AT526405A1 - Synthetischer Formolaseweg - Google Patents

Abstract

Eine eukaryotische Zelle, welche verändert ist, um einen synthetischen Formolase (FLS)-Weg zu exprimieren, umfassend eine rekombinante FLS um 5 Formaldehyd zu Dihydroxyaceton zu biotransformieren.

Description

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SYNTHETISCHER FORMOLASE WEG

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eukaryotische Zellen, welche verändert wurden, um einen synthetischen Formolase (FLS)-Weg zu exprimieren, insbesondere wobei der FLSWeg in einer Organelle der eukaryotischen Zelle enthalten ist, Methoden zur Herstellung von Biomasse und/oder Expressionsprodukten der eukaryotischen Zelle in einer Zellkultur unter Verwendung einer C1 (Ein-Kohlenstoff) Verbindung als Kohlenstoffquelle, und Fusionsproteine umfassend eine FLS die mit einem peroxisomalen Targeting-Signal (PTS) fusioniert ist, um die Expression der FLS in das

Peroxisom der Zelle auszurichten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Methanol spielt eine entscheidende Rolle in einer zukünftigen Methanolwirtschaft. Derzeit wird Methanol aus fossilen Ressourcen hergestellt, aber "grünes Methanol" oder "Bio-Methanol" kann direkt aus CO2 produziert werden. Als eine Flüssigkeit unter Umgebungsbedingungen, hat Methanol den Vorteil leichter transportiert und gelagert zu werden als molekularer Wasserstoff. Es wird bereits als Massenchemikalie verwendet und mehrere Verarbeitungswege sind verfügbar. Es kann als Kraftstoff dienen und zusätzlich kann es als Kohlenstoffquelle von eukaryotischen Zellen, Ribulose-Monophosphat-Zyklus, Dihydroxyaceton-Zyklus, Ribulose-Biphosphat-Zyklus oder Xylulose-Monophosphat-Zyklus genutzt werden. Alle natürlichen Wege konsumieren hohe Energie (in Form von ATP oder NAD(P)H). Komagataella phaffii (hier auch bezeichnet als Pichia pastoris) ist eine industriell verwendete methylotrophe Hefe und sie kann auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle zu hohen Biomassedichten wachsen.

Der Methanol-Assimilationsweg (Xylulose-Monophosphat-Zyklus, XuMP) hat Ähnlichkeiten mit dem Calvin-Benson-Bassham-Zyklus und dem PentosephosphatWeg. Dieser Weg erfordert jedoch mindestens 10 Enzyme, um die Umwandlung von Methanol zu Dihydroxyaceton (DHA) zu ermöglichen. Zusätzlich werden drei (3) Mol ATP für die Umwandlung von drei Mol (3) Formaldehyd zu einem (1) Mol Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) benötigt. Um ATP zu erzeugen, muss eine

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beträchtliche Menge Methanol von P. pastoris zu CO2 dissimiliert werden, erhaltend NADH und damit ATP über die Atmungskette.

Siegel et al. (2015) beschreiben eine computer-entworfene FLS zur Verwendung in einem Stoffwechselweg unter Verwendung gereinigter Enzyme.

US2013196359A1 offenbart eine in-vitro Methode zur Umwandlung von Formaldehyd zu Dihydroxyaceton durch eine Formolase.

Wang et al. (2017) beschreiben biologische Umwandlung von Methanol durch weiterentwickelte Escherichia coli, die einen linearen Methanol-Assimilationsweg tragen. Der lineare Weg besteht aus zwei enzymatischen Reaktionen: Oxidation von Methanol zu Formaldehyd durch Methanol-Dehydrogenase und Carboligation von Formaldehyd zu DHA durch Formolase (FLS). E. coli exprimierend rekombinante FLS konnten kein Wachstum mit Methanol als der einzigen Kohlenstoffquelle initiieren. Methanol-Assimilation wurde verbessert durch adaptive Evolution um für FLSMutanten zu sorgen.

Cai et al. (2021) und WO2022042427A1 offenbaren zellfreie chemoenzymatische Stärkesynthese aus Kohlendioxid. Eine Mutante des FormolaseEnzyms (FLS-M3) wurde beschrieben.

CN113151230A offenbart FLS-Mutanten.

CN113122525A offenbart mutierte Formaldehyd-umwandelnde Enzyme und Expression besagter Mutanten in einem Bakterium.

CN110438169A offenbart eine Methode für katalytische Synthese von 1Hydroxy-2-butanon in Bakterienzellen unter Verwendung von Formaldehyd und Propionaldehyd als Rohmaterialien und einem veränderten E. coli Stamm enthaltend Formaldehyd-Lyase (FLS).

Van der Klei et al. (2006) veröffentlichen eine Übersicht zur Rolle von Peroxisomen im Methanol-Stoffwechsel von methylotrophen Hefen.

CN107475281A offenbart E. coli verändert um einen Methanol-Stoffwechselweg einschließlich Methanol-Dehydrogenase und Formaldehyd-Lyase FLS zu umfassen.

