BW25113，加入5mL，含100μg/mL氨苄霉素的LB液体试管中，37℃、200rpm过夜活化。

将过夜活化的种子液按1％比例接种到800mL，含100μg/mL氨苄霉素的TB发酵培养基，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀约0.6左右时加入终浓度质量浓度为1％L-阿拉伯糖，30℃、200rpm继续诱导培养8-10h，离心收集细胞，得全细胞催化剂菌体HO-BVR-GDH pZGBW25113。

实施例4

高效全细胞催化生产胆红素

重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113全细胞催化血红素至胆红素

在50mM，pH7.0，10mL的PB缓冲溶液中加入实施例3制备的全细胞催化剂菌体HO-BVR-GDH pZGBW25113 1.0g，加入羟高铁血红素0.01g，加入0.5倍于羟高铁血红素量的葡萄糖(摩尔比)，控制pH在7.0、25℃的条件下反应，HPLC监控反应进程直至全部转变成胆红素。

胆红素的检测分析条件：取上述样品溶液300ul，12000rpm高速离心2min后取上清溶液，用0.22um水相过滤器过滤，使用高效液相色谱仪分析，所用色谱柱为Agilent ZORBAXC18 3.5μm色谱柱，流动相为甲醇：甲酸水溶液(pH 5)＝50：50，流速0.8ml/min，色谱柱温度为35℃，λmax＝435nm。

将上述样品溶液移入分液漏斗中，加入2倍体积的氯仿萃取3次，合并有机相，加入无水Na₂SO₄过夜干燥后旋蒸至恒重，即可得到胆红素产品0.85g。产物摩尔收率为95.1％，纯度为98.3％。

本发明的方法通过构建辅因子循环再生体系，无需额外添加辅因子，进一步降低生产成本；同时具有底物原料充足，生产成本低、反应温和、转化率高、生产效率高等特点，适合胆红素的工业化生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法

<130> IM2022043I

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60

cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120

ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180

gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240

accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300

cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360

cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420

gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480

gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540

aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600

tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660

gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720

ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780

cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840

gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900

tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960

gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020

ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080

aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140

ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200

atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260

tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320

gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380

gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440

acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Val Thr Gln Thr Ala Gln Ala Cys Asp Leu Val Ile Phe Gly

1 5 10 15

Ala Lys Gly Asp Leu Ala Arg Arg Lys Leu Leu Pro Ser Leu Tyr Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Ala Gly Gln Leu Asn Pro Asp Thr Arg Ile Ile Gly Val

35 40 45

Gly Arg Ala Asp Trp Asp Lys Ala Ala Tyr Thr Lys Val Val Arg Glu

50 55 60

Ala Leu Glu Thr Phe Met Lys Glu Thr Ile Asp Glu Gly Leu Trp Asp

65 70 75 80

Thr Leu Ser Ala Arg Leu Asp Phe Cys Asn Leu Asp Val Asn Asp Thr

85 90 95

Ala Ala Phe Ser Arg Leu Gly Ala Met Leu Asp Gln Lys Asn Arg Ile

100 105 110

Thr Ile Asn Tyr Phe Ala Met Pro Pro Ser Thr Phe Gly Ala Ile Cys

115 120 125

Lys Gly Leu Gly Glu Ala Lys Leu Asn Ala Lys Pro Ala Arg Val Val

130 135 140

Met Glu Lys Pro Leu Gly Thr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn

145 150 155 160

Asp Gln Val Gly Glu Tyr Phe Glu Glu Cys Gln Val Tyr Arg Ile Asp

165 170 175

His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Leu Arg Phe

180 185 190

Ala Asn Ser Leu Phe Val Asn Asn Trp Asp Asn Arg Thr Ile Asp His

195 200 205

Val Glu Ile Thr Val Ala Glu Glu Val Gly Ile Glu Gly Arg Trp Gly

210 215 220

Tyr Phe Asp Lys Ala Gly Gln Met Arg Asp Met Ile Gln Asn His Leu

225 230 235 240

Leu Gln Ile Leu Cys Met Ile Ala Met Ser Pro Pro Ser Asp Leu Ser

245 250 255

Ala Asp Ser Ile Arg Asp Glu Lys Val Lys Val Leu Lys Ser Leu Arg

260 265 270

Arg Ile Asp Arg Ser Asn Val Arg Glu Lys Thr Val Arg Gly Gln Tyr

275 280 285

Thr Ala Gly Phe Ala Gln Gly Lys Lys Val Pro Gly Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Glu Gly Ala Asn Lys Ser Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala Ile Arg

