CN107475281B - 一种生物转化甲醇代谢途径 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物转化甲醇代谢途径,在大肠杆菌中人工构建甲醇的代谢途径,该途径简洁,只需两步即可进入大肠杆菌的中央代谢途径。并通过对其途径上的关键酶—甲醛裂合酶(formolase)进行了定向进化,通过全细胞催化得筛选得到了有益突变克隆子,提高了甲醛裂合酶的酶活,然后组装代谢途径上的相关基因,得到了甲醇利用工程菌,在以甲醇为唯一碳源的培养基中进行培养,并通过培养基的优化以及基因敲除等手段实现了甲醇的高效利用。

Description

一种生物转化甲醇代谢途径
技术领域
本发明属于生物转化合成技术领域,具体涉及一种生物转化甲醇代谢途径。
背景技术
甲醇是最简单的一元醇,是无色无味的有酒精气味易挥发的液体,近年来,甲醇的产量逐年增加,2014年突破6500万吨。而甲醇的价格逐年降低。甲醇的产量增加,价格越来越便,而甲醇具很大的毒性,且容易吸水,不能喝汽油等燃料混合使用,在运输过程中也不能采用原有的石油管道运输,运输成本很高,所以将甲醇转换为更具价值的化合物。现在利用化学的方法将甲醇合成其他化合物,该方法耗能大,且对环境的污染严重。生物转化方法不仅环保高效,产物分离简单,而且成本低廉。
虽然甲醇的生物转化可在外界进行,但缺乏利用甲醇生产代谢产物的工程微生物。自然界中甲基营养型细菌主要通过RuMP途径和Serine循环进行甲醇氧化,该途径代谢过程复杂,需要多种酶的参与,可移植性差,无法转移至模式菌株中导致其应用有限,不适合工业生产。 因此,如何实现甲醇的生物转化是近几年来生物能源研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物转化甲醇代谢途径,在大肠杆菌中建立甲醇代谢途径:甲醇在甲醇脱氢酶(MDH)的作用下转化为甲醛,甲醛在甲醛裂合酶(FLS)的作用下生产1,3-二羟基丙酮(DHA),DHA可直接被大肠杆菌利用生长。该途径通过MDH和FLS两个酶即可进入大肠杆菌中央代谢,简洁快速的实现了甲醇的生物转化。而目前国内外尚无有关该途径的报道。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种生物转化甲醇代谢途径,其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS连接在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中,在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养。
所述的启动子为J23100或J23106中的一种,其序列见SEQ ID NO.1-2。
所述的甲醇脱氢酶,其序列见SEQ ID NO.3。
所述的甲醛裂合酶FLS,其序列见SEQ ID NO.4-9为中的一种。
具体包括以下步骤:
1)甲醛裂合酶的改造:利用软件对甲醛裂合酶进行分析,通过分子模拟,进行分子对接,预测活性中心以及底物通道上的热点突变位点,分别是Thr396, Thr446, Met473,Ser477, Leu482和Leu499,然后通过设计引物对相应位点氨基酸进行定点饱和突变。
2)有益突变克隆子的筛选:将突变后的fls基因连接在载体pET28a上,在大肠杆菌中克隆表达。得到的菌株以甲醛为底物进行全细胞催化,与原始的FLS比较,催化效率更高的即为有益突变菌株,然后通过基因测序,找到相对应突变的位点及氨基酸。
3)甲醛脱氢酶的敲除:甲醇通过脱氢酶会生成甲醛,甲醛在FLS的作用下生长DHA,同时甲醛在甲醛脱氢酶的作用下会进一步转化为二氧化碳。为了减少碳损失,使更多的碳流向中央代谢途径,敲掉甲醛代谢支路上的甲醛脱氢酶基因frmA。
4)代谢途径相关基因的组装与培养
通过BRENDA数据库(http://www.brenda-enzymes.org/)筛选了若干要求的酶,分别是甲醇脱氢酶BsMDH、组成型启动子(J23100,J23106),甲醛裂合酶(FLS)。委托通用生物系统(安徽)有限公司合成基因。然后将启动子J23100/J23106、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中。在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+酵母粉的培养基中培养。
本专利提供一种利用甲醇的代谢途径,该途径简洁,只需两步就进入大肠杆菌中央代谢途径,实现甲醇在大肠杆菌的生物转化。经过组装筛选,在培养72h后,甲醇利用量达到了14.2mM。
附图说明
图1为甲醇通过人工途径在大肠杆菌中生长代谢图。
图2为甲醛测定标准曲线。
图3为甲醇测定标准曲线。
图4为甲醇气相色谱检测图。
图5为甲醛裂合酶酶活测定。
图6为敲除甲醛脱氢酶后甲醛积累情况。
图7为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。
图8为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
1、培养方法
1.1 培养基
种子培养基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10(pH=7.0)。
发酵培养基(g/L):NaHPO4.12H2O 17.1、KH2PO4 3、NaCl 0.5、NH4Cl 1
MgSO4 0.12、CaCl2 0.01、Methanol 3.2(pH=7.0)。
1.2 灭菌方法
种子培养基和发酵培养基分别于121℃灭菌20 min,接种前用4M NaOH将培养基pH调节至7.0。MgSO4和CaCl2需单独配置灭菌;甲醇不能高压灭菌,用过滤除菌的方法。
1.3培养方法
