CN105602913B - 重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用 - Google Patents

重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组羰基还原酶突变体ReCR‑Mut、编码基因、工程菌及其应用，所述突变体ReCR‑Mut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第54位酪氨酸突变为苯丙氨酸获得的；与野生型ReCR相比，突变体ReCR‑Mut具有更高的酶活力和催化效率；突变体ReCR‑Mut还原N‑Boc‑3‑哌啶酮的比酶活力是野生型ReCR的1.42倍，突变体ReCR‑Mut对N‑Boc‑3‑哌啶酮的kcat/Km值是野生型的1.37倍；利用突变体ReCR‑Mut为生物催化剂，以仲辛醇为辅底物和有机相，利用NAD+为辅酶高效不对称合成光学纯(S)‑N‑Boc‑3‑哌啶醇；在优选两相体系中，300g/L N‑Boc‑3‑哌啶酮经整细胞法催化其不对称还原反应12小时，产物(S)‑N‑Boc‑3‑哌啶醇的产物e.e.值>99％，得率为93.9％；与野生型羰基还原酶ReCR作为生物催化剂相比，产物得率提高了11.9％。

Description

重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，尤其涉及一种重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut及其在两相体系中生物酶法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的应用。
(二)背景技术
(S)-N-Boc-3-哌啶醇是一种重要的手性含氮饱和杂环醇，具有活泼的官能团“-OH”和“-NH-”，是合成多种生物活性物质的重要手性切块。高抗疟疾活性的天然药物常山碱和异常山碱、神经激肽受体的拮抗剂L-733,060，以及周期素依赖性激酶的抑制剂夫拉平度都含有(S)-3-哌啶醇结构。此外，(S)-N-Boc-3-哌啶醇还是合成套细胞淋巴癌治疗新药依鲁替尼的中间体。(S)-N-Boc-3-哌啶醇的制备方法包括化学法和生物法，其中生物法因反应条件温和、绿色、高效、立体选择性高等优点而备受关注。目前所知的生物法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的制备方法是通过羰基还原酶(或酮还原酶)对前手性底物N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原而获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇。生物酶法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的工业化应用，要求适用高浓度的底物，而高浓度的底物和辅底物以及生成的高浓度产物均会抑制酶活力，从而降低催化效率。因此，获得一种能够不对称还原高浓度底物的羰基还原酶是生物酶法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇实现工业化应用的关键所在。
具有优秀催化性能的羰基还原酶的获得可通过野生酶的大规模筛选以及酶的定向进化与改造。相比于野生酶的筛选，基于结构信息对酶进行定向进化和理性设计可克服天然酶的先天不足，理性高效地改善酶的催化性能，极大地降低了筛选工作量。羰基还原酶的分子改造目前已有许多成功的例子。日本学者Itosh等人的研究团队对红球菌ST-10的苯乙醛还原酶PAR进行改造实现了高浓度异丙醇下的生物催化。PAR的突变株HAR1以20％异丙醇为辅底物，还原32.5％的N-Boc-3-吡咯烷酮为(S)-N-Boc-3-吡咯烷醇，得率94％，产物e.e.值大于99％。德国学者Manfred T.Reetz最近报道了基于结构导向的三联体的饱和突变成功改变了酶的立体选择性，所采用的策略有效地缩减了筛选规模，提高了改造效率。
(三)发明内容
本发明目的是利用一种高酶活力、高立体选择性、高底物耐受性的羰基还原酶突变体为生物催化剂，在两相催化体系中实现生物酶法不对称还原高浓度N-Boc-3-哌啶酮合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种羰基还原酶突变体ReCR-Mut，所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第54位酪氨酸突变为苯丙氨酸获得的，所述突变体ReCR-Mut的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种所述重组羰基还原酶ReCR-Mut编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
所述的重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因由如下方法得到：设计引物F1(5’-TACACCTTCGGCCTTCCTCTCACGC-3’)和引物R1(5’-AAGGCCGAAGGTGTACTGCTCCTCG-3’)，利用反向PCR技术，以质粒pEASY-E2-recr(recr基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，对应羰基还原酶ReCR的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)为模板，克隆出全质粒，将突变质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)。对突变后的质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为1047bp的开放阅读框，第54位氨基酸成功由酪氨酸变为苯丙氨酸(突变体ReCR-Mut的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)。