305 310 315 320

Val Asp Ile Asp Asn Trp Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg

325 330 335

Thr Gly Lys Arg Leu Pro Thr Lys Cys Ser Glu Val Val Val Tyr Phe

340 345 350

Lys Thr Pro Glu Leu Asn Leu Phe Lys Glu Ser Trp Gln Asp Leu Pro

355 360 365

Gln Asn Lys Leu Thr Ile Arg Leu Gln Pro Asp Glu Gly Val Asp Ile

370 375 380

Gln Val Leu Asn Lys Val Pro Gly Leu Asp His Lys His Asn Leu Gln

385 390 395 400

Ile Thr Lys Leu Asp Leu Ser Tyr Ser Glu Thr Phe Asn Gln Thr His

405 410 415

Leu Ala Asp Ala Tyr Glu Arg Leu Leu Leu Glu Thr Met Arg Gly Ile

420 425 430

Gln Ala Leu Phe Val Arg Arg Asp Glu Val Glu Glu Ala Trp Lys Trp

435 440 445

Val Asp Ser Ile Thr Glu Ala Trp Ala Met Asp Asn Asp Ala Pro Lys

450 455 460

Pro Tyr Gln Ala Gly Thr Trp Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Met Ile

465 470 475 480

Thr Arg Asp Gly Arg Ser Trp Asn Glu Phe Glu

485 490

<210> 3

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccaagc aacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tgggacgcaa ccttgcgctc 60

aacatcgaaa gccgtggtta taccgtctct attttcaacc gttcccgtga gaagacggaa 120

gaagtgattg ccgaaaatcc aggcaagaaa ctggttcctt actatacggt gaaagagttt 180

gtcgaatctc tggaaacgcc tcgtcgcatc ctgttaatgg tgaaagcagg tgcaggcacg 240

gatgctgcta ttgattccct caaaccatat ctcgataaag gagacatcat cattgatggt 300

ggtaacacct tcttccagga cactattcgt cgtaatcgtg agctttcagc agagggcttt 360

aacttcatcg gtaccggtgt ttctggcggt gaagaggggg cgctgaaagg tccttctatt 420

atgcctggtg gccagaaaga agcctatgaa ttggtagcac cgatcctgac caaaatcgcc 480

gccgtagctg aagacggtga accatgcgtt acctatattg gtgccgatgg cgcaggtcac 540

tatgtgaaga tggttcacaa cggtattgaa tacggcgata tgcagctgat tgctgaagcc 600

tattctctgc ttaaaggtgg cctgaacctc accaacgaag aactggcgca gacctttacc 660

gagtggaata acggtgaact gagcagttac ctgatcgaca tcaccaaaga tatcttcacc 720

aaaaaagatg aagacggtaa ctacctggtt gatgtgatcc tggatgaagc ggctaacaaa 780

ggtaccggta aatggaccag ccagagcgcg ctggatctcg gcgaaccgct gtcgctgatt 840

accgagtctg tgtttgcacg ttatatctct tctctgaaag atcagcgtgt tgccgcatct 900

aaagttctct ctggtccgca agcacagcca gcaggcgaca aggctgagtt catcgaaaaa 960

gttcgtcgtg cgctgtatct gggcaaaatc gtttcttacg cccagggctt ctctcagctg 1020

cgtgctgcgt ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc 1080

cgtgctggct gcatcatccg tgcgcagttc ctgcagaaaa tcaccgatgc ttatgccgaa 1140

aatccacaga tcgctaacct gttgctggct ccgtacttca agcaaattgc cgatgactac 1200

cagcaggcgc tgcgtgatgt cgttgcttat gcagtacaga acggtattcc ggttccgacc 1260

ttctccgcag cggttgccta ttacgacagc taccgtgctg ctgttctgcc tgcgaacctg 1320

atccaggcac agcgtgacta ttttggtgcg catacttata agcgtattga taaagaaggt 1380

gtgttccata ccgaatggct ggattaa 1407

<210> 4

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Lys Gln Gln Ile Gly Val Val Gly Met Ala Val Met Gly Arg

1 5 10 15

Asn Leu Ala Leu Asn Ile Glu Ser Arg Gly Tyr Thr Val Ser Ile Phe

20 25 30

Asn Arg Ser Arg Glu Lys Thr Glu Glu Val Ile Ala Glu Asn Pro Gly

35 40 45

Lys Lys Leu Val Pro Tyr Tyr Thr Val Lys Glu Phe Val Glu Ser Leu

50 55 60

Glu Thr Pro Arg Arg Ile Leu Leu Met Val Lys Ala Gly Ala Gly Thr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Asp Ser Leu Lys Pro Tyr Leu Asp Lys Gly Asp Ile