取-80℃冰箱保存的工程菌甘油管,将1mL菌液转接至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中,接种后的三角瓶置于30℃、180 rpm摇床上培养12 h,4℃,6000rpm离心手机菌体,用M9盐溶液清洗菌体两次,再用等量的M9盐溶液悬浮菌体,按5%的接种量接种至发酵培养基中,置于30℃、180 rpm摇床上培养。
2、分析方法
2.1 甲醛测定方法
取1mL发酵液于10000 rpm离心5 min,取0.7 mL上清液,加入至等量的Nash试剂,混合均匀。置于37℃水浴20 min,测定其在600 nm处的吸光度。
2.2甲醛裂合酶酶活及动力学测定方法
酶活测定:
定义:一个酶活力单位(U)为每分钟所消耗1uM底物(甲醛)所需的酶量。
体系(1mL):100mM KPO4缓冲液(pH=8.0)、1mM MgSO4、0.1mM TPP、20mM甲醛、1uM(0.03mg )纯酶。
条件:30℃水浴反应1h后,适当稀释后加入等量的纳氏试剂,30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值,通过标准曲线得到甲醛的消耗量,最终得到酶活。
动力学参数测定:
体系(1mL):100mM KPO4缓冲液(pH=8.0)、1mM MgSO4、0.1mM TPP,底物浓度为1~20mM,1uM(0.03mg )纯酶。
条件:30℃水浴反应1h后,适当稀释后加入等量的纳氏试剂,30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值,通过标准曲线得到甲醛的消耗量,最终得到酶活。
2.3 甲醇测定方法
取1mL发酵液于4℃,10000 rpm离心5 min,取上清液。
2.3.1发酵液预处理
(1)称取1.5 g无水碳酸钠,置于10 mL离心管中,并加入2mL乙酸乙酯;
(2)取1mL发酵液,8000 rpm离心10 min,取0.4mL上清液,在漩涡混合器上边振荡边加入上述离心管;
(3)加样完毕将离心管在4℃下密封静置2 h,之后将离心管于8000 rpm离心10min;
(4)取0.4mL上清液与0.4mL以乙酸乙酯为溶剂溶解的5g/L正丁醇混匀;
(5)将混匀溶液置于4℃冰箱保存待测。
2.3.2气相色谱检测
发酵上清液经过萃取后,加入内标5g/L正丁醇从而来准确测定甲醇的浓度。本实验采用Agilent GC7820A 气相色谱仪来测定,测定条件如下:柱温:50℃保留1.5 min;升温速率:8℃/min程序升温到95℃;进样口温度:215℃;检测器温度:245℃;高纯空气流速:300mL/min;氮气流速:10 mL/min;氢气流速:30 mL/min;分流模式:分流出口流量/柱流量=10:1;进样量:1 μL,色谱采用毛细管柱DEX-5柱。
3、实验方法
3.1 甲醛裂合酶改造
利用软件对FLS蛋白进行分析,通过分子模拟,预测活性中心以及底物通道上的热点突变位点,Thr396, Thr446, Met473, Ser477, Leu482和Leu499,在通用生物系统(安徽)有限公司合成原始基因,通过设计引物(见表2),引入突变位点,进行定点随机突变,将PCR片段与载体pET28a连接并导入大肠杆菌中BL21(DE3)中。
表2 启动子扩增引物表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3.2有益突变菌株的筛选
3.2.1从平板上挑取克隆子,转接至装有30ml带有抗性(50ug/mL 卡纳霉素)LB培养基的250 ml三角瓶中,37度,180rpm培养12h后,再按1%的量转接至装有50ml带有抗性(50ug/mL 卡纳霉素)LB培养基的250 ml三角瓶中,37度,180rpm培养至OD在0.6—0.9之间时,加入0.5mM/L的IPTG后,置于18℃,200rpm诱导24h。
3.2.2取菌液并标记,在4℃,6000rpm下离心5min,离心弃上清,加入已预冷的0.85%生理盐水让其充分悬浮起来,相同条件下离心,重复两次,用滤纸吸干多余的水分,称量,得到菌体湿重。
3.2.3体系(5mL):50mM磷酸缓冲液(pH=7)10mM甲醛、菌体湿重25g/L 30℃,200rpm。在2h、3h、4h时取样测定甲醛的剩余量。
3.2.4 通过全系催化筛选,发现Met473和Leu482位点突变后,催化效率比原始的高,通过测序,分别是第473号氨氨基酸由Met突变为Tyr,第482位点分别突变为Asp和Arg,分别记为M473Y、L482D和L482R。同时对Met473和Tyr482两个位点同时进行突变,得到M473Y/L482D、M473Y/L482R。 最终得到5株有益突变株,分别是:FLS(M473Y)、 FLS(L482R)、FLS(L482D)、FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)。
表3 甲醛裂合酶突变引物
Figure DEST_PATH_IMAGE004
3.3甲醛裂合酶酶活及动力学测定
3.3.1菌种活化与IPTG诱导
取-80℃冰箱保存的菌株甘油管,转接至装有40ml带有抗性(50ug/mL 卡纳霉素)LB培养基的250 ml三角瓶中,37℃,180rpm培养12h后,再按1%的量转接至装有40ml带有抗性(50ug/mL 卡纳霉素)LB培养基的250 ml三角瓶中,37℃,180rpm培养至OD在0.6-0.9之间时,加入0.5mM/L的IPTG后,置于18度摇床,200rpm诱导24h。
3.3.2细胞超声破碎
取5ml菌液于10mL离心管,4℃,8000rpm离心5min,离心弃上清,再加入5mL LysisBuffer (50mM)让其充分悬浮起来,分别标记菌体;然后在超声破碎5分钟,功率350W,超3s,停5s。菌液由浑浊变为透明即可。
3.3.3蛋白纯化
细胞破碎后,1000rpm,4度离心5min,得到粗酶液。加入5倍柱体积的Lysis Buffer(50mM)进行平衡,将粗酶液加到平衡好的镍柱中,放置于混合器上,4度结合2h后,用5-10倍柱体积的Wash Buffer进行清洗;最后,用20ml的Elution Buffer洗脱,分管收集目的蛋白,得到纯酶。
3.3.4蛋白浓缩
