CN103013898B - 一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体，所述重组载体由原始载体及接入原始载体的目的基因构成，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)Rosetta(DE3)，所述的目的基因为羰基还原酶基因，碱基序列如SEQ IDNO.1所示。本发明重组工程菌羰基还原酶表达水平较高，利用诱导培养的菌体细胞将氮，氮-二甲基-3-氧基-3-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐转化为(S)-氮，氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺；或将4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，两种产物的光学纯度及转化率均较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组工程菌株，尤其涉及一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用。
背景技术
度洛西汀(duloxetine)，化学名为(+)-(S)-N-甲-γ-基-(1-萘氧基)-2-噻吩基盐酸，是欣百达(cymbalta)的有效成分。它是一种5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)再摄取的双重抑制药，通过增加突触间隙中5-羟色胺和去甲肾上腺素水平来治疗抑郁症，并通过阻断通往脑的疼痛信号来治疗神经病理性疼痛。该药2004年8月3日获美国食品药品监督管理局批准在美国上市以治疗重症抑郁，同年9月3日又被批准用于治疗糖尿病性周围神经疼痛(DPN)。目前已成为3-芳氧基-3-芳基丙胺类抗抑郁药物的最优秀的代表，每年的销售额近达35亿美元。(S)-氮，氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺((S)-DHTP)是合成度洛西汀重要手性中间体(见图1)，具有重要的应用价值。
4-氯-3-羟基丁酸乙酯中含有性质活泼的氯原子，使之在一些不对称合成中得到广泛应用，成为许多手性药物的重要手性中间体。例如，通过不对称还原，可以由4-氯-3-羟基丁酸乙酯得到（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，后者是合成Slagenins B和C，以及HMG-CoA还原酶抑制剂的关键手性中间体，在医药工业中也具有重要的用途。
制备(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺和（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法主要包括化学合成法和生物合成法两大类。化学合成度洛西汀中间体的方法主要是利用化学催化剂四氢铝锂(LiAlH4)或硼化氢(BH3)催化前手性酮化合物氮，氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐不对称还原为氮,氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺，再利用化学拆分剂如(S)-扁桃酸拆分消旋体醇。化学合成S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法是以铑、钌等价格昂贵的金属作为催化剂、以氢气作为还原剂进行的。这些化学还原方法不仅产率和产物光学纯度低，而且还存在反应安全性差、成本高、副反应多以及环境污染严重等缺点。
生物合成法是利用生物体内的羰基还原酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)作为催化剂，将潜手性酮化合物直接还原成手性醇。生物合成法包括酶催化和全细胞催化法两大类，由于游离酶催化的氧化还原反应需要价格昂贵的辅酶(NADPH或者NADH)，而微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、必需的辅酶和再生途径，只需加入少量廉价的共底物(如蔗糖或葡萄糖)，因此后者更加方便实用。
细胞催化法制备手性药物关键中间体的关键是要获得高活力(羰基还原酶活力)的微生物菌株。但目前，利用野生菌株生物催化存在的一个问题是获得羰基还原酶活力并不高，而且培养周期长。此外，由于野生菌体自身酶种类繁多，所获的产物中常常还有菌体中其他酶类作用所产生的副产物，需要对产物进行复杂的分离纯化才能得到合乎质量要求的产品，导致生产成本增加。
发明内容
本发明提供了一种表达羰基还原酶的重组工程菌，以解决野生菌株羰基还原酶表达水平和表达酶活不足的问题。
一种表达羰基还原酶的重组工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体，所述重组载体由原始载体及插入原始载体的目的基因构成，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)，所述目的基因为羰基还原酶基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述原始载体为pET-28a(+)。
本发明还提供了所述重组工程菌在生产手性药物中间体中的应用，所述手性药物中间体为(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
具体包括以下步骤：
(1)将所述重组工程菌接入培养基，诱导培养后收集菌体细胞；
(2)将菌体细胞悬浮于pH6~7的缓冲液中，加入原料和共底物，反应完成后，分离纯化得到度洛西汀中间体；
