CN107475281B - 一种生物转化甲醇代谢途径 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物转化甲醇代谢途径，在大肠杆菌中人工构建甲醇的代谢途径，该途径简洁，只需两步即可进入大肠杆菌的中央代谢途径。并通过对其途径上的关键酶—甲醛裂合酶（formolase）进行了定向进化，通过全细胞催化得筛选得到了有益突变克隆子，提高了甲醛裂合酶的酶活，然后组装代谢途径上的相关基因，得到了甲醇利用工程菌，在以甲醇为唯一碳源的培养基中进行培养，并通过培养基的优化以及基因敲除等手段实现了甲醇的高效利用。

Description

一种生物转化甲醇代谢途径
技术领域
本发明属于生物转化合成技术领域，具体涉及一种生物转化甲醇代谢途径。
背景技术
甲醇是最简单的一元醇，是无色无味的有酒精气味易挥发的液体，近年来，甲醇的产量逐年增加，2014年突破6500万吨。而甲醇的价格逐年降低。甲醇的产量增加，价格越来越便，而甲醇具很大的毒性，且容易吸水，不能喝汽油等燃料混合使用，在运输过程中也不能采用原有的石油管道运输，运输成本很高，所以将甲醇转换为更具价值的化合物。现在利用化学的方法将甲醇合成其他化合物，该方法耗能大，且对环境的污染严重。生物转化方法不仅环保高效，产物分离简单，而且成本低廉。
虽然甲醇的生物转化可在外界进行，但缺乏利用甲醇生产代谢产物的工程微生物。自然界中甲基营养型细菌主要通过RuMP途径和Serine循环进行甲醇氧化，该途径代谢过程复杂，需要多种酶的参与，可移植性差，无法转移至模式菌株中导致其应用有限，不适合工业生产。 因此，如何实现甲醇的生物转化是近几年来生物能源研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物转化甲醇代谢途径，在大肠杆菌中建立甲醇代谢途径：甲醇在甲醇脱氢酶(MDH)的作用下转化为甲醛，甲醛在甲醛裂合酶(FLS)的作用下生产1,3-二羟基丙酮（DHA），DHA可直接被大肠杆菌利用生长。该途径通过MDH和FLS两个酶即可进入大肠杆菌中央代谢，简洁快速的实现了甲醇的生物转化。而目前国内外尚无有关该途径的报道。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种生物转化甲醇代谢途径，其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS连接在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中，在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养。
所述的启动子为J23100或J23106中的一种，其序列见SEQ ID NO.1-2。
所述的甲醇脱氢酶，其序列见SEQ ID NO.3。
所述的甲醛裂合酶FLS，其序列见SEQ ID NO.4-9为中的一种。
具体包括以下步骤：
1）甲醛裂合酶的改造：利用软件对甲醛裂合酶进行分析，通过分子模拟，进行分子对接，预测活性中心以及底物通道上的热点突变位点，分别是Thr396, Thr446, Met473,Ser477, Leu482和Leu499，然后通过设计引物对相应位点氨基酸进行定点饱和突变。
2）有益突变克隆子的筛选：将突变后的fls基因连接在载体pET28a上，在大肠杆菌中克隆表达。得到的菌株以甲醛为底物进行全细胞催化，与原始的FLS比较，催化效率更高的即为有益突变菌株，然后通过基因测序，找到相对应突变的位点及氨基酸。
3）甲醛脱氢酶的敲除：甲醇通过脱氢酶会生成甲醛，甲醛在FLS的作用下生长DHA，同时甲醛在甲醛脱氢酶的作用下会进一步转化为二氧化碳。为了减少碳损失，使更多的碳流向中央代谢途径，敲掉甲醛代谢支路上的甲醛脱氢酶基因frmA。
4）代谢途径相关基因的组装与培养
通过BRENDA数据库（http://www.brenda-enzymes.org/）筛选了若干要求的酶，分别是甲醇脱氢酶BsMDH、组成型启动子(J23100,J23106),甲醛裂合酶(FLS)。委托通用生物系统（安徽）有限公司合成基因。然后将启动子J23100/J23106、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中。在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+酵母粉的培养基中培养。
本专利提供一种利用甲醇的代谢途径，该途径简洁，只需两步就进入大肠杆菌中央代谢途径，实现甲醇在大肠杆菌的生物转化。经过组装筛选，在培养72h后，甲醇利用量达到了14.2mM。
附图说明
图1为甲醇通过人工途径在大肠杆菌中生长代谢图。
图2为甲醛测定标准曲线。
图3为甲醇测定标准曲线。
图4为甲醇气相色谱检测图。
图5为甲醛裂合酶酶活测定。
图6为敲除甲醛脱氢酶后甲醛积累情况。
图7为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。
图8为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
1、培养方法
1.1 培养基
种子培养基（g/L）：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10（pH=7.0）。
发酵培养基（g/L）：NaHPO4.12H2O 17.1、KH2PO4 3、NaCl 0.5、NH4Cl 1
MgSO4 0.12、CaCl2 0.01、Methanol 3.2（pH=7.0）。
1.2 灭菌方法
种子培养基和发酵培养基分别于121℃灭菌20 min，接种前用4M NaOH将培养基pH调节至7.0。MgSO4和CaCl2需单独配置灭菌；甲醇不能高压灭菌，用过滤除菌的方法。
1.3培养方法
取-80℃冰箱保存的工程菌甘油管，将1mL菌液转接至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，接种后的三角瓶置于30℃、180 rpm摇床上培养12 h，4℃，6000rpm离心手机菌体，用M9盐溶液清洗菌体两次，再用等量的M9盐溶液悬浮菌体，按5%的接种量接种至发酵培养基中，置于30℃、180 rpm摇床上培养。
2、分析方法