US20200181629A1 offenbart eine Hefe umfassend einem synthetischen CalvinZyklus wobei ein Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase (RuBisCO)-Gen und ein Ribulose-Phosphat-Kinase (PRK)-Gen mit einem peroxisomalen Targeting-Signal (PTS) fusioniert sind.

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Gassler et al. (2020) beschreiben einen Pichia pastoris Stamm der ein Autotroph ist in der Lage zum Wachstum auf CO2. Ein CO2-Assimilationsweg wurde in P, pastoris verändert, wenn auf das Peroxisom der Hefe ausgerichtet.

Neue Strategien werden benötigt um aktuelle Herausforderungen bei der Energiespeicherung und Kohlenstoffsequestrierung zu adressieren. Insbesondere ist ein Bedarf für neue Biosynthesemethoden um Biomasse oder Expressionsprodukten in einer eukaryotischen Zellkultur herzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist die Aufgabe, einen neuen Stoffwechselweg zur Kohlenstofffixierung in eukaryotischen Zellen bereitzustellen. Es ist ein besonderes Ziel, um für Zellkulturen zu sorgen in der Lage eine C1 Verbindung als Kohlenstoffquelle zu nutzen um effektiv Biomasse oder Expressionsprodukte herzustellen einschließlich z.B., rekombinante Proteine oder zelluläre Metaboliten. Es ist ein weiteres Ziel Zellen zu verändern, um höhere Ausbeuten an Biomasse oder Expressionsprodukten herzustellen.

Die Aufgabe wird durch den beanspruchten Gegenstand gelöst und wie weiter hier beschrieben.

Die Erfindung ermöglicht eine eukaryotische Zelle die verändert ist um einen synthetischen Formolase (FLS)-Weg zu exprimieren umfassend eine rekombinante FLS um Formaldehyd zu Dihydroxyaceton zu biotransformieren.

DHA wird hier so verstanden sich auf DHA in dessen unphosphorylierter Form oder dessen phosphorylierten Form, Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu beziehen. DHA ist auch bekannt als 1,3-Dihydroxypropan-2-on, 1,3-Dihydroxypropanon, oder Glyceron.

Spezifischerweise umfasst die Biotransformation die Biosynthese von Dihydroxyaceton aus Formaldehyd durch enzymatische Reaktion mit der FLS, die Formaldehyd zu Dihydroxyaceton umwandelt.

Spezifischerweise ist die FLS eine Lyase, die die Carboligation von drei EinKohlenstoff Formaldehyd-Molekülen zu einem Drei-Kohlenstoff DihydroxyacetonMolekül katalysiert. Hier beschrieben ist die rekombinante Expression von einem FLSGen das in eukaryotische Zellen eingeführt wurde, insbesondere in Peroxisomen einer methylotrophen Hefe, um den natürlichen Xylulose-Monophosphat-Weg von Pichia

pastoris (Komagataella phaffil) zu ersetzen. Um eine Ausrichtung auf die Peroxisomen

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zu erreichen, wurde ein peroxisomales Targeting-Signal (PTS) an die FLS fusioniert. Zellen die diesen Weg enthalten waren fähig auf Methanol als Kohlenstoffquelle zu wachsen.

Es wurde festgestellt, dass eine eukaryotische Zelle die eine rekombinante FLS exprimiert den neuen FLS-Weg umfasst. Spezifischerweise umfasst der neue FLSWeg die Assimilation einer C1 Verbindung wie Methanol um Formaldehyd in einer enzymatischen Reaktion vor der FLS-enzymatischen Reaktion herzustellen. Daher ermöglicht die Erfindung veränderte Zellen umfassend einen neuen KohlenstoffFixierungsweg einschließlich dem FLS-Weg, was den Vorteil von nur einer kleinen Anzahl an thermodynamisch günstigen chemischen Umwandlungen hat die eine C1 Verbindung in einen Drei-Kohlenstoff Zucker im zentralen Stoffwechsel umwandeln.

Der neue FLS-Weg hat einen niedrigeren Energieverbrauch im Vergleich zum natürlichen Weg. Durch den hier beschriebenen FLS-Weg kann Dihydroxyacetonphosphat auf energieeffiziente Weise hergestellt werden, da die Formosereaktion katalysiert durch das Enzym Formolase (FLS) direkt DHA aus drei (3) Mol Formaldehyd bilden kann. Nur ein (1) Mol ATP wird benötigt (statt drei Mol ATP wie im Xylulose-Monophosphat-Zyklus) um Dihydroxyacetonphosphat zu bilden, welches ein Zwischenprodukt der Glykolyse ist und damit des zentralen KohlenstoffStoffwechsels.

Hier beschrieben werden auch rekombinante FLS-Konstrukte (Proteine und Nukleinsäuremoleküle) die in eukaryotischen Zellen exprimiert werden können, insbesondere in zellulären Kompartimenten wie Organellen oder Peroxisomen, und entsprechenden Expressionskassetten.

Gemäß einem spezifischen Aspekt umfasst oder besteht der FLS-Weg aus der rekombinanten FLS um Formaldehyd zu Dihydroxyaceton (DHA) umzuwandeln.