由于FLS蛋白分子量为59KD左右,选择10KD的超滤管进行超滤,在4000g、20min,最后用100mM KPO4缓冲液(pH=8)更换缓冲液三次。
3.3.5测定
见2.2甲醛裂合酶酶活及动力学测定方法。如图5所示,FLS(M473Y)、 FLS(L482R)、FLS(L482D)、FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)与原始FLS(wild)的相比,酶活均有提高,其中FLS(M473Y/L482R)的酶活达到了1.166U/mg,比原始的FLS(wild)提高了2.5倍,催化效率达到了82.44s-1mM-1 ,比原始的提高了2.8倍。
表1 甲醛裂合酶动力学参数测定
Figure DEST_PATH_IMAGE006
3.4 甲醛脱氢酶(frmA)基因( SEQ ID NO.4)的敲除
3.4.1 frmA自杀性载体的构建
制备的pDS132质粒分别用限制性内切酶XbaI和Sca I彻底消化。再用胶回收试剂盒回收酶切产物。用基因组小量抽提试剂盒制备突变株基因组,作为PCR扩增的模板,扩增甲醛脱氢酶基因上下同源臂frmA1和frmA2, 通过同源重组将PCR片段与酶切好的载体进行连接,转化至感受态E. coli S17-1λpir细胞,涂布于含有34μg/mL氯霉素的LB培养基平板上倒置37℃培养16h,随机从平板上挑取几个克隆子,抽提质粒,进行双酶切和商业测序鉴定正确的重组自杀质粒,重组自杀质粒命名为pDS132-frmA
3.4.2 frmA基因单双交换
在含有相应抗生素的LB液体培养基中过夜培养供体菌E. coli S17-1λpir(内含有重组质粒pDS132-frmA)和受体菌大肠杆菌E. coliDH5α/BL21。按1%的接种量转接入含有相应抗生素的LB液体培养基中培养2h;供体菌和受体菌按不同的比例混合,离心,去除上清,加入100μl 新鲜LB液体培养基,重悬菌体;将事先灭菌好的0.45μm滤膜铺在LB平板上,取5μl悬浮菌液点在滤膜上,37℃培养8-16h;
将滤膜取出,放入含有1ml LB液体培养基的EP管中振荡,取100μl涂布在含有34μg/mL氯霉素LB固体培养基平板上,倒置37℃培养16h,将平板上的单菌挑至无抗性的LB培养基中,37℃,180rpm培养12h,再按1%的转接量转接至无抗性的LB培养基中;取各菌液若干,稀释涂布于带有5%的蔗糖LB固体培养基上,倒置培养12h。
3.4.3 基因敲除验证
用基因组小量抽提试剂盒制备突变株基因组,作为PCR扩增的模板。一条PCR引物与载体上游的序列互补,另一条引物与载体下游序列互补。当基因上下同源臂插入到基因组上后,特定长度的PCR产物就会出现,从而确定大肠杆菌甲醛脱氢酶基因是否敲除。
3.4.4 发酵检测
取-80℃冰箱保存的菌株甘油管,转接至装有30ml带有抗性(50ug/mL卡纳)LB培养基的250 ml三角瓶中,37℃,180rpm培养12h。取菌液10mL,4℃,8000rpm,离心5min后,弃上清液,用等量的M9盐溶液充分悬浮起来,按5%的转接量转接至50mL培养基中,37℃,180rpm、培养至OD600在0.4~0.6之间时,加入0.1mM IPTG 后,30℃,160rpm培养。每隔1h取样一次,测定甲醛积累量。本次实验选用的甲醇脱氢酶来源于B. stearothermophilus(基因序列见附1),编号为BsMDH,将BsMDH连接在pET28a上,导入已敲除甲醛脱氢酶基因的大肠杆菌BL21(ΔfrmA)中,进行培养。实验结果如图6所示:未敲除甲醛脱氢酶的菌株,甲醛先升高后下降,积累的甲醛通过甲醛脱氢酶被转化成二氧化碳,导致甲醛积累量减少。敲除甲醛脱氢酶后,甲醛逐渐积累达到平衡,证明甲醛脱氢酶已敲除成功。
3.5甲醛裂合酶的组装与筛选
通过前面的定向改造,最终得到了5个有益突变克隆子,分别是FLS(M473Y) ( SEQID NO.5)、FLS( L482R) ( SEQ ID NO.6)、 FLS(L482D) ( SEQ ID NO.7)、FLS(M473Y/L482D) ( SEQ ID NO.8)和FLS(M473Y/L482R) ( SEQ ID NO.9)。将这五个克隆子和原始分别与启动子、甲醇脱氢酶进行组装,考察不同克隆子下菌体的生长情况和甲醇消耗情况,筛选得到最佳的甲醛裂合酶。
实验结果如图7所示,在甲醇脱氢酶(BsMDH)( SEQ ID NO.3)下,分别组装原始和突变的甲醛裂合酶,测试其生长情况。从图中可以看出,与原始的甲醛裂合酶想比,突变甲醛裂合酶对菌体生长有促进作用,其中FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)表现最佳,在培养48h后,菌体浓度(OD600)分别达到了1.112和1.216,甲醇利用量达到了11.7mM和10.6mM,综合考虑,FLS(M473Y/L482R)最佳。
3.6启动子的组装与筛选
在最佳甲醇脱氢酶( SEQ ID NO.3)和甲醛裂合酶下,分别考察组成型启动子J23100和J23106下菌体的生长情况与甲醇消耗情况,筛选最佳启动子。
实验结果如图8所示,在最佳脱氢酶和FLS的组合下,分别组装不同组成型启动子,测试其菌体生长情况。从图中可以看出,J23100( SEQ ID NO.1)与J23106( SEQ ID NO.2)相比,J23100的菌体生长情况和甲醇利用量较好,所以选择J23100作为启动子。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种生物转化甲醇代谢途径
<130> 21
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 启动子J23100
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<212> DNA
<213> 甲醇脱氢酶BsMDH基因全长序列