2.1 甲醛测定方法
取1mL发酵液于10000 rpm离心5 min，取0.7 mL上清液，加入至等量的Nash试剂，混合均匀。置于37℃水浴20 min，测定其在600 nm处的吸光度。
2.2甲醛裂合酶酶活及动力学测定方法
酶活测定：
定义：一个酶活力单位(U)为每分钟所消耗1uM底物(甲醛)所需的酶量。
体系(1mL):100mM KPO4缓冲液(pH=8.0)、1mM MgSO4、0.1mM TPP、20mM甲醛、1uM（0.03mg )纯酶。
条件：30℃水浴反应1h后，适当稀释后加入等量的纳氏试剂，30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值，通过标准曲线得到甲醛的消耗量，最终得到酶活。
动力学参数测定：
体系(1mL):100mM KPO4缓冲液(pH=8.0)、1mM MgSO4、0.1mM TPP，底物浓度为1~20mM，1uM（0.03mg )纯酶。
条件：30℃水浴反应1h后，适当稀释后加入等量的纳氏试剂，30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值，通过标准曲线得到甲醛的消耗量，最终得到酶活。
2.3 甲醇测定方法
取1mL发酵液于4℃，10000 rpm离心5 min，取上清液。
2.3.1发酵液预处理
（1）称取1.5 g无水碳酸钠，置于10 mL离心管中，并加入2mL乙酸乙酯；
（2）取1mL发酵液，8000 rpm离心10 min，取0.4mL上清液，在漩涡混合器上边振荡边加入上述离心管；
（3）加样完毕将离心管在4℃下密封静置2 h，之后将离心管于8000 rpm离心10min；
（4）取0.4mL上清液与0.4mL以乙酸乙酯为溶剂溶解的5g/L正丁醇混匀；
（5）将混匀溶液置于4℃冰箱保存待测。
2.3.2气相色谱检测
发酵上清液经过萃取后，加入内标5g/L正丁醇从而来准确测定甲醇的浓度。本实验采用Agilent GC7820A 气相色谱仪来测定，测定条件如下：柱温：50℃保留1.5 min；升温速率：8℃/min程序升温到95℃；进样口温度：215℃；检测器温度：245℃；高纯空气流速：300mL/min；氮气流速：10 mL/min；氢气流速：30 mL/min；分流模式：分流出口流量/柱流量=10：1；进样量：1 μL,色谱采用毛细管柱DEX-5柱。
3、实验方法
3.1 甲醛裂合酶改造
利用软件对FLS蛋白进行分析，通过分子模拟，预测活性中心以及底物通道上的热点突变位点，Thr396, Thr446, Met473, Ser477, Leu482和Leu499，在通用生物系统(安徽)有限公司合成原始基因，通过设计引物（见表2），引入突变位点，进行定点随机突变，将PCR片段与载体pET28a连接并导入大肠杆菌中BL21(DE3)中。
表2 启动子扩增引物表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3.2有益突变菌株的筛选
3.2.1从平板上挑取克隆子，转接至装有30ml带有抗性（50ug/mL 卡纳霉素）LB培养基的250 ml三角瓶中，37度，180rpm培养12h后,再按1%的量转接至装有50ml带有抗性（50ug/mL 卡纳霉素）LB培养基的250 ml三角瓶中，37度，180rpm培养至OD在0.6—0.9之间时，加入0.5mM/L的IPTG后，置于18℃，200rpm诱导24h。
3.2.2取菌液并标记，在4℃，6000rpm下离心5min，离心弃上清，加入已预冷的0.85%生理盐水让其充分悬浮起来，相同条件下离心，重复两次，用滤纸吸干多余的水分，称量，得到菌体湿重。
3.2.3体系(5mL)：50mM磷酸缓冲液（pH=7）10mM甲醛、菌体湿重25g/L 30℃，200rpm。在2h、3h、4h时取样测定甲醛的剩余量。
3.2.4 通过全系催化筛选，发现Met473和Leu482位点突变后，催化效率比原始的高，通过测序，分别是第473号氨氨基酸由Met突变为Tyr，第482位点分别突变为Asp和Arg，分别记为M473Y、L482D和L482R。同时对Met473和Tyr482两个位点同时进行突变，得到M473Y/L482D、M473Y/L482R。 最终得到5株有益突变株，分别是：FLS(M473Y)、 FLS(L482R)、FLS(L482D)、FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)。
表3 甲醛裂合酶突变引物
Figure DEST_PATH_IMAGE004
3.3甲醛裂合酶酶活及动力学测定
3.3.1菌种活化与IPTG诱导
取-80℃冰箱保存的菌株甘油管，转接至装有40ml带有抗性（50ug/mL 卡纳霉素）LB培养基的250 ml三角瓶中，37℃，180rpm培养12h后,再按1%的量转接至装有40ml带有抗性（50ug/mL 卡纳霉素）LB培养基的250 ml三角瓶中，37℃，180rpm培养至OD在0.6-0.9之间时，加入0.5mM/L的IPTG后，置于18度摇床，200rpm诱导24h。
3.3.2细胞超声破碎
取5ml菌液于10mL离心管，4℃，8000rpm离心5min，离心弃上清，再加入5mL LysisBuffer (50mM)让其充分悬浮起来，分别标记菌体；然后在超声破碎5分钟，功率350W，超3s，停5s。菌液由浑浊变为透明即可。
3.3.3蛋白纯化
细胞破碎后，1000rpm，4度离心5min,得到粗酶液。加入5倍柱体积的Lysis Buffer(50mM)进行平衡，将粗酶液加到平衡好的镍柱中，放置于混合器上，4度结合2h后，用5-10倍柱体积的Wash Buffer进行清洗；最后，用20ml的Elution Buffer洗脱，分管收集目的蛋白，得到纯酶。
3.3.4蛋白浓缩
由于FLS蛋白分子量为59KD左右，选择10KD的超滤管进行超滤，在4000g、20min,最后用100mM KPO4缓冲液（pH=8）更换缓冲液三次。
3.3.5测定
见2.2甲醛裂合酶酶活及动力学测定方法。如图5所示，FLS(M473Y)、 FLS(L482R)、FLS(L482D)、FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)与原始FLS(wild)的相比，酶活均有提高，其中FLS(M473Y/L482R)的酶活达到了1.166U/mg，比原始的FLS(wild)提高了2.5倍，催化效率达到了82.44s-1mM-1 ,比原始的提高了2.8倍。