Spezifischerweise wird rekombinante FLS unter der Kontrolle eines Methanolinduzierbaren Promotors exprimiert, vorzugsweise pDAS2 oder pAOX1.

Spezifischerweise umfasst der FLS-Weg weiters ein oder mehrere Enzyme um eine C1 Verbindung zu Formaldehyd zu biotransformieren, vorzugsweise wobei die C1 Verbindung ist eine von Methanol, Formiat, Methan, Kohlenmonoxid, oder Kohlendioxid.

Gemäß einem spezifischen Aspekt umfasst der FLS-Weg weiters ein Methanol zu Formaldehyd umwandelndes Enzym ("MFCE”"), wie eine Alkoholoxidase oder eine

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Methanoldehydrogenase, um Methanol zu Formaldehyd zu biotransformieren. Spezifischerweise ist die Alkoholoxidase eine Methanoloxidase.

Spezifischerweise ist der FLS-Weg ein linearer Weg.

Spezifischerweise ist der FLS-Weg in einem Stoffwechselweg umfasst der weiters ein oder mehrere Enzyme der Gluconeogenese umfasst unter Verwendung von DHA (oder DHAP) als Vorläufer.

Gemäß einem spezifischen Aspekt ist der FLS-Weg in einer Organelle der Zelle umfasst, vorzugsweise einem Peroxisom oder Mitochondrien.

Spezifischerweise ist die FLS ein heterologes Protein, insbesondere ein künstliches Enzym stammend von oder umfassend einem/n Wildtyp (wie natürlich vorkommend in jedem Organismus) oder eine(r) mutierte(n) FLS. Optional ist die FLS an eine oder mehrere heterologe Sequenzen fusioniert.

Spezifischerweise wird die FLS als FLS-Fusionsprotein exprimiert das die FLS fusioniert mit einem peroxisomalen Targeting-Signal (PTS) umfasst, vorzugsweise wobei das PTS ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Minimalen PTS1Sequenz ("SKL"), der "PTS1-Konsensus-Sequenz"” (Seq_17), der "PTS2-KonsensusSequenz" (Seq_18), Seq_19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, und 26.

Spezifischerweise umfasst oder besteht das PTS aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SKL, Seq_17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, und 26.

Spezifischerweise kann das PTS an den C-Terminus oder den N-Terminus der FLS-Aminosäuresequenz fusioniert sein, mit oder ohne Verknüpfungssequenz.

Spezifischerweise umfasst oder besteht die PTS1-Sequenz aus dem Sequenzmotiv einer PTS1-Sequenz mit der Konsensussequenz (S/A/C/T)-(K/R/H)(L/M/F) (d.h., die "PTS1-Konsensussequenz”), die optional am N-Terminus verlängert ist um eine oder mehrere, bis zu neun Aminosäuren, (X)o-a. Daher ist die PTS1Konsensussequenz durch die folgende Formel gekennzeichnet: (X)o-a-(S/A/C/T)(K/R/H)-(L/M/F) (siehe Seq_17).

Vorzugsweise ein PTS der PTS1-Konsensussequenz ist an den C-Terminus fusioniert.

Spezifischerweise umfasst oder besteht die PTS2-Sequenz aus dem Sequenzmotiv einer PTS2-Sequenz mit der Konsensussequenz (R/K)-(L/I/V)-(X)s(H/Q)-(L/A) (d.h., die "PTS2-Konsensussequenz"”, siehe Seq_18), die vorzugsweise an

den N-Terminus fusioniert ist.

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In den Konsensus-Sequenzen weist der "Schrägstrich" auf alternative Aminosäuren in der Sequenz hin, und der "Bindestrich" weist auf eine peptidische Bindung hin.

Spezifischerweise wird der FLS-Weg in das Peroxisom der Zelle exprimiert, insbesondere wobei die Zelle eine Hefe ist, wie z.B., eine methylotrophe Hefe. Vorzugsweise umfasst der in das Peroxisom exprimierte FLS-Weg ein MFCE und eine FLS um Methanol zu Dihydroxyaceton umzuwandeln.

Gemäß einem spezifischen Aspekt umfasst der FLS-Weg eine Alkoholoxidase und FLS, wobei:

a) die MFCE ein endogen exprimiertes peroxisomales Enzym ist; und

b) die FLS ein Enzym ist das durch Fusionieren eines PTS auf das Peroxisom ausgerichtet ist.

