CN107142287A - 青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢‑β‑紫罗兰酮中的应用 - Google Patents
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Abstract
青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢‑β‑紫罗兰酮中的应用，该酶或其基因重组菌可以高效转化β‑紫罗兰酮制备二氢‑β‑紫罗兰酮。在加入40μL 1mol/L IPTG，初始OD600为1.8，加入250μL 250mmol/L β‑紫罗兰酮‑乙醇溶液在27℃条件下全细胞转化18小时，二氢‑β‑紫罗兰酮产量达308.3mg/L。酶转化反应体系为500μL，其中β‑紫罗兰酮浓度为1mmol/L，酶添加量约为30U/mg，反应在pH 6.5，45℃下反应60min，二氢β‑紫罗兰酮浓度为76.49mg/L，底物有效转化率为78.77%。
Description
技术领域
本发明属于天然芳香单体物质制备领域，具体涉及一种青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢-β-紫罗兰酮中的应用。
背景技术
紫罗兰酮类化合物作为调香中不可缺少的原香料，大量的使用于几乎所有的日用香精配方中。据相关资料统计，紫罗兰酮类香料我国生产能力相对较弱，且品种规格单调，绝大多数为紫罗兰酮和甲基紫罗兰酮，远不能满足市场需求。二氢-β-紫罗兰酮，俗称“桂花王”，是桂花精油中一种主要的香气物质，其香味醇厚、甘甜，具有新鲜柏木香型。目前二氢-β-紫罗兰酮的生产大多来自于化学合成，不仅生产成本较高，效益低，而且不能作为一种天然的产品进行销售，其合成产物的效果和“非天然性”的安全性则难以满足食品和天然日化行业的需求。而从芳香植物中提取则存在成本高、缺乏有效的产物分离手段，并且极大的受限于农业种植以及所有能对农业种植产生影响的诸多因素。通过现代合成生物学生产诸如二氢-β-紫罗兰酮等芳香类物质是一个崭新的可持续生产方式。该法是模拟天然植物代谢过程生产出芳香化合物，这些化合物已被欧洲和美国定义为“天然的”并被认为是生产较安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的方法。
以β-紫罗兰酮为底物，利用现代合成生物学制备二氢-β-紫罗兰酮核心的关键技术就是需要找到高效的转化酶，国内外还没有相关的研究报导。仅仅是有一些转化不饱和醛酮的相关酶及其基因方面的研究报导，但是酶具有专一性，且有些酶属于绝对专一性，底物的结构不同，甚至有细微的差异都会影响到酶学的特性及转化的效率。而且，天然产物的合成生物学或生物催化转化来源的酶可以打破种的界限，可以来源于本身植物中酶，也可以来源于其它植物的酶，甚至是来源于微生物的酶。二氢-β-紫罗兰酮俗称“桂花王”，是植物桂花中的特征的香气物质，桂花植物中存在一种生物酶，可以将β-紫罗兰酮转化为二氢-β-紫罗兰酮。但通过大量的筛选和研究，有望能获得显著高于原来植物中的转化水平。2006年美国加州大学伯克利分校的Keasling实验室将来源于不同生物的基因进行设计、组装，最后在酵母中构建了一条非天然的代谢途径用于大量合成青蒿素的前体—青蒿酸。2010年Ajikumar等在大肠杆菌中重建紫杉二烯的合成途径，成功获得了这一紫杉醇的中间体。
本发明模拟天然植物代谢过程，在植物体外生物转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮，并首次发现了一种具有较高转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮能力的非桂花植物来源的双键还原酶基因，在此基础上，通过基因工程技术获得催化性能稳定的基因重组菌pET-28a-DBR1。该重组菌及其分泌的酶对β-紫罗兰酮环外双键有较强的催化加氢能力。本发明建立了一种能在植物体外高效生物转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮的方法。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢-β-紫罗兰酮中的应用，突破了在植物体外生物转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮技术瓶颈，从大量的双键还原酶中筛选获得了一种能高效转化β-紫罗兰酮制备二氢β-紫罗兰酮的生物酶。同时，首次建立了全细胞转化及酶法转化β-紫罗兰酮制备二氢β-紫罗兰酮技术体系，实现了体外制备二氢β-紫罗兰酮的可持续、低成本、高得率的绿色生产方式。
技术方案：青蒿醛双键还原酶DBR1或其重组菌在体外转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮中的应用。
上述青蒿醛双键还原酶DBR1的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
应用方案之一，步骤为：称取0.484gβ-紫罗兰酮用无水乙醇定容到10mL，配成250mmol/Lβ-紫罗兰酮溶液；向5mL LB培养基中加入50μL 50mg/mL卡那霉素，接入500μL含有青蒿醛双键还原酶DBR1基因的工程菌；37℃培养至OD600为0.4-2.0，加入50-300μLβ-紫罗兰酮溶液；加入1mol/L IPTG 0-50μL；在22-42℃下培养6-27小时；加入1mL氯仿萃取。
应用方案之二，步骤为：称取0.0481gβ-紫罗兰酮，用无水乙醇溶解定容到10mL，配成25mmol/Lβ-紫罗兰酮溶液；总反应体系500μL，加入20μL 25mmol/Lβ-紫罗兰酮，加入360μL 50mmol/L 20-50℃pH 6.5Tris-HCl缓冲液，再加入10μL 100mmol/L DTT以及10μL50mmol/L还原辅酶NADPH，最后加入100μL青蒿醛双键还原酶DBR1酶液，酶添加量为20-50U/mg；45℃反应10-60min；1mL氯仿终止反应并萃取。