表1 甲醛裂合酶动力学参数测定
Figure DEST_PATH_IMAGE006
3.4 甲醛脱氢酶(frmA)基因（ SEQ ID NO.4）的敲除
3.4.1 frmA自杀性载体的构建
制备的pDS132质粒分别用限制性内切酶XbaI和Sca I彻底消化。再用胶回收试剂盒回收酶切产物。用基因组小量抽提试剂盒制备突变株基因组，作为PCR扩增的模板，扩增甲醛脱氢酶基因上下同源臂frmA1和frmA2, 通过同源重组将PCR片段与酶切好的载体进行连接，转化至感受态E. coli S17-1λpir细胞，涂布于含有34μg/mL氯霉素的LB培养基平板上倒置37℃培养16h，随机从平板上挑取几个克隆子，抽提质粒，进行双酶切和商业测序鉴定正确的重组自杀质粒，重组自杀质粒命名为pDS132-frmA。
3.4.2 frmA基因单双交换
在含有相应抗生素的LB液体培养基中过夜培养供体菌E. coli S17-1λpir(内含有重组质粒pDS132-frmA)和受体菌大肠杆菌E. coliDH5α/BL21。按1％的接种量转接入含有相应抗生素的LB液体培养基中培养2h；供体菌和受体菌按不同的比例混合，离心，去除上清，加入100μl 新鲜LB液体培养基，重悬菌体；将事先灭菌好的0.45μm滤膜铺在LB平板上，取5μl悬浮菌液点在滤膜上，37℃培养8-16h；
将滤膜取出，放入含有1ml LB液体培养基的EP管中振荡，取100μl涂布在含有34μg/mL氯霉素LB固体培养基平板上，倒置37℃培养16h，将平板上的单菌挑至无抗性的LB培养基中，37℃，180rpm培养12h，再按1%的转接量转接至无抗性的LB培养基中；取各菌液若干，稀释涂布于带有5%的蔗糖LB固体培养基上，倒置培养12h。
3.4.3 基因敲除验证
用基因组小量抽提试剂盒制备突变株基因组，作为PCR扩增的模板。一条PCR引物与载体上游的序列互补，另一条引物与载体下游序列互补。当基因上下同源臂插入到基因组上后，特定长度的PCR产物就会出现，从而确定大肠杆菌甲醛脱氢酶基因是否敲除。
3.4.4 发酵检测
取-80℃冰箱保存的菌株甘油管，转接至装有30ml带有抗性（50ug/mL卡纳）LB培养基的250 ml三角瓶中，37℃，180rpm培养12h。取菌液10mL，4℃，8000rpm，离心5min后，弃上清液，用等量的M9盐溶液充分悬浮起来，按5%的转接量转接至50mL培养基中，37℃，180rpm、培养至OD600在0.4~0.6之间时，加入0.1mM IPTG 后，30℃，160rpm培养。每隔1h取样一次，测定甲醛积累量。本次实验选用的甲醇脱氢酶来源于B. stearothermophilus(基因序列见附1)，编号为BsMDH，将BsMDH连接在pET28a上，导入已敲除甲醛脱氢酶基因的大肠杆菌BL21(ΔfrmA)中，进行培养。实验结果如图6所示：未敲除甲醛脱氢酶的菌株，甲醛先升高后下降，积累的甲醛通过甲醛脱氢酶被转化成二氧化碳，导致甲醛积累量减少。敲除甲醛脱氢酶后，甲醛逐渐积累达到平衡，证明甲醛脱氢酶已敲除成功。
3.5甲醛裂合酶的组装与筛选
通过前面的定向改造，最终得到了5个有益突变克隆子，分别是FLS(M473Y) （ SEQID NO.5）、FLS( L482R) （ SEQ ID NO.6）、 FLS(L482D) （ SEQ ID NO.7）、FLS(M473Y/L482D) （ SEQ ID NO.8）和FLS(M473Y/L482R) （ SEQ ID NO.9）。将这五个克隆子和原始分别与启动子、甲醇脱氢酶进行组装，考察不同克隆子下菌体的生长情况和甲醇消耗情况，筛选得到最佳的甲醛裂合酶。
实验结果如图7所示，在甲醇脱氢酶（BsMDH）（ SEQ ID NO.3）下，分别组装原始和突变的甲醛裂合酶，测试其生长情况。从图中可以看出，与原始的甲醛裂合酶想比，突变甲醛裂合酶对菌体生长有促进作用，其中FLS(M473Y/L482D)和FLS(M473Y/L482R)表现最佳，在培养48h后，菌体浓度（OD600）分别达到了1.112和1.216，甲醇利用量达到了11.7mM和10.6mM，综合考虑，FLS(M473Y/L482R)最佳。
3.6启动子的组装与筛选
在最佳甲醇脱氢酶（ SEQ ID NO.3）和甲醛裂合酶下，分别考察组成型启动子J23100和J23106下菌体的生长情况与甲醇消耗情况，筛选最佳启动子。
实验结果如图8所示，在最佳脱氢酶和FLS的组合下，分别组装不同组成型启动子，测试其菌体生长情况。从图中可以看出，J23100（ SEQ ID NO.1）与J23106（ SEQ ID NO.2）相比，J23100的菌体生长情况和甲醇利用量较好，所以选择J23100作为启动子。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种生物转化甲醇代谢途径
<130> 21
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 甲醇脱氢酶BsMDH基因全长序列
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catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180
gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240
gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300
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ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660
aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720
gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780
tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840
ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900
gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960
gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080
gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140
aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200
tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260
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cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380
ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctgggggtgg 1440
acattgcatt tccagcaatt ggccgtcggc cccaatcgcg tgacgggcac ccgtttggaa 1500
aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560
gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620
aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680
cccttcgcat ga 1692
<210> 5
<211> 1692
<212> DNA
<213> FLS(M473Y)
<400> 5
atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60
catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
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<210> 6
<211> 1692
<212> DNA
<213> FLS(L482R)
<400> 6
atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60
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<212> DNA
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<211> 1692
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<212> DNA
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cccttcgcat ga 1692
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
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<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
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caatgtccac ccccannntt ggttgttcat gatgatg 37
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
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tcgcgtgacg ggcacccgtn nngaaaatgg ctcctat 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
ataggagcca ttttcnnnac gggtgcccgt cacgcga 37
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
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<210> 23
<211> 64
<212> DNA
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<400> 23
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gtac 64
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
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<210> 25
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gacggagctc gaattcggat cccatctagt atttctcctc tttctctagt agctagcact 60
atac 64

Claims (1)

1.一种生物转化甲醇代谢方法，其特征在于：其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中，在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养；
所述的启动子为J23100，其序列见SEQ ID NO.1；
所述的甲醇脱氢酶，其序列见SEQ ID NO.3；
所述的甲醛裂合酶FLS，其序列见SEQ ID NO.8-9中的一种。
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