Spezifischerweise ist die FLS gekennzeichnet durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale:

a) die FLS ist eine bakterielle FLS oder eine Benzaldehyd-Lyase bakteriellen Ursprungs, wie stammend von Pseudomonas fluorescens z.B., Pseudomonas fluorescens biovar I, vorzugsweise wobei die FLS als Seq_33 identifiziert ist oder durch die NCBI-Zugangsnummer: 2AG0_A (Kette A, Benzaldehyd-Lyase), oder ein natürlich vorkommendes FLS-Homolog oder Ortholog davon;

b) die FLS ist eine rekombinante FLS die eine Mutante ist von a), vorzugsweise wobei die rekombinante FLS Seq_33 umfasst die verändert ist um eine oder mehrere Punktmutationen einzufügen, vorzugsweise bis zu 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, oder 7 Punktmutationen, wobei die Punktmutationen eine oder mehrere Punktmutationen umfassen, vorzugsweise umfassend ij) mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von einer der folgenden

Mutationen: A281, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, oder A480W; oder il) mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von einer der folgenden Mutationen: A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W; oder ill) mindestens 1, 2, 3, 4, oder 5 von einer der folgenden Mutationen:

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W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, und optional eine, zwei oder drei zusätzliche Mutationen ausgewählt aus: A28l, A28L, L90T, N283H; C) die FLS umfasst oder besteht aus Seqg_31 oder Seq_32; d) die FLS umfasst mindestens eine von 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer FLS von a), b), oder c); e) die FLS ist funktionell wie in einem kolorimetrischen enzymatischen Assay ermittelt, wie hier beschrieben; f) die Nukleotidsequenz codierend die FLS ist codon-optimiert für Expression in der Zelle. Spezifische FLS hier beschrieben sind:

a) eine Wildtyp-FLS von Pseudomonas fluorescens, wobei die FLS als Seqg_33 identifiziert ist oder durch die NCBI-Zugangsnummer: 2AG0_A (Kette A, Benzaldehyd-Lyase);

b) eine rekombinante FLS die Seq_32 umfasst oder daraus besteht, welche rekombinante FLS die Punktmutationen A281, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, und A480W umfasst im Vergleich zu Seq_33;

c) eine rekombinante FLS die Seq_31 umfasst oder daraus besteht, welche rekombinante FLS die Punktmutationen A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W umfasst im Vergleich zu Seq_33.

Die FLS identifiziert als Seq_31 oder Seq_32 ist eine funktionelle FLS-Mutante

einer Wildtyp-FLS.

Die Wildtyp-FLS identifiziert durch Seq_33 umfasst eine Aminosäure (aa)Sequenz von 563 aa Länge. Die mutierte FLS kann länger sein als Seq_33 z.B., durch eine C-terminale Verlängerung der aa-Sequenz. Zum Beispiel, kann die C-terminale Verlängerung von Seq_33 eine Verlängerung von 1 bis 12 aufeinanderfolgenden aa von "GSTENLYFOSGA" (Seq_34) sein wobei die Verlängerung mit der ersten aa startet angegebenen in Seq_34.

Es wird verstanden, dass eine rekombinante oder mutierte FLS stammend von einer Wildtyp-FLS wie Seq_33 umfassend oder daraus bestehend, eine solche Cterminale Verlängerung umfassen kann oder nicht kann. Insbesondere wird verstanden, dass jede der rekombinanten oder mutierten FLS Seq_31 oder Seq_32 umfassend oder daraus bestehend, oder eine funktionelle Variante von irgendeiner der

vorgenannten, eine solche C-terminale Verlängerung umfassen kann oder nicht kann.

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Seq_31 umfasst eine aa-Sequenz von 575 aa Länge. Spezifischerweise umfasst oder besteht die FLS aus Seq_31 oder Seq_32, oder einer funktionellen Variante einer der vorgenannten Sequenzen, vorzugsweise wobei a) die funktionelle Variante von Seq_31 umfasst mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von den Punktmutationen A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu Seq_31;

b) die funktionelle Variante von Seq_32 umfasst mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von den Punktmutationen A281, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, und A480W, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen, ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität zu Seq_32.

Gemäß einem spezifischen Aspekt, ist die Zelle eine mikrobielle Zelle, eine Säugetier-, Insekten-, Pflanzen- oder Algenzelle.

Spezifischerweise ist die Zelle:

a) eine Hefezelle, vorzugsweise aus einer Gattung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pichia, Komagataella, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Ogataea, Yarrowia, und Geotrichum, vorzugsweise Pichia pastoris, Komagataella phafflii, Komagataella pastoris, Komagataella pseudopastoris, Saccharomyces cerevisiae, Ogataea minuta, Kluyveromces lactis, Kluyveromyes marxianus, Yarrowia lipolytica oder Hansenula polymorpha, vorzugsweise eine methylotrophe Hefe;

b) eine Zelle von Fadenpilzen, vorzugsweise aus einer Gattung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Neurospora, Rhizopus vorzugsweise Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Rhizopus oryzae, Penicillium chrysogenum oder Trichoderma reesei;

c) eine nicht-menschliche Primaten-, Menschen-, Nagetier- oder Rinderzelle, vorzugsweise eine Mausmyelom (NSO)-Zelllinie, eine Chinese Hamster Ovary (CHO)Zelllinie, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, MDCK, NIH3T3, PC12, BHK

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(Baby Hamster Kidney Cell), VERO, SP2/0, YB2/0, YO, C127, L cell, COS, QC1-3, HEK-293, PER. C6, HeLA, EBI, EB2, EB3, onkolytische oder Hybridom-Zelllinie;

d) eine Insektenzelle, vorzugsweise eine Sf9-, MimicTM Sf9-, Sf21-, High Five (BT1-TN-5B1-4), oder BT1-Ea88-Zelle;

e) eine Algenzelle, vorzugsweise aus der Gattung Amphora, Bacillariophyceae, Dunaliella, Chlorella, Chlamydomonas, Cyanophyta (Cyanobakterien), Nannochloropsis, Spirulina oder Ochromonas; oder

f) eine Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Zelle aus einkeimblättrigen Pflanzen, vorzugsweise Mais, Reis, Weizen, oder Setaria, oder aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, vorzugsweise Maniok, Kartoffel, Sojabohne, Tomate, Tabak, Alfalfa, Physcomitrella patens oder Arabidopsis.