一种体外转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮的方法，制备体系中含有青蒿醛双键还原酶DBR1或其重组菌。
取萃取液进行气相检测。气相条件：美国安捷伦6890气相色谱，毛细管柱HP5，氢火焰离子化检测器，进样口温度250℃，检测器温度250℃。升温程序：50℃恒温2min，50到120℃10℃/min。120℃恒温2min,线性升温从120-200℃，5℃/min,200℃恒温5min。
有益效果：筛选获得一种来源于青蒿的青蒿醛双键还原酶DBR1，该酶可以高效转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮。在试验最佳条件下，来源于青蒿的青蒿醛双键还原酶DBR1转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮产量是来源于青蒿的青蒿醛双键还原酶DBR2的270倍，是来自于一种芽孢杆菌的双键还原酶产量的770倍，是来自于桂花并与DBR2有78％相似性的一种还原酶产量的256倍。在加入40μL 1mol/L IPTG，初始OD600为1.8，加入250μL250mmol/Lβ-紫罗兰酮-乙醇溶液在27℃条件下转化18小时，二氢-β-紫罗兰酮产量达308.3mg/L。酶转化反应体系为500μL，其中β-紫罗兰酮浓度为1mmol/L，酶添加量约为30U/mg，反应在pH 6.5，45℃下反应60min，二氢β-紫罗兰酮浓度为76.49mg/L，底物有效转化率为78.77％。
附图说明
图1为不同IPTG终浓度对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图2为考察不同温度对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图3为考察不同初始OD600对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图4为考察不同催化转化时间对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图5为考察不同溶剂对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图6为考察不同底物加入量对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响图；
图7为基因工程菌pET-28a-DBR1转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图；
图8为基因工程菌PGEX-4T1--DBR2转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图；
图9为基因工程菌pET-28a-BacOYE1转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图；
图10为基因工程菌PGEX-4T1-2687转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图；
图11为空白对照试验萃取液气质检测总离子图；
图12为青蒿醛双键还原酶1最适反应温度的测定图；
图13为青蒿醛双键还原酶1最适pH测定图；
图14为青蒿醛双键还原酶1温度稳定性测定；
图15为青蒿醛双键还原酶1pH稳定性测定；
图16为测定上清液中青蒿醛双键还原酶1活力以及产物二氢β-紫罗兰酮的产量来评价不同表达条件的效果图；
图17为考察温度对诱导产酶活力的影响图；
图18为考察初始OD600对诱导产酶活力的影响图；
图19为考察时间对诱导产酶活力的影响图；
图20-1为0min的样品利用GC进行成分检测图。
图20-2为10min的样品利用GC进行成分检测图。
图20-3为20min的样品利用GC进行成分检测图。
图20-4为30min的样品利用GC进行成分检测图。
图20-5为60min的样品利用GC进行成分检测图。
具体实施方式
实施例1
1、重组质粒pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687的获得
全基因合成并通过大肠杆菌密码子偏好性优化芽胞杆菌老黄酶2基因(BacOYE1)、青蒿醛双键还原酶1基因(DBR1)以及青蒿醛双键还原酶2基因(DBR2)，以及在桂花转录组(SRA accession number SRP057917)中所得到的与青蒿醛双键还原酶2有最高78％的相似性的Unigene(CL2687.Contig2_ALL)。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4，将其连接到pET-28a以及PGEX-4T1质粒上，获得重组质粒命名为pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687。
Sequence 1：pET-28a-BacOYE1核酸序列
Sequence 2：pET-28a-DBR1核酸序列
Sequence 3：PGEX-4T1-DBR2核酸序列
Sequence4:PGEX-4T1-2687核酸序列
2、重组基因工程菌的构建
分别将重组质粒PGEX-4T1-2687、PGEX-4T1-DBR2、pET-28a-DBR1以及pET-28a-BacOYE1转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，分别在含有氨苄霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL含有抗性的LB培养基中37℃，200rpm振荡培养。
3、基因工程菌转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮系列条件优化