85 90 95

Ile Ile Asp Gly Gly Asn Thr Phe Phe Gln Asp Thr Ile Arg Arg Asn

100 105 110

Arg Glu Leu Ser Ala Glu Gly Phe Asn Phe Ile Gly Thr Gly Val Ser

115 120 125

Gly Gly Glu Glu Gly Ala Leu Lys Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly

130 135 140

Gln Lys Glu Ala Tyr Glu Leu Val Ala Pro Ile Leu Thr Lys Ile Ala

145 150 155 160

Ala Val Ala Glu Asp Gly Glu Pro Cys Val Thr Tyr Ile Gly Ala Asp

165 170 175

Gly Ala Gly His Tyr Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Gly

180 185 190

Asp Met Gln Leu Ile Ala Glu Ala Tyr Ser Leu Leu Lys Gly Gly Leu

195 200 205

Asn Leu Thr Asn Glu Glu Leu Ala Gln Thr Phe Thr Glu Trp Asn Asn

210 215 220

Gly Glu Leu Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Thr Lys Asp Ile Phe Thr

225 230 235 240

Lys Lys Asp Glu Asp Gly Asn Tyr Leu Val Asp Val Ile Leu Asp Glu

245 250 255

Ala Ala Asn Lys Gly Thr Gly Lys Trp Thr Ser Gln Ser Ala Leu Asp

260 265 270

Leu Gly Glu Pro Leu Ser Leu Ile Thr Glu Ser Val Phe Ala Arg Tyr

275 280 285

Ile Ser Ser Leu Lys Asp Gln Arg Val Ala Ala Ser Lys Val Leu Ser

290 295 300

Gly Pro Gln Ala Gln Pro Ala Gly Asp Lys Ala Glu Phe Ile Glu Lys

305 310 315 320

Val Arg Arg Ala Leu Tyr Leu Gly Lys Ile Val Ser Tyr Ala Gln Gly

325 330 335

Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ser Glu Glu Tyr Asn Trp Asp Leu Asn