Die bevorzugten Hefewirtszellen stammen aus methylotropher Hefe, wie Pichia oder Komagataella z.B., Pichia pastoris, oder Komagataella pastoris, oder K. phaffi, oder K. pseudopastoris. Beispiele für den Wirt beinhalten Hefen wie P. pastoris. Beispiele für P. pastoris Stämme beinhalten CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 7435 (=NRRL Y-11430), CBS 9173-9189 (CBS-Stämme: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmel-cultures, Utrecht, Niederlande), und DSMZ 70877 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), aber auch Stämme von Invitrogen, wie X-33, GS115, KM71 und SMD1168. Beispiele für S. cerevisiae Stämme beinhalten W303, CEN.PK und die BY-Reihe (EUROSCARF-Sammlung). Alle der oben beschriebenen Stämme wurden erfolgreich verwendet um Transformanten herzustellen und heterologe Gene zu exprimieren.

Eine bevorzugte Hefewirtszelle kann eine P. pastoris oder S. cerevisiae Wirtszelle sein, spezifischerweise wobei solch eine Wirtszelle heterologe oder rekombinante Promotorsequenzen enthält, die von einem P. pastoris oder S. cerevisiae Stamm abgeleitet sein können, anders als der Produktionswirt. In einer anderen spezifischen Ausführungsform umfasst die hier beschriebene Wirtszelle ein hier beschriebenes rekombinantes Expressionskonstrukt umfassend den Promotor stammend aus derselben Gattung, Spezies oder Stamm wie die Wirtszelle.

Gemäß einem spezifischen Aspekt ist die Zelle eine veränderte Mut’ Hefe, spezifischerweise wobei die Mut’ Hefe durch einen Phänotyp mit reduziertem Wachstum auf Methanol gekennzeichnet ist.

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Spezifischerweise ist die Mut’ Hefe verändert, um Expression einer Dihydroxyaceton-Synthase (DAS) zu reduzieren im Vergleich zu einer endogenen Expression davon, insbesondere im Vergleich zu endogener Expression in der Hefe ohne solch eine Veränderung („Engineering“), vorzugsweise wobei besagtes Engineering eine Deletion, Knock-out oder Unterbrechung von einem oder beiden der DAS1- und DAS2-Gene ist.

Gemäß einem spezifischen Aspekt kann die Zelle in einer Zellkultur kultiviert werden unter Verwendung eines Zellkulturmediums umfassend eine C1 Verbindung als eine Kohlenstoffquelle, insbesondere wobei die Kohlenstoffquelle als eine Quelle für Energie und/oder als eine Quelle für die Herstellung von Fermentationsprodukten einschließlich z.B., Expressionsprodukten verwendet wird.

Spezifischerweise ist die Zelle in der Lage eine C1 Verbindung als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden für die Herstellung von Biomasse und/oder eines Expressionsprodukts, wie z.B., in einer Zellkultur.

Die Erfindung ermöglicht weiters eine Methode zur Kultivierung der hier beschriebenen Zelle in einer Zellkultur unter Verwendung einer C:1 Verbindung als eine Kohlenstoffquelle, wodurch Biomasse und/oder ein Expressionsprodukt in der Zellkultur erhalten wird, vorzugsweise wobei die C1 Verbindung die einzige Kohlenstoffquelle ist.

Spezifischerweise ist das Expressionsprodukt ein Protein von Interesse (POl) oder ein Metabolit, vorzugsweise wobei:

a) das POI ist ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen-bindenden Protein, einem therapeutischen Protein, einem Enzym, einem Peptid, einem Protein-Antibiotikum, einem Toxin-Fusionsprotein, einem Kohlenhydrat-Protein-Konjugat, einem Strukturprotein, einem regulatorischen Protein, einem Impfstoff-Antigen, einem Wachstumsfaktor, einem Hormon, einem Zytokin, einem Prozess-Enzym;

b) der Metabolit ist eine Aminosäure, organische Säure, Alkohol, Zuckeralkohol, Kohlenhydrat, Vitamin, Amin, Aldehyd, Keton, oder ein Polyhydroxyketon, vorzugsweise wobei der Metabolit ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Milchsäure, Zitronensäure, Proptionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Hexansäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Asparaginsäure, XGilucarsäure, Gluconsäure, Glutaminsäure, Itaconsäure,

Lävulinsäure, Acrylsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Ethanol, Propanol, Isopropanol,

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Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Butandiol, 1,3-Propandiol, 1,2Propandiol, 2-Amino-1,3-Propandiol, 3-Hydroxybutyrat, Poly-3-hydroxybutyrat, 3Hydroxypropionaldehyd, 3-Hydroxybutyrolacton, Xylit, Arabinit, Sorbitol, Mannitol, Vitamin C, Riboflavin, Thiamin, Tocopherol, Cobalamin, Pantothensäure, Biotin, Pyridoxin, Niacin, Folsäure, Diamino-Pentan, Diamino-Hexan und Dihydroxyaceton.