所述培养基为LB培养基；诱导剂选用IPTG或乳糖，IPTG浓度为0.1~1mmol/L，更优选为0.3mmol/L，若诱导剂为乳糖，所述乳糖浓度为1.5~3.0/L，更优选为2.0g/L；诱导培养的温度为25~37℃，优选为32℃；诱导培养的时间为10~15h。
所述原料为氮,氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺或其盐酸盐、4-氯乙酰乙酸乙酯。
所述共底物为葡萄糖或蔗糖，葡萄糖的添加不仅有利于产物产率的提高，还能够影响反应的立体选择性。
菌体细胞的浓度影响反应体系中的酶量，一般的，所述干菌体细胞的浓度为2~10g/L，更优选为4g/L。
另外，原料、共底物的浓度也影响反应速度及最终产物的产率。一般的，所述原料的浓度为2~5g/L；所述共底物的浓度为5～12g/L，更优选为10g/L。
适宜的温度有利于反应的进行，所述反应的温度为30~35℃，若温度过高，则容易导致反应过程中羰基还原酶的失活。
所述反应的时间为24~48h。时间过短，反应未进行完全，产物的产率低，而时间过长，此时反应体系内的原料、共底物等已消耗完全，已经没有继续反应的必要。
反应结束后，要对反应液进行分离纯化，以得到手性药物中间体，所述分离纯化方法为：先用萃取剂对反应液进行萃取，然后对萃取液进行旋蒸处理。
本发明重组工程菌羰基还原酶表达水平较高，利用诱导培养的菌体细胞将氮，氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐或4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(S)-氮，氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，产物光学纯度及转化率均较高。
本发明工程菌表达的羰基还原酶可以以NADPH或者NADH作为辅酶，但依赖NADPH作辅酶时活性更高。羰基还原酶最适反应温度是40℃，反应最适pH为8，金属离子Ca2+对酶反应具有促进作用，且Ca2+浓度为0.5mmol/L时作用效果最好。
附图说明
图1为度洛西汀关键中间体的结构式通式；
其中，常见的R基可以有以下几种，括号里面是根据R基不同，度洛西汀关键中间体的命名也不相同，
R1=-CH2N(CH3)2(DHTP)，R2=-COOCH2CH3(HEES)，
R3=-CH2Cl(CTPO)，R4=-CONHCH3(MHTPA)，R5=-CN(HTPN)；
图2为重组工程菌生物合成(S)-DHTP的反相HPLC图；
图3为重组工程菌生物合成(S)-DHTP的正相HPLC图；
图4为重组工程菌生物合成(S)-CHBE的GC图；
图5为重组工程菌生物合成(S)-CHBE的正相HPLC图。
具体实施方式
一、菌株及培养基
(1)菌株
马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC2.1977可以购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
大肠杆菌DH5α为商业化产品，大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞购自百泰克生物公司。
(2)培养基
PYD固体培养基：葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨20g，琼脂15g，加水至1000mL，pH自然。
PYD液体培养基：葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨20g，加水至1000mL，pH自然。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂15g，加水至1000mL，pH7.0。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水至1000mL，pH7.0。
二、目的基因的克隆
挑取马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)CGMCC2.1977保藏菌株在琼脂斜面培养基28℃活化48h，然后接种于30mLPYD液体培养基，在容积为250mL的锥形瓶中于28℃下200r/min振荡培养48h，取5mL菌液于10000r/min离心一分钟后弃去上清液，采用上海生工所产酵母基因组提取试剂盒，按说明书提取基因组。经电泳验证，提取产物为单一条带，大小与基因组大小相当，无RNA污染。
搜索GenBank数据库中已有的马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)羰基还原酶基因序列进行Blast比对，仅在土壤杆菌中找到一小段序列相近片段。以genbank马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)羰基还原酶基因序列为模板，用引物设计软件DNAMAN6.0设计了一对简并引物：
上游引物1：5’-cggggatccatgacatttacagtggtgac-3’
下游引物2：5’-cgggaattcttacccacggtacgcgcccac-3’
其中，上游引物中的“ggatcc”为限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切位点，下游引物中的“gaattc”为限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切位点。
用上游引物1和与下游引物2配对，选择和优化模板/Taq酶/引物比例，退火温度，循环次数，以靶基因组马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)CGMCC2.1977为模板进行PCR，以得到扩增片段大小合适、丰度适度和非特异条带少的PCR结果。
经过优选上、下游简并引物配对和模板/Tag/引物比例，退火温度，循环次数，最终得到了一个长度约为1038bp的DNA条带。