340 345 350

Tyr Gly Glu Ile Ala Lys Ile Phe Arg Ala Gly Cys Ile Ile Arg Ala

355 360 365

Gln Phe Leu Gln Lys Ile Thr Asp Ala Tyr Ala Glu Asn Pro Gln Ile

370 375 380

Ala Asn Leu Leu Leu Ala Pro Tyr Phe Lys Gln Ile Ala Asp Asp Tyr

385 390 395 400

Gln Gln Ala Leu Arg Asp Val Val Ala Tyr Ala Val Gln Asn Gly Ile

405 410 415

Pro Val Pro Thr Phe Ser Ala Ala Val Ala Tyr Tyr Asp Ser Tyr Arg

420 425 430

Ala Ala Val Leu Pro Ala Asn Leu Ile Gln Ala Gln Arg Asp Tyr Phe

435 440 445

Gly Ala His Thr Tyr Lys Arg Ile Asp Lys Glu Gly Val Phe His Thr

450 455 460

Glu Trp Leu Asp

465

<210> 5

<211> 951

<212> DNA

<213> Hevea brasiliensis

<400> 5

atgtcagcgg aagtggaaac ctcagagggg gtagacgaat cagagaaaaa gaactctggg 60

gccttagaaa aggagaacca aatgagaatg gctgacctct cggagctcct gaaggaaggg 120

accaaggaag cacacgaccg ggcagaaaac acccagtttg tcaaggactt cttgaaaggc 180

aacattaaga aggagctgtt taagctggcc accacggcac tttactttac atactcagcc 240

ctcgaggagg aaatggagcg caacaaggac catccagcct ttgccccctt gtacttcccc 300

atggagctgc accggaagga ggcgttgacc aaggacatgg aatatttctt tggtgaaaac 360

tgggaggagc aggtgcagtg ccccaaggct gccaaaaagt acgtggagcg gatccactac 420

atagggcaga atgagccgga gctactggtg gcccatgcgt acacccgcta catgggggac 480

ctctcggggg gccaggtgct gaagaaggtg gcccagcgag cactgaaact ccccagcaca 540

ggggaaggga cccagttcta cctgtttgag aatgtggaca atgcccagca gttcaagcag 600

ctctaccgag ccaggatgaa cgccctggac ctgaacatga agaccaaaga gaggatcgtg 660

gaggaggcca acaaggcttt tgagtataac atgcagatat tcaatgaact ggaccaggcc 720

ggctccacgc tggccagaga gaccttggag gatgggttcc ctgtacacga tgggaaagga 780

gacatgcgta aatgcccttt ctacgctggt gagcaagaca aaggtgccct ggagggcagc 840

agctgtccct tccgaacagc catggctgtg ctgaggaagc ccagcctcca gttcatcctg 900

gccgctggca tggccctagc tgctggactc ttggcctggt actacatgtg a 951

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> Hevea brasiliensis

<400> 6

Met Ser Ala Glu Val Glu Thr Ser Glu Gly Val Asp Glu Ser Glu Lys

1 5 10 15

Lys Asn Ser Gly Ala Leu Glu Lys Glu Asn Gln Met Arg Met Ala Asp

20 25 30

Leu Ser Glu Leu Leu Lys Glu Gly Thr Lys Glu Ala His Asp Arg Ala

35 40 45

Glu Asn Thr Gln Phe Val Lys Asp Phe Leu Lys Gly Asn Ile Lys Lys

50 55 60

Glu Leu Phe Lys Leu Ala Thr Thr Ala Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Ala

65 70 75 80

Leu Glu Glu Glu Met Glu Arg Asn Lys Asp His Pro Ala Phe Ala Pro

85 90 95

Leu Tyr Phe Pro Met Glu Leu His Arg Lys Glu Ala Leu Thr Lys Asp

100 105 110

Met Glu Tyr Phe Phe Gly Glu Asn Trp Glu Glu Gln Val Gln Cys Pro

115 120 125

Lys Ala Ala Lys Lys Tyr Val Glu Arg Ile His Tyr Ile Gly Gln Asn

130 135 140

Glu Pro Glu Leu Leu Val Ala His Ala Tyr Thr Arg Tyr Met Gly Asp

145 150 155 160

Leu Ser Gly Gly Gln Val Leu Lys Lys Val Ala Gln Arg Ala Leu Lys

165 170 175

Leu Pro Ser Thr Gly Glu Gly Thr Gln Phe Tyr Leu Phe Glu Asn Val

180 185 190

Asp Asn Ala Gln Gln Phe Lys Gln Leu Tyr Arg Ala Arg Met Asn Ala

195 200 205

Leu Asp Leu Asn Met Lys Thr Lys Glu Arg Ile Val Glu Glu Ala Asn

210 215 220

Lys Ala Phe Glu Tyr Asn Met Gln Ile Phe Asn Glu Leu Asp Gln Ala

225 230 235 240

Gly Ser Thr Leu Ala Arg Glu Thr Leu Glu Asp Gly Phe Pro Val His

245 250 255

Asp Gly Lys Gly Asp Met Arg Lys Cys Pro Phe Tyr Ala Gly Glu Gln

260 265 270

Asp Lys Gly Ala Leu Glu Gly Ser Ser Cys Pro Phe Arg Thr Ala Met

275 280 285

Ala Val Leu Arg Lys Pro Ser Leu Gln Phe Ile Leu Ala Ala Gly Met

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ala Trp Tyr Tyr Met

305 310 315

<210> 7

<211> 840

<212> DNA

<213> Epinephelus lanceolatus

<400> 7

atggagacag agaagaagac tcagccaaca gcagagcagc tgactgacat ggatctgtca 60

gagcaaatca aaaaggtgac aaaggatagt cacgtcagag cagaaaacac agaactgatg 120

ctgagcttcc agaggggacg agtctccctg ccgcagtaca agctcctcct gtgctcactg 180

tatgagatct accaggcctt ggaggaagag atggacagga attccgacca ccctggtgtc 240

gcacccattt acttcccagc tgaactggcc agactgaagg ctatcgaaaa agacctggaa 300

tatttctacg gccaggactg gagagagaag attgttgtcc ctgcagcaac taaaagatac 360

tgccacaggc tcagacaaat tggaaaagaa aaccctgaat ttctggttgc ccacgcttac 420

acacggtacc taggtgacct gtctggaggg cagatcctgg gtcgaattgc tcagaagtcc 480

atggggctga agagcggcga gggtctgtcc ttctttgcct tccctggtgt gtccagcccc 540

aacctgttca aacagctgta tcgcagccgc atgaacagca tcgagttgac ggaggaggag 600

aggaacggcg tgttggagga ggctgtcaga gcctttgagt ttaacattca ggtctttgac 660

gatttgcaga cattgctgag tgtcaccgaa aaccagccac agacctgttt gacacgctcc 720

acaccagtga agacactcca gatgcccgaa gccatcttta aaactgtccc actgctcagg 780

atggtgctag gactttttgt ggttctggcc acagtcagcg taggagcctt tgctttttaa 840

<210> 8

<211> 279

<212> PRT

<213> Epinephelus lanceolatus

<400> 8

Met Glu Thr Glu Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ala Glu Gln Leu Thr Asp