Spezifischerweise für den Zweck der Expression eines Expressionsprodukts, wird eine rekombinante Expressionskassette verwendet, die eine oder mehrere heterologe Nukleinsäuresequenz(en) umfasst.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt, ist die Zelle eine Hefe wie z.B., eine methylotrophe Hefe, und die Expressionskassette umfasst eine heterologe Codierungssequenz (oder -gen) welche funktionsfähig mit einem Methanolinduzierbaren Promotor verknüpft ist.

Gemäß einem spezifischen Aspekt wird eine Methode zur Herstellung von Biomasse und/oder eines Expressionsprodukts in einer Zellkultur bereitgestellt, unter Verwendung einer hier beschriebenen Zelle und einer C1 Verbindung, vorzugsweise wobei die C:1 Verbindung die einzige Kohlenstoffquelle in der Zellkultur ist.

Die hier beschriebenen Methoden wenden die Zelle an wie hier beschrieben. Daher sind die hier beschriebenen Methoden spezifischerweise gekennzeichnet durch die Eigenschaften der Zelle wie hier beschrieben.

Die Erfindung ermöglicht weiters ein Fusionsprotein umfassend eine Formolase (FLS) die mit einem peroxisomalen Targeting-Signal (PTS) fusioniert ist.

Spezifischerweise ist das Fusionsprotein gekennzeichnet durch die Merkmale beschrieben als Merkmale der FLS wie im hier beschriebenen FLS-Weg verwendet.

Spezifischerweise ist das Fusionsprotein gekennzeichnet durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale:

a) das PTS ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Minimalen PTS1Sequenz ("SKL"), der "PTS1-Konsensussequenz” (wie hier definiert), der "PTS2Konsensussequenz" (Seq_17), Seq_18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, und 26; und

b) die FLS ist wie hier weiter beschrieben.

Gemäß einem spezifischen Aspekt umfasst das Fusionsprotein eine FLS die eine rekombinante FLS ist wie eine funktionelle FLS-Mutante von einer Wildtyp bakteriellen FLS, wie eine FLS bakteriellen Ursprungs z.B., stammend von Pseudomonas fluorescens, insbesondere Pseudomonas fluorescens biovar I, wobei

die rekombinante FLS die Aminosäuresequenz Seq_33 umfasst wobei die

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Aminosäuresequenz verändert ist um eine oder mehrere Punktmutationen einzufügen, vorzugsweise bis zu 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, oder 7 Punktmutationen, wobei die Punktmutationen eine oder mehrere Punktmutationen umfassen, vorzugsweise umfassend

i) mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von einer der folgenden Mutationen:

A281, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, oder A480W; oder il) mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) von einer der folgenden Mutationen: A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W; oder ill) mindestens 1, 2, 3, 4, oder 5 von einer der folgenden Mutationen: W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, und optional eine, zwei oder drei zusätzliche Mutationen ausgewählt aus: A281, A28L, L90T, N283H; vorzugsweise wobei die rekombinante FLS Seqg_31 oder Seq_32 umfasst oder daraus besteht. Spezifischerweise umfasst das Fusionsprotein eine FLS die Seq_31 oder Seq_32 umfasst oder daraus besteht, oder eine funktionelle Variante von irgendeiner der vorgenannten, vorzugsweise wobei a) die funktionelle Variante von Seq_31 umfasst mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu Seq_31;

b) die funktionelle Variante von Seq_32 umfasst mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28l, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, und A480W, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität zu Seq_32.

Die Erfindung ermöglicht weiters ein Nukleinsäuremolekül codierend das hier beschriebene Fusionsprotein, vorzugsweise wobei das Nukleinsäuremolekül codonoptimiert ist für die Expression in einer eukaryotischen Wirtszelle.

Spezifischerweise ist das Nukleinsäuremolekül ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. Das isolierte Nukleinsäuremolekül kann in eine

Expressionskassette oder ein Expressionskonstrukt eingefügt werden umfassend die

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Expressionskassette, wie ein Vektor, Plasmid, oder künstliches Chromosom. Ein bevorzugter Hefeexpressionsvektor ist für die Expression in einer Hefewirtszelle bestimmt, wie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus methylotrophen Hefen repräsentiert durch die Gattungen Ogataea, Hansenula, Pichia, Candida und Torulopsis ausgewählt wird. Spezifischerweise, Plasmide abgeleitet von pPICZ, PGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, PpGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis oder pPUZZLE können als Vektor verwendet werden.