(1)适宜的IPTG加入量：称取0.484gβ-紫罗兰酮用无水乙醇溶解定容到10mL，配成250mmol/Lβ-紫罗兰酮溶液。向5mL LB培养基中加入5μL 50mg/mL卡那霉素，分别接入500μL基因工程菌pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687，37℃培养至OD600为0.6，加入200μLβ-紫罗兰酮溶液，分别加入终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L IPTG，32℃条件下转化12小时，加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，考察不同IPTG终浓度对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响。结果图1，IPTG终浓度分别为0.6、0.4和0.8和0.8mmol/L时效果最好。
(2)适宜催化转化温度。分别按最适的IPTG添加量加入IPTG诱导转化12小时，加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，温度设置分别为22、27、32、37和42℃，考察不同温度对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响。结果见图2，pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687最适转化温度分别是32、27、37和37℃。
(3)适宜初始OD600浓度。分别按最适的IPTG添加量、最适的催化转化温度等最优条件诱导转化12小时，加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，考察不同初始OD600对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响。结果见图3，pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687最适初始OD600分别是1.4、1.8、1.6和0.6。
(4)适宜催化转化时间。分别按最优条件诱导转化后加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，考察不同时间对二氢-β-紫罗兰酮生成量的影响。结果见图4，pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687最适时间分别是12、18、15和21h。
(5)适宜的溶剂。按最优条件诱导转化后加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，考察不同溶剂的影响。结果见图5，当底物用无水乙醇作为溶剂时效果最好。
(6)适宜的底物加入量。按最优条件诱导转化后加入1mL氯仿萃取，取萃取液进行气相检测，考察不同底物加入量的影响。结果见图6，当用无水乙醇作为溶剂时，pET-28a-BacOYE1、pET-28a-DBR1、PGEX-4T1-DBR2以及PGEX-4T1-2687的最适底物加入量分别为150、250、250和200μL。
上述催化转化后的产物经用气相色谱质谱联用仪Trace DSQ检测确证。色谱条件：TR-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm，载气为高纯度氦气(He)，氦气流速为1mL/min，进样口温度250℃。升温程序：起始温度为50℃，保持2min，以10℃/min升至120℃，保持2min。以5℃/min升至200℃，保持5min。质谱条件：接口温度250℃，电离方式EI，离子电离能量70eV，质量扫描范围(m/z)50-450。转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图如下：
(1)基因工程菌pET-28a-DBR1转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图7；
(2)基因工程菌PGEX-4T1-DBR2转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图8；
(3)基因工程菌pET-28a-BacOYE1转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图9；
(4)基因工程菌PGEX-4T1-2687转化β-紫罗兰酮气质检测总离子图10；
(5)空白对照试验萃取液气质检测总离子图11。
4、本发明所述青蒿醛双键还原酶1的定性测定
(1)酶活的测定方法
反应体系500μL，20μL 25mmol/Lβ-紫罗兰酮中加入360μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.5)，45℃预保温3min，再加入10μL 100mmol/L DTT以及10μL 50mmol/L还原辅酶NADPH，最后加入100μL酶液(稀释到合适的倍数)45℃反应10min。1mL氯仿终止反应并萃取。萃取液用气相色谱检测。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1nmol二氢β-紫罗兰酮所需要的酶量为1个酶活力单位。
(2)最适反应温度的测定
在20-55℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.5，结果如图12所示。结果表明，本发明所述青蒿醛双键还原酶1的最适反应温度为45℃。
(3)最适pH测定
在不同的pH(5.0-9.0，50mmol/L Tris-HCl缓冲液)条件下，分别测定酶活(反应温度45℃)，结果如图13所示。结果表明，本发明所述青蒿醛双键还原酶1的最适反应pH为6.5。
(4)温度稳定性测定
在pH 6.5下，使酶在40℃，45℃，50℃温度下分别保温不同的时间(0，20，40，60，80，100，120min)，再测定相对酶活，以未保温(4℃保存)的酶活性为100％，结果如图14所示。结果表明，本发明所述本发明所述青蒿醛双键还原酶1在40℃下保温2h残余酶活力高于75％。