本发明还涉及一种含所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut基因的载体及所述载体构建的重组基因工程菌。优选所述的突变体ReCR-Mut的获得及重组基因工程菌的构建包括如下步骤：以质粒pEASY-E2-recr为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向PCR扩增全质粒，得到的PCR产物经DpnⅠ酶消化甲基化的模板，酶切产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可得到所述含重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut基因的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut，其中含重组羰基还原酶突变体编码基因的质粒命名为pEASY-E2-recr-mut。
此外，本发明还提供一种所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut在生物酶法制备(S)-N-Boc-3-哌啶醇的中的应用，所述应用为：以含重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-Boc-3-哌啶酮为底物，以仲辛醇为辅助底物，以NAD+为辅酶，以pH 8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35℃、300rpm条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化，获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇；所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为240g/L，所述底物终浓度为300g/L，辅酶终浓度为1.2mM，仲辛醇体积终浓度为60％(v/v)。
进一步，本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因的工程菌(E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut)接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.3mM的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述立体选择性专一的重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut与野生型羰基还原酶ReCR相比，具有更高的酶活力和催化效率；突变体ReCR-Mut还原N-Boc-3-哌啶酮的比酶活力是野生型ReCR的1.42倍，突变体ReCR-Mut对N-Boc-3-哌啶酮的kcat/Km值是野生型的1.37倍。利用突变体ReCR-Mut为生物催化剂，以仲辛醇为辅底物和有机相，利用NAD+为辅酶高效不对称合成光学纯(S)-N-Boc-3-哌啶醇(图1)。在优选两相体系中，300g/L N-Boc-3-哌啶酮经整细胞法催化其不对称还原反应12h，产物(S)-N-Boc-3-哌啶醇的产物e.e.值>99％，得率为93.9％；与野生型羰基还原酶ReCR作为生物催化剂相比，产物得率提高了11.9％。
(四)附图说明
图1为两相体系中生物酶法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇原理图。
图2为羰基还原酶ReCR编码基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M为marker；1为羰基还原酶ReCR编码基因。
图3为质粒pEASY-E2-recr经反向PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M为marker；1为质粒反向PCR产物。
图4为分离纯化后羰基还原酶ReCR的SDS-PAGE图；M为marker；1为分离纯化后的羰基还原酶ReCR。
图5为分离纯化后羰基还原酶突变体ReCR-Mut的SDS-PAGE图；M为marker；1为分离纯化后的羰基还原酶突变体ReCR-Mut。
图6为不对称合成中底物和产物的气相色谱图；A，N-Boc-3-哌啶酮标样；B，(S)-N-Boc-3-哌啶醇标样；C，(R)-N-Boc-3-哌啶醇标样；D，不对称还原反应后的底物和产物。
图7为突变体ReCR-Mut和野生型ReCR催化高浓度底物的反应进程。
(五)具体实施方式
本发明实施例所述重组羰基还原酶ReCR编码基因源自红串红球菌WZ010(Rhodococcus erythropolis WZ010)。红串红球菌WZ010保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M2011336，保藏日期：2011年9月29日，已在先前申请专利(申请号：201110364085.8)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：重组表达质粒pEASY-E2-recr与基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr的构建
以红串红球菌WZ010菌株中的基因组DNA为模板，利用设计的引物F1和R1进行PCR扩增，扩增体系见表1所示。
表1 PCR扩增反应体系
引物如下：F1，5’-ATGAAGGCAATCCAGTACAC-3’；R1，5’-CTACAGACCAGGGACCACA-3’。PCR反应进程为：94℃预变性5min；之后，以94℃变性30s，55℃复性30s，72℃保持1min为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持10min。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，从图2中可看到约1000bp处有明亮的条带，条带与理论值1047bp相符。
将PCR产物片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.2所示)与pEASY-E2载体进行TA克隆，连接产物转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，转化后的细胞涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃培养箱过夜培养。LB固体培养基上形成的菌落经菌落PCR验证后接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，离心收集菌体，提取质粒，得到重组表达质粒pEASY-E2-recr。重组表达质粒pEASY-E2-recr转化入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，得到大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pEASY-E2-recr。