1 5 10 15

Met Asp Leu Ser Glu Gln Ile Lys Lys Val Thr Lys Asp Ser His Val

20 25 30

Arg Ala Glu Asn Thr Glu Leu Met Leu Ser Phe Gln Arg Gly Arg Val

35 40 45

Ser Leu Pro Gln Tyr Lys Leu Leu Leu Cys Ser Leu Tyr Glu Ile Tyr

50 55 60

Gln Ala Leu Glu Glu Glu Met Asp Arg Asn Ser Asp His Pro Gly Val

65 70 75 80

Ala Pro Ile Tyr Phe Pro Ala Glu Leu Ala Arg Leu Lys Ala Ile Glu

85 90 95

Lys Asp Leu Glu Tyr Phe Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Glu Lys Ile Val

100 105 110

Val Pro Ala Ala Thr Lys Arg Tyr Cys His Arg Leu Arg Gln Ile Gly

115 120 125

Lys Glu Asn Pro Glu Phe Leu Val Ala His Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu

130 135 140

Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Ile Leu Gly Arg Ile Ala Gln Lys Ser

145 150 155 160

Met Gly Leu Lys Ser Gly Glu Gly Leu Ser Phe Phe Ala Phe Pro Gly

165 170 175

Val Ser Ser Pro Asn Leu Phe Lys Gln Leu Tyr Arg Ser Arg Met Asn

180 185 190

Ser Ile Glu Leu Thr Glu Glu Glu Arg Asn Gly Val Leu Glu Glu Ala

195 200 205

Val Arg Ala Phe Glu Phe Asn Ile Gln Val Phe Asp Asp Leu Gln Thr

210 215 220

Leu Leu Ser Val Thr Glu Asn Gln Pro Gln Thr Cys Leu Thr Arg Ser

225 230 235 240

Thr Pro Val Lys Thr Leu Gln Met Pro Glu Ala Ile Phe Lys Thr Val

245 250 255

Pro Leu Leu Arg Met Val Leu Gly Leu Phe Val Val Leu Ala Thr Val

260 265 270

Ser Val Gly Ala Phe Ala Phe

275

<210> 9

<211> 786

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 9

atgtatacag atttaaaaga taaagtagtt gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60

cgcgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120

aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180

atcgttcaag gcgacgtaac aaaagaagaa gatgttgtaa accttgttca aacagctatt 240

aaagaattcg gtacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300

tctcatgagt tatctttaga caactggaat aaagtaatcg atacaaactt aacgggcgca 360

tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatat tttgttgaaa acgacattaa aggaaacgtt 420

attaacatgt ctagtgttca tgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480

agtaaaggcg gtatgaaact aatgacgaaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540

atccgcgtaa ataacattgg accaggtgcg atgaacacac caattaacgc agagaaattt 600

gcagatcctg tacaacgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggtta catcggtaaa 660

ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720

ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgctgtacc cttctttcca agcaggaaga 780

ggctaa 786

<210> 10

<211> 261

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 10

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Glu Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala

35 40 45

Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Met Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu Val

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 11

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaacgc ccatctggtg 60

gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120

ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180

ggacgagaat ttgtctgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240

cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300

cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac gggtttcttt 360

cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420

gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480

ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540

gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600

gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660

attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgcattagtc aggcgaagct gcttttgagc 720

actacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780

ttctcgcgag tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagtttcg tgccggttgt 840

gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

<210> 12

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttct tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720

gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140

ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

<210> 13

<211> 549

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Lys Asn Ile Asn Pro Thr Gln Thr Ala Ala Trp Gln Ala Leu Gln

1 5 10 15

Lys His Phe Asp Glu Met Lys Asp Val Thr Ile Ala Asp Leu Phe Ala

20 25 30

Lys Asp Gly Asp Arg Phe Ser Lys Phe Ser Ala Thr Phe Asp Asp Gln

35 40 45

Met Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Arg Ile Thr Glu Glu Thr Leu Ala