(5)pH稳定性测定
将纯化的重组酶在不同的pH(5.0-9.0，50mmol/LTris-HCl缓冲液)下40℃处理1h，与不保温酶的酶相比，结果如图15所示。结果表明，本发明所述青蒿醛双键还原酶1在pH5-7.5条件下，40℃保温1h后仍能具有90％以上的残余酶活力。
5、本发明所述青蒿醛双键还原酶1优选制备方法
将重组质粒pET-28a-DBR1转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL卡那霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mmol/LIPTG诱导剂，32℃培养18h。用高速冷冻离心机分别将200mL培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，取一定体积全细胞裂解液以13,000rpm离心15min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白—包涵体。我们通过测定上清液中青蒿醛双键还原酶1活力以及产物二氢β-紫罗兰酮的产量来评价不同表达条件的效果，结果如图16所示。结果表明，当IPTG浓度为0.6mmol/L时，本发明所述的基因重组菌分泌青蒿醛双键还原酶1的活力最高。
诱导剂终浓度为0.6mmol/L，分别在22、27、32、37、42℃培养18h。考察温度对诱导产酶活力的影响，结果如图17所示。结果表明，当诱导温度为27℃时，本发明所述的基因重组菌分泌青蒿醛双键还原酶1的活力最高。
诱导剂终浓度为0.6mmol/L，在27℃培养18h。考察初始OD600对诱导产酶活力的影响，结果如图18所示。结果表明，当重组菌OD600为1.8时，本发明所述的基因重组菌分泌青蒿醛双键还原酶1的活力最高。
OD600为1.8，诱导剂终浓度为0.6mmol/L，在27℃分别培养12、15、18、21、24h。考察时间对诱导产酶活力的影响，结果如图19所示。结果表明，当培养基因重组菌18h时，本发明所述的基因重组菌分泌青蒿醛双键还原酶1的活力最高。
6、本发明所述青蒿醛双键还原酶1转化β-紫罗兰酮制备二氢β-紫罗兰酮反应历程
酶转化反应体系为500μL，其中β-紫罗兰酮浓度为1mmol/L，酶添加量约为30U/mg，反应在pH 6.5，45℃下进行，分别对不同反应时间(0，10，20，30，60min)的样品利用GC进行成分检测，结果见图20-1～图20-5。检测结果表明，随着反应时间的延长，转化率逐渐提高。在反应60min后，二氢β-紫罗兰酮浓度为76.49mg/L，底物有效转化率为78.77％。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢-β-紫罗兰酮中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1022
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gg 1022
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<211> 1049
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tgcactaccc accacataac aaccgctcag tttggcaaac tgacccacta actggccaac 540
tgcaccgctt gcggctgaca caaacacata ttcgcctttt ttcggggtac aaatttcata 600
aaagcccaca taggcggtca tgcccggcat acccagaata ccggtataat agctcagcgg 660
aacatcggta tgttcaattt taaacaggcc ttccggtgca ttaataatgc tatattcttc 720
ccaaccggta aagccccaaa tcagatcgcc ttttttaaaa ttggcatgac ctgattccag 780
cactttggca acgccatagc cggttaacgg actacctgga gtaaaagatt ccacatagct 840
accttcggtt ttggtcatgc gagagcgcat atacggatca caagacagat acagattttt 900
aaccagcaga ccattagagc ctgccggcag tttcagggtc atggtttctg aggttttcag 960
aatcatatct gattctttcg gaaagccaac aacataatct ttcagaatca ctttcttgtt 1020
ggtaatcact tcctgctgct gttccatgg 1049
<210> 3
<211> 1193
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatccatgt cagaaaaacc gaccctgttt tctccgtata agatgggtaa ttttaatctg 60
agccatcgcg ttgtgctggc cccgatgaca cgctgtcgcg ccatcaatgc aatccctaat 120
gaggcgttag tggaatatta tcagcagcgt agtacagcgg gcggttttct gattaccgaa 180
ggtacgatga ttagtcctag tagcgccggc tttccacatg ttccgggtat ctttaccaaa 240
gaacaggttg aaggctggaa aaaagtggtt gatgccgcac ataaagaagg cgccgtgatc 300
ttttgccagc tgtggcatgt tggtcgcgcg agtcatcagg tgtatcagcc gggcggtgcg 360
gcacctatta gctctacgag caaaccaatt tctaaaaagt ggaaaattct gatgccagat 420