将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.3mM的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液收集湿菌体，作为整细胞催化的催化剂。
实施例2：重组表达质粒pEASY-E2-recr-mut与基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut的构建
以质粒pEASY-E2-recr为模板，设计引物F2和引物R2，反向PCR扩增出突变质粒，扩增体系见表2所示。
表2 PCR扩增反应体系
引物如下：F2，5’-TACACCTTCGGCCTTCCTCTCACGC-3’；R2，5’-AAGGCCGAAGGTGTACTGCTCCTCG-3’。PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20s，68℃复性20s，72℃保持3min为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持10min。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，从图3中可看到约6000bp处有明亮的条带，条带与质粒的理论值相符。
PCR产物经37℃下酶切2h去除甲基化的模板，酶切体系如表3所示。
表3 PCR产物中甲基化模板的消化体系
酶切后的PCR产物(质粒所携带的突变体基因recr-mut的核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，突变体基因所编码的ReCR-Mut的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，直接转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut。转化子经菌落PCR验证后接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，离心收集菌体，提取质粒，送去测序。测序结果经软件分析氨基酸序列，54位由酪氨酸成功变为苯丙氨酸，则突变成功。
实施例3：重组羰基还原酶ReCR及其突变体ReCR-Mut的诱导表达及分离纯化
将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr和E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut分别接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.3mM的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液收集湿菌体，作为整细胞催化的催化剂。
将上述湿菌体按1g湿菌体加15mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的比例加入适量Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，在500W下超声破碎20min(工作2s，间歇6s)后，破碎液于4℃和10000rpm下离心10min，重复离心三次后得到上清粗酶液。
按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取上清粗酶液上样至预平衡Ni2+柱中，再依次用含10mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的缓冲液(相应浓度的咪唑和300mM的氯化钠溶解在50mM的Tris-HCl缓冲液中，pH8.0)洗脱杂蛋白和目的蛋白。目的蛋白经含有100mM咪唑的缓冲液洗脱后，用50mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液通过超滤浓缩脱盐，所得的脱盐酶液，即为重组羰基还原酶ReCR或突变体ReCR-Mut酶液，存于-20℃备用。
重组羰基还原酶ReCR及其突变体ReCR-Mut酶液的纯度经SDS-PAGE凝胶电泳验证，SDS-PAGE电泳结果分别如图4和图5所示。重组羰基还原酶ReCR及其突变体ReCR-Mut经SDS-PAGE电泳后均为单一条带，表明分离纯化后的重组羰基还原酶ReCR及其突变体ReCR-Mut均为电泳纯。重组羰基还原酶ReCR及其突变体ReCR-Mut的亚基理论大小分别为36.27kDa和36.16kDa，而在SDS-PAGE电泳上的表观大小均约为41.69kDa。
实施例4：重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut与野生型羰基还原酶ReCR的比酶活力和酶动力学参数比较
酶活力测定采用分光光度计法，测定340nm处的吸光值变化，醇氧化反应和酮还原反应的测定条件分别为50℃、pH10.0和60℃、pH6.0。标准还原活力测定体系(2.5mL)：50mMPIPES缓冲液(pH 6.0)，10mM底物酮，0.4mM NADH，实施例2获得的酶液2μg/mL。标准氧化活力测定体系(2.5mL)：50mM CAPSO缓冲液(pH 10.0)，50mM底物醇，0.4mM NAD+，实施例2获得的酶液2μg/mL。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟消耗或生成1μmol NADH所需要的酶量为一个酶活单位，U。所有样品的蛋白浓度测定用Bradford方法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白曲线。
表4结果表明，与野生型ReCR相比，突变体ReCR-Mut的氧化活力和还原活力均有所提高。当以N-Boc-3-哌啶酮为底物时，突变体ReCR-Mut的还原活力为121.7U/mg，是野生型的1.42倍。当以仲辛醇为底物时，突变体ReCR-Mut的氧化活力为112.68U/mg，是野生型的1.28倍。
表4突变体ReCR-Mut和野生型ReCR的比酶活力比较