50 55 60

Lys Leu Gln Asp Leu Ala Lys Glu Cys Asp Leu Ala Gly Ala Ile Lys

65 70 75 80

Ser Met Phe Ser Gly Glu Lys Ile Asn Arg Thr Glu Asn Arg Ala Val

85 90 95

Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu Val Asp

100 105 110

Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Ala Val Leu Glu Lys Met Lys

115 120 125

Thr Phe Ser Glu Ala Ile Ile Ser Gly Glu Trp Lys Gly Tyr Thr Gly

130 135 140

Lys Ala Ile Thr Asp Val Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu

145 150 155 160

Gly Pro Tyr Met Val Thr Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Lys Asn His Leu

165 170 175

Asn Met His Phe Val Ser Asn Val Asp Gly Thr His Ile Ala Glu Val

180 185 190

Leu Lys Lys Val Asn Pro Glu Thr Thr Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys

195 200 205

Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Met Thr Asn Ala His Ser Ala Arg Asp

210 215 220

Trp Phe Leu Lys Ala Ala Gly Asp Glu Lys His Val Ala Lys His Phe

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ser Thr Asn Ala Lys Ala Val Gly Glu Phe Gly Ile Asp

245 250 255

Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser

260 265 270

Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Ile Gly Phe Asp

275 280 285

Asn Phe Val Glu Leu Leu Ser Gly Ala His Ala Met Asp Lys His Phe

290 295 300

Ser Thr Thr Pro Ala Glu Lys Asn Leu Pro Val Leu Leu Ala Leu Ile

305 310 315 320

Gly Ile Trp Tyr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Glu Thr Glu Ala Ile Leu

325 330 335

Pro Tyr Asp Gln Tyr Met His Arg Phe Ala Ala Tyr Phe Gln Gln Gly

340 345 350

Asn Met Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Val Asp Arg Asn Gly Asn Val Val

355 360 365

Asp Tyr Gln Thr Gly Pro Ile Ile Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly

370 375 380

Gln His Ala Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly Thr Lys Met Val Pro

385 390 395 400

Cys Asp Phe Ile Ala Pro Ala Ile Thr His Asn Pro Leu Ser Asp His

405 410 415

His Gln Lys Leu Leu Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Glu Ala Leu Ala

420 425 430

Phe Gly Lys Ser Arg Glu Val Val Glu Gln Glu Tyr Arg Asp Gln Gly

435 440 445

Lys Asp Pro Ala Thr Leu Asp Tyr Val Val Pro Phe Lys Val Phe Glu

450 455 460

Gly Asn Arg Pro Thr Asn Ser Ile Leu Leu Arg Glu Ile Thr Pro Phe

465 470 475 480

Ser Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Lys Ile Phe Thr Gln

485 490 495

Gly Val Ile Leu Asn Ile Phe Thr Phe Asp Gln Trp Gly Val Glu Leu

500 505 510

Gly Lys Gln Leu Ala Asn Arg Ile Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Lys

515 520 525

Glu Ile Ser Ser His Asp Ser Ser Thr Asn Gly Leu Ile Asn Arg Tyr

530 535 540

Lys Ala Trp Arg Gly

545

Claims

1.重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113，其特征在于，所述重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113是将质粒pBAD-HO-BVR-GDH转化至底盘细胞pZG-BW25113中获得；

所述质粒pBAD-HO-BVR-GDH是用T4 DNA连接酶连接HO基因片段、BVR基因片段、GDH基因片段和pBAD线性载体后获得；所述HO基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述BVR基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GDH基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述底盘细胞pZG-BW25113是由大肠杆菌BW25113菌株敲除pgi基因、在zwf基因前插入araC启动子基因和在gndA基因前插入araC启动子基因获得；所述pgi基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述zwf基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述gndA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述araC启动子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

权利要求1所述重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113在葡萄糖和PB缓冲溶液中催化羟高铁血红素变成胆红素。

3.依据权利要求2所述全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，所述重组菌株HO-BVR-GDH pZG-BW25113与羟高铁血红素加入量的质量比为100:1。

4.依据权利要求2所述全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，所述加入葡萄糖与羟高铁血红素的物质量比为1:2。

5.依据权利要求2所述全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，所述PB缓冲溶液为50mM。

6.依据权利要求2所述全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，所述催化的反应条件为：pH为7.0。

7.依据权利要求2所述全细胞催化生产胆红素的方法，其特征在于，所述催化的反应条件为：温度为25℃。