Die Erfindung ermöglicht weiters eine Expressionskassette umfassend das hier beschriebene Nukleinsäuremolekül und regulatorische Sequenzen um das Fusionsprotein in einer eukaryotischen Wirtszelle zu exprimieren.

Spezifischerweise wird das FLS-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Methanol-induzierbaren Promotors exprimiert, vorzugsweise pDAS?2 oder pAOX1.

Spezifischerweise hier bereitgestellt wird eine eukaryotische Zelle umfassend die hier beschriebene Expressionskassette.

Spezifischerweise ist die hier beschriebene rekombinante FLS ein funktionelles Enzym, wobei die enzymatische Aktivität durch einen Standard kolorimetrischen Assay bestimmt wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, oder von Cai et al. (Cai et al. 2021), oder von Siegel et al. (Siegel et al. 2015).

Spezifischerweise wird eine FLS als funktionsfähig betrachtet, wenn eine katalytische Effizienz höher als 0,01 M-'*s-! detektiert werden kann.

FIGUREN

Abbildung 1: Schematische Darstellung der konstruierten und integrierten Genkassetten für die Erzeugung des P. pastoris Stammes (A) ADAS1, ADAS2, AAOX1, (pDAS2::FLS::HpH")* und (B) Stamm ADAS1, ADAS2, AAOXI1, (PAOX1::FLS::G418').

Abbildung 2: Bestätigung der FLS-Genexpressionskassetten durch PCRAmplifikation mit genomischer DNA als Template. Amplifizierte Genfragmente (1-6) SEQ3 aus ADAS1, ADAS2,2AA0OX1, (pDAS2::FLS::HpH")*, Transformanten, and (7-12) SEQ4 aus ADAS1, ADAS2, AAOX1, (pAOX1::FLS::G418')*, (M) Quick-Load 1 kb Plus DNA Ladder (New England Biolabs).

Abbildung 3: (A) Die Wachstumskurven der FLS exprimierenden P. pastoris

Transformanten im Vergleich zum elterlichen Stamm und einem leeren Vektorstamm

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in synthetischen M2-Medien mit Methanol als Kohlenstoffquelle. (B) Die logarithmische Darstellung der gleichen Wachstumskurven präsentierend die linear gefitteten Bereiche die verwendet wurden um die Wachstumsrate zu berechnen.

Abbildung 4: Mikroskopische Aufnahmen nach 40 Stunden Inkubation in M2/Methanol-Medien (A) FLS exprimierender P. pastoris Stamm ADAS1, ADAS?2, AAOX1, (pAOX1::FLS::G418')* und von (B) dem elterlichen P. pastoris MUT- Stamm ADAS1, ADAS2, AAOX1 bei einer 1000x Vergrößerung mit einem Gesamtdurchmesser des Sichtfelds von 200 um.

Abbildung 5: Seq_1: DNA-Sequenz der FLS::PTS1 codierenden Sequenz Seq_2: Proteinsequenz von FLS::PTS1 (Fusionsprotein) Seq_3: pDAS2:FLS::HpH" Kassette sequenziert integriert in das Genom von P. pastoris CBS7435 ADAS1, ADAS?2, AAOXT Seq_4: pAOX1::FLS::HpH" Kassette sequenziert integriert in das Genom von P. pastoris CBS7435 ADAS1, ADAS2, AAOXT Seq_5: PCR Primer Amplifikation DAS1 Locus, (DAS1-F) Seq_6: PCR Primer Amplifikation DAS1 Locus, (DAS1-R) Seq_7: PCR Primer Amplifikation DAS2 Locus, (DAS2-F) Seq_8: PCR Primer Amplifikation DAS2 Locus, (DAS2-R) Seq_9: PCR Primer Amplifikation AOX1 Locus, (AOX1-F) Seq_10: PCR Primer Amplifikation AOX1 Locus, (AOX1-R) Seq_11: PCR-Screening Primer für die FLS-Kassetten Integration (Screening PCR-F) Seq_12: PCR Screening Primer für die FLS Kassetten Integration (Screening PCR-R) Seq_13: DNA-Sequenz des genomischen Locus von AAOX1 von P. pastoris CBS7435 ADAS1, ADAS2, AAOX1 Seqg_14: DNA-Sequenz des genomischen Locus von ADAS1 von P. pastoris CBS7435 ADAS1, ADAS2, AAOX1 Seq_15: DNA-Sequenz des genomischen Locus von ADAS2 von P. pastoris CBS7435 ADAS1, ADAS2, AAOX1 Seq_16: Fusionsprotein umfassend eine FLS (aus Siegel et al. 2015) und einer PTS Minimalen PTS1-Sequenz: SKL Seq_17: PTS1-Konsensussequenz: (X)o-s-(S/A/C/T)-(K/R/H)-(L/M/F) Seq_18: PTS2-Konsensussequenz: (R/K)-(L/I/V)-(X)s-(H/Q)-(L/A) Seq_19: PTS1 aus AOX1 (Pichia pastoris)

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Seq_20: PTS1 von AOX2 (Pichia pastoris)