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gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180
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gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300
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gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780
tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840
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gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960
gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
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tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260
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aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560
gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620
aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680
cccttcgcat ga 1692
<210> 5
<211> 1692
<212> DNA
<213> FLS(M473Y)
<400> 5
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<212> DNA
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cccttcgcat ga 1692
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
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<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<210> 17
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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caatgtccac ccccannntt ggttgttcat gatgatg 37
<210> 18
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
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<212> DNA
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<220>
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<222> (16)..(18)
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
tcgcgtgacg ggcacccgtn nngaaaatgg ctcctat 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
ataggagcca ttttcnnnac gggtgcccgt cacgcga 37
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cggataacaa ttcccctcta gattgacggc tagctcagtc ctaggtacag tgctagctac 60
<210> 23
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gacggagctc gaattcggat cccatctagt atttctcctc tttctctagt agctagcact 60
gtac 64
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
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<210> 25
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gacggagctc gaattcggat cccatctagt atttctcctc tttctctagt agctagcact 60
atac 64

Claims (1)

1.一种生物转化甲醇代谢方法,其特征在于:其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中,在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养;
所述的启动子为J23100,其序列见SEQ ID NO.1;
所述的甲醇脱氢酶,其序列见SEQ ID NO.3;
所述的甲醛裂合酶FLS,其序列见SEQ ID NO.8-9中的一种。
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