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attcatggtg cacacggcta ccttctggat cagtttatga aagatggcat caatgatcgc 600
accgatgaat atggcggttc actggaaaat cgctgcaagt ttatcttaca ggttgttcag 660
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aacaagctac agtttaaact gggttcacgc ttagcatatc tgcatgtgac acagcctcgt 840
tataccgcgt acggtcagac ggaagccggc gctcacggta gcgaagaaga agttgctcag 900
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<211> 1283
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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cgctgtcgtg ccttaaacaa tattccgggt ccagccctgg tggaatatta tacacagcgc 240
tctaccaatg gcggctttct gattaccgaa ggtacgatga ttagtccgac cgccgccggc 300
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cgctgcaagt ttatcatgaa tgttgtgcag gccgttgtga gcgcagtggg tgcagatcgt 780
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agtctgggtc tggccgtgat cgaacgcctg aatcgcttac agatcgattg cggcctgaaa 900
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ctgtctcgca tgtaagcggc cgc 1283
Claims (5)
1.青蒿醛双键还原酶DBR1或其重组菌在体外转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述青蒿醛双键还原酶DBR1的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤为：称取0.484g β-紫罗兰酮用无水乙醇定容到10mL，配成250mmol/L β-紫罗兰酮溶液；向5mL LB培养基中加入50μL 50mg/mL 卡那霉素，接入500μL含有青蒿醛双键还原酶DBR1基因的工程菌；37℃培养至OD600为0.4-2.0，加入50-300μL β-紫罗兰酮溶液；加入1mol/L IPTG 0-50μL；在22-42℃下培养6-27小时；加入1mL氯仿萃取。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤为：称取0.0481g β-紫罗兰酮，用无水乙醇溶解定容到10mL，配成25mmol/L β-紫罗兰酮溶液；总反应体系500 μL，加入20 μL 25mmol/L β-紫罗兰酮，加入360 μL 50 mmol/L 20-50℃ pH 6.5 Tris-HCl缓冲液，再加入10μL 100mmol/L DTT以及10μL 50mmol/L 还原辅酶NADPH，最后加入100 μL青蒿醛双键还原酶DBR1酶液，酶添加量为20-50 U/mg；45℃反应10-60 min；1mL氯仿终止反应并萃取。
5.一种体外转化β-紫罗兰酮制备二氢-β-紫罗兰酮的方法，其特征在于制备体系中含有青蒿醛双键还原酶DBR1或其重组菌。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020167834A1 (en) * | 2019-02-11 | 2020-08-20 | Arch Innotek, Llc | Compositions and methods of biosynthesizing carotenoids and their derivatives |
| CN114369603A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-19 | 南京林业大学 | 抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2174745A1 (en) * | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Susumu Kajiwara | Keto group introducing enzyme, dna coding for the same, and process for producing ketocarotenoids |
| CN1212902A (zh) * | 1998-09-14 | 1999-04-07 | 中国科学院广州化学研究所 | 一种具有选择性制备二氢－β－紫罗兰酮的复合催化剂制法 |
| WO2001072978A3 (en) * | 2000-03-27 | 2002-05-16 | Univ Washington | Aryl propenal double bond reductase |
| WO2009067784A1 (en) * | 2007-11-28 | 2009-06-04 | National Research Council Of Canada | Nucleotide sequence encoding artemisinic aldehyde double bond reductase, artemisinic aldehyde double bond reductase and uses thereof |