所确定的PCR体系组成为(单位：μL)：超纯水，38.5；Taq buffer，5；上游简并引物，0.1；下游简并引物，0.1；dNTP，4；模板，1；Taq酶，0.5；反应总体积为50。
所用PCR条件为：94℃变性4min后进入扩增循环，即94℃变性1min，52℃退火40s，72℃延伸4min，共循环30次，最后在72℃延伸10min。所得PCR产物经凝胶电泳检验，所得产物条带单一、清晰、明亮，大小在1000~1500bp之间且接近1000bp。
克隆产物送上海生工进行测序，发现其与genbank马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)羰基还原酶基因(AB183149)同源性100%(SEQ ID NO.1)，证实其为目的产物为羰基还原酶基因。
三、目的基因原核表达载体的构建
为了提高目的基因的双酶切效率，先将目的基因与pMD19-T Vector按照pMD19-T Vector使用说明书进行连接，连接产物转化到(E.coli)DH5α感受态细胞中，蓝白斑筛选得阳性克隆，再对阳性克隆菌株培养12h提取质粒。由于在克隆目的基因时，已经在引物的两端分别引入了BamHⅠ和EcoRⅠ限制性核酸内切酶的酶切位点，所以在构建表达载体时，只要选择需要的质粒，采用BamHⅠ和EcoRⅠ对插有目的基因的pMD19-T Vector和载体质粒分别进行双酶切，然后按照常规的双酶切连接方法连接目的基因和载体质粒，即可得到可用于表达的载体。具体而言，在本实施例，采用了pET-28a(+)作为载体质粒，按照表1所述双酶切条件对目的基因和pET-28(+)分别进行双酶切。
表1双酶切反应条件
注：酶切温度为37℃。
质粒pET-28a(+)和插有目的基因的pMD19-T Vector分别酶切1h，分别对酶切产物进行电泳纯化和切胶回收，电泳验证回收产物并估算载体和待插入片段的浓度，然后按表2所示条件进行连接反应。
表2连接反应体系组成
注：连接温度为4℃，连接16小时。
按表1条件分别对质粒pET-28a(+)和插有目的基因的pMD19-T Vector进行双酶切，所得产物进行凝胶电泳分离，并分别切胶回收、纯化载体和目的基因片段，所得产物取样进行凝胶电泳验证。然后按照表2所列条件进行连接，连接反应结束后80℃保温5min灭活连接酶，取5μL连接产物转化到50μL大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞。
连接产物按热转化法转化到按照上海生工公司高效感受态制备试剂盒的说明书制备的大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化好的(E.coli)Rosetta(DE3)细胞涂布于含有终浓度为30μg/mL卡那霉素和28μg/mL的氯霉素的LB固体培养基，37℃培养16小时后分别挑出阳性克隆，在含有与LB固体培养基相同浓度抗生素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒后进行BamH I和EcoR I双酶切、PCR验证。
结果发现，从表2连接条件对应的连接产物转化子中得到了含有目的条带的质粒，说明成功地实现了目的片段与载体质粒的连接，构建了表达羰基还原酶基因的质粒pET-28a(+)-adh。取重组菌的质粒送上海生工采用T7通用引物测序，测序结果与马克斯克鲁维酵母的羰基还原酶基因的序列一致性为100%，说明目的基因插入载体方向正确，没有碱基缺失等问题，成功构建了重组表达载体。
四、羰基还原酶在大肠杆菌工程菌中的表达
挑取含重组表达载体的重组工程菌在含有终浓度为30μg/mL卡那霉素和28μg/mL的氯霉素的LB固体培养基平板上于37℃活化10小时，然后挑取单菌落接种15mL含有30μg/mL卡那霉素和28μg/mL的LB液体培养基，在37℃、200r/min摇床培养过夜后按1％的接种量接种于50mL含有30μg/mL卡那霉素和28μg/mL氯霉素的LB液体培养基，在37℃、转速为200r/min的恒温振荡器进行培养3小时，然后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导剂终浓度为0.3mmol/L，然后改变培养温度到32℃，继续培养9小时。
培养结束后，在4℃、4000r/min离心15min收集菌体，收集的菌体用生理盐水淋洗两次，加入原体积1/10的破胞液(50mmol/L PBS、1mmol/LPMSF、300mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑，pH8.0)，重悬菌体在-70℃和4℃冰箱里反复冻融4次以上，4000r/min离心15min后收集上清液及菌体用于SDS-PAGE电泳检测。
五、羰基还原酶的性质鉴定
羰基还原酶酶活的测定是按照反应液在反应过程中NADPH在340nm处吸光度的变化来计算氧化还原酶的活力。测定羰基还原酶的标准条件为：总反应体积为1mL，其中含2μmol的NADPH，3μmol的底物(4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE))，50μmol pH8.0的Tris-HCl缓冲液，于40℃水浴恒温2min后加入50μL酶液开始检测340nm处吸光度的变化。每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟催化氧化1μmol NADPH的酶活力。
将在大肠杆菌表达的羰基还原酶酶液在标准条件下测酶活，将反应液放在20~60℃条件下水浴恒温2min后测酶活，最优为40℃。酶液最适pH的测定是改变反应体系的pH为3~9，按照标准酶活测定方法测得酶还原反应最适反应pH为8。另外还考察了不同的金属离子对酶活的影响，其中Fe2+、Na+、Zn2+、Cu2+对酶活产生抑制作用，Mn2+、Mg2+、Ca2+对酶有一定的激活作用，最优选择是Ca2+，且浓度为0.5mmol/L效果最好。