酶动力学常数在不同的底物及辅酶(NAD+或者NADH)浓度下测定。当辅酶浓度固定时，测定不同底物浓度下酶活力。其中底物与辅酶的浓度选取如下：还原反应：N-Boc-3-哌啶酮(0～20mM)，仲辛酮(0～30mM)；氧化反应：仲辛醇(0～20mM)。底物和酶活力作双倒数曲线，通过米氏方程计算表观Km、Vmax、kcat和kcat/Km等酶动力学参数。
kcat/Km是重要的酶动力学参数，该数值越高，表明其催化效率越高。表5结果表明，突变体ReCR-Mut对N-Boc-3-哌啶酮的kcat/Km值为49.25s-1/mM，是野生型的1.37倍。在醇氧化反应中，突变体ReCR-Mut对仲辛醇的kcat/Km值为56.54s-1/mM，是野生型ReCR的4.33倍。需要说明的是，突变体ReCR-Mut及野生型ReCR酶均不能氧化(S)-N-Boc-3-哌啶醇，因而没有相关的酶动力学常数。
比酶活力和酶动力学常数结果均表明，突变体ReCR-Mut的催化性能显著地优于野生型ReCR。
表5突变体ReCR-Mut及野生型ReCR酶动力学常数的比较
实施例5：大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut和E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr的整细胞催化表现比较
以实施例2中经IPTG诱导的湿菌体作为催化剂，240g/L湿菌体、300g/L N-Boc-3-哌啶酮，1.2mM NAD+和60％(v/v)的仲辛醇与pH8.0Tris-HCl缓冲液构成5mL反应体系。对照以未突变的原始菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr经IPTG诱导的湿菌体作为催化剂(实施例1方法制备)，体系同上。在35℃和300rpm的条件下反应12h，每隔2h取样，加等体积的乙酸乙酯萃取2h，离心取上层有机相除水后，样品用GC检测产物，并计算得率。气相色谱检测检测条件为：色谱柱，BGB174，30.0m×250μm×0.25μm；检测器FID，250℃；载气，N2；载气流量，2.0mL/min；分流比，1:49；柱温程序为初始温度100℃，5℃/min升至125℃保持3min，然后2℃/min升至140℃保持8min，1℃/min升至150℃。进样量，1μL；进口温度，250℃。如图6中A所示，底物N-Boc-3哌啶酮的保留时间为26.997min。如图6中B和4中C所示，(S)-N-Boc-3-哌啶醇和(R)-N-Boc-3-哌啶醇的保留时间分别为28.452min和28.739min。如图6中D所示，N-Boc-3-哌啶酮的还原产物只有(S)-N-Boc-3-哌啶醇，产物e.e.值均>99％，表明大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut和E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-rec催化N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原均具有专一的立体选择性。
分别以诱导表达后的大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut和E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-rec作为整细胞催化剂，催化结果如图7所示。当还原反应进行6h后，大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut所催化反应的产物得率高达91.4％，而对照菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-rec所催化反应的产物得率仅为82.5％，产物得率提高了10.8％；当还原反应进行12h后，大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut所催化反应的产物得率高达93.9％，而对照菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-rec所催化反应的产物得率为83.9％，产物得率提高了11.9％。整细胞催化结果表明，当诱导表达了ReCR-Mut的大肠工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr-mut催化高浓度N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原时，其催化表现显著地优于诱导表达了ReCR的对照菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr。

Claims (6)

1.一种重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut，其特征在于所述突变体ReCR-Mut是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列中第54位酪氨酸突变为苯丙氨酸获得的。
2.一种权利要求1所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
3.一种含权利要求2所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut在生物酶法制备(S)-N-Boc-3-哌啶醇的中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以N-Boc-3-哌啶酮为底物，以仲辛醇为辅助底物及有机相，以NAD+为辅酶，以pH8.0的缓冲液为反应介质构成两相反应体系，在35℃、300rpm条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化，获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇；所述反应体系中催化剂用量以湿菌体重量计为240g/L，所述底物终浓度为300g/L，辅酶终浓度为1.2mM，仲辛醇体积终浓度为60％。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut编码基因的工程菌接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.3mM的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
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