| CN101454453A (zh) * | 2006-04-05 | 2009-06-10 | 加拿大国家研究委员会 | 编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列 |
| CN102676578A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 转dbr2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 |
| WO2016154314A1 (en) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | Arch Innotek, Llc | Compositions and methods of biosynthesizing carotenoids and their derivatives |
-
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- 2017-05-12 CN CN201710332991.7A patent/CN107142287B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2174745A1 (en) * | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Susumu Kajiwara | Keto group introducing enzyme, dna coding for the same, and process for producing ketocarotenoids |
| CN1212902A (zh) * | 1998-09-14 | 1999-04-07 | 中国科学院广州化学研究所 | 一种具有选择性制备二氢－β－紫罗兰酮的复合催化剂制法 |
| WO2001072978A3 (en) * | 2000-03-27 | 2002-05-16 | Univ Washington | Aryl propenal double bond reductase |
| CN101454453A (zh) * | 2006-04-05 | 2009-06-10 | 加拿大国家研究委员会 | 编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列 |
| WO2009067784A1 (en) * | 2007-11-28 | 2009-06-04 | National Research Council Of Canada | Nucleotide sequence encoding artemisinic aldehyde double bond reductase, artemisinic aldehyde double bond reductase and uses thereof |
| CN102676578A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 转dbr2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 |
| WO2016154314A1 (en) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | Arch Innotek, Llc | Compositions and methods of biosynthesizing carotenoids and their derivatives |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| YANSHENG ZHANG ET AL.: "Accession No.FJ750460.1，Artemisia annua 2-alkenal reductase (Dbr1) mRNA，complete cds", 《GENBANK》 * |
| YANSHENG ZHANG ET AL.: "Molecular cloning and characterization of Dbr1,a 2-alkenal reductase from Artemisia annua", 《NRC RESEARCH PRESS》 * |
| 刘长辉等: "超声辐射选择性还原β-紫罗兰酮工艺", 《中南大学学报(自然科学版)》 * |
| 孔建强等: "青蒿素的合成生物学研究进展", 《药学学报 ACTA PHARMACEUTICA SINICA》 * |
| 田生礼: "《分子生物学实验指导》", 30 April 2014, 华南理工大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020167834A1 (en) * | 2019-02-11 | 2020-08-20 | Arch Innotek, Llc | Compositions and methods of biosynthesizing carotenoids and their derivatives |
| CN114369603A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-19 | 南京林业大学 | 抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用 |
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| Publication number | Publication date |
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