考察羰基还原酶对底物的特异性，选用的底物有氮,氮-二甲基-3-氧基-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐，4-氯乙酰乙酸乙酯和苯乙酮。结果发现，以4-氯乙酰乙酸乙酯效果最好，氮,氮-二甲基-3-氧基-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐次之，效果最差的是苯乙酮，后两者作为底物测酶活的活力大小相差不是很大；以氮,氮-二甲基-3-氧基-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸做底物时，酶的催化活力是以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物所测得酶活值的60%。
六、重组菌株转化氮，氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐(DKTP)制备(S)-氮，氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺((S)-DHTP)
用无菌生理盐水重悬步骤四中经诱导培养获得的菌体，然后再次4000rpm离心15min收集菌体。将菌体悬浮于30mL的0.1mol/L pH为6.8磷酸缓冲液体系中，干菌体的密度值为4g/L,氮，氮-二甲基-3-氧基-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐的浓度为3.3g/L，10g/L葡萄糖，控制反应体系温度在30~35℃，体系pH值在6~7之间。200r/min振荡反应48小时，调节pH至12左右，用等体积的乙酸乙酯萃取反应物，旋蒸两次后用适量的异丙醇溶解，用于液相检测。
DKTP转化率的液相检测条件：采用SinoChrom ODS-BP(200mm×4.6mm，5μm，大连依利特)色谱柱；检测波长254nm；流动相为乙腈：pH2.5KH2PO4：三乙胺=40：60：0.1(v/v)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样20μL。由图2可知，DKTP的保留时间为5.554min，DHTP的保留时间为4.773min。
DHTP光学纯度检测条件：采用Sino-Chiral OD0B03013-C(200mm×4.6mm，5μm，大连依利特)色谱柱，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，进样5μL。检测波长203nm，流动相为正己烷：乙醇：三氟乙酸=95：5：0.1(v/v)，S型保留时间为30.353min，R型保留时间为24.987min。
由图3可知，产物为S型，光学纯度为97.5%e.e(e.e为对映体过量值)，转化率为41.7%。
七、重组菌株转化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（（S）-CHBE）
转化步骤与制备(S)-DHTP相同，重组工程菌对4.0g/L COBE进行生物催化，干菌体密度值为4g/L，共底物葡萄糖浓度是10g/L，30℃条件下200r/min振荡反应24h，用乙酸乙酯萃取反应物，取适量的体积加入5μL二甲基亚砜(DMSO)作为内标物，气相检测得到产率。再将萃取液中的乙酸乙酯旋干加入无水乙醇用于正相检测，得出光学纯度e.e值。
CHBE气相检测条件：采用1970F气相色谱仪，毛细管柱SE-30；载气为氮气；1μL进样量；氢离子检测器。由图4可知，内标物出峰时间为3.219min，产物出峰时间为3.946min。
标准曲线制作：配置不同浓度的CHBE，加5μL二甲基亚砜内标物，根据两物质峰面积和含量比值做标准曲线，曲线函数为y=2.2133x-0.2014，R2=0.9968。其中y代表产物与内标物含量比值，x代表产物与内标物峰面积比值。CHBE光学纯度检测所用的柱子与检测DHTP光学纯度的柱子相同，CHBE检测条件：检测波长217nm；流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸=90：10：0.1(v/v)，S型保留时间为5.196min，R型保留时间为6.369min。
由图5可知，在S型产物出峰时间(5.196min)有出峰，在R型出峰时间(6.369min)未出现峰形，因此产物光学异构体为S型，光学纯度为100%e.e，转化率为81.0%。
Claims (1)
1.重组工程菌在生产手性药物中间体中的应用，包括以下步骤：
(1)将所述重组工程菌接入培养基，诱导培养后收集菌体细胞；
(2)将菌体细胞悬浮于pH6～7的缓冲液中，加入原料和共底物，反应完成后，分离纯化得到手性药物中间体；
所述原料为氮,氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺或其盐酸盐、4-氯乙酰乙酸乙酯；所述手性药物中间体为(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；
所述重组工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体，所述重组载体由原始载体及插入原始载体的目的基因构成，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)，所述目的基因为羰基还原酶基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述原始载体为pET-28a(+)；
所述反应的温度为30～35℃；
所述反应的时间为24～48h；
所述共底物为葡萄糖；
所述原料的浓度为2～5g/L，所述共底物的浓度为5～12g/L，所述菌体细胞的浓度为2～10g/L。
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