Seq_21: PTS1 aus FBA1 (Pichia pastoris)

Seq_22: PTS1 aus RKI1-2 (Pichia pastoris)

Seq_23: PTS1 aus TAL1-2 (Pichia pastoris)

Seq_24: PTS1 aus CTA1 (Pichia pastoris)

Seq_25: PTS2 aus POX3 (Saccharomyces cerevisiae)

Seq_26: PTS2 aus AMO (Hansenula polymorpha)

Seq_27: AOX1 aus Komagataella phaffii Stamm ATCC 76273 / CBS 7435 Seq_28: AOX2 aus Komagataella phaffii Stamm ATCC 76273 / CBS 7435, Seq_29: AOD1 aus Candida boidinii

Seq_30: MOX von Hansenula polymorpha

Seqg_31: rekombinante FLS von Seq_2

Seq_32: rekombinante FLS von Seq_16

Seq_33: FLS von Pseudomonas fluorescens, NCBI-Zugangsnummer: 2AG0_A (Kette A, Benzaldehyd-Lyase)

Seq_34: beispielhafte C-terminale Verlängerung, zur Verlängerung von Seq_33

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Sofern nicht anders angegeben oder definiert, haben alle hierin verwendeten Begriffe ihre übliche Bedeutung in der Fachwelt, die dem Fachmann klar sein wird. Verwiesen wird zum Beispiel auf die Standardhandbücher. Hier beschriebene genetische Modifikationen können Werkzeuge, Methoden und Techniken anwenden die in der Fachwelt bekannt sind, wie z.B beschrieben von J. Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), Lewin "Genes "V", Oxford University Press, New York (1990), und Janeway et al. "Immunobiology" (5. Auflage oder neuere Auflagen), Garland Science, New York (2001).

Die Begriffe "umfassen", "enthalten", "haben" und "inkludieren" wie hier verwendet können synonym verwendet werden und sind als offene Definition zu verstehen, die weitere Mitglieder oder Teile oder Elemente zulässt. "Bestehend" wird als engste Definition ohne weitere Elemente des Definitionsmerkmals "bestehend" betrachtet. Somit ist "bestehend" breiter und enthält die "bestehend" Definition.

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Der Begriff "etwa" wie hier verwendet bezieht sich auf den gleichen Wert oder einen Wert der um +/-10 % oder +/-5 % vom gegebenen Wert abweicht.

Der Gegenstand der Ansprüche bezieht sich spezifischerweise auf künstliche Produkte oder Methoden anwendend oder herstellend solch künstlichen Produkte, die Varianten von nativen (Wildtyp-)Produkten sein können. Obwohl ein gewisses Maß an Sequenzidentität mit der nativen Struktur da sein kann, ist es wohlverstanden, dass die Materialien, Methoden und Verwendungen der Erfindung z.B., spezifischerweise in Bezug auf isolierte Nukleinsäuresequenzen, Aminosäuresequenzen, Fusionskonstrukte, Expressionskonstrukte, veränderte Zellen wie Wirtszellen beinhaltend rekombinante Expressionskonstrukte oder synthetische Stoffwechselwege, und modifizierte Proteine, "künstlich" oder synthetisch sind, und daher nicht als Ergebnis von "Naturgesetzen" betrachtet werden.

Spezifische Begriffe wie in der ganzen Spezifikation verwendet haben die folgende Bedeutung:

Der Begriff "Biomasse" wie hier verwendet bezieht sich auf die Substanz erhalten durch Isolierung ganzer Zellen, Fraktionen oder Extrakten davon die erhalten werden aus einer Zellkultur, insbesondere wo die Biomasse Kohlenhydrate und/oder Proteine inkludiert.

Der Begriff "Kohlenstoffquelle" wird hier verstanden als "Kohlenstoffsubstrat" und bedeutet ein fermentierbares Kohlenstoffsubstrat das verwendet werden kann um organische Kohlenstoffverbindungen herzustellen, geeignet als eine Energiequelle für Mikroorganismen. C1 Verbindungen können als Kohlenstoffquelle verwendet werden, welche anorganische oder organische Verbindungen sind die nur ein Kohlenstoffatom pro Molekül oder Ion umfassen. Beispielhafte C1 Kohlenstoffmoleküle verwendet als Substrate für Biomasseproduktion und andere hier beschriebene Fermentationsprozesse inkludieren Methan, Kohlendioxid (in gasförmiger oder gelöster Form), Kohlenmonoxid, Methanol und Synthesegas (eine Mischung aus Kohlenmonoxid und Wasserstoff), aber können auch Formiat, oder Mischungen aus jeder der vorgenannten sein. Eine Verbindung kann als einzige Kohlenstoffquelle verwendet werden, oder andernfalls kann eine Mischung von verschiedenen Verbindungen als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Der Begriff "Zelle" in Bezug auf eine veränderte Zelle wie hier verwendet, die einen Stoffwechselweg umfasst, die hier auch als "Wirtszelle" bezeichnet wird, bezieht

sich auf eine einzelne Zelle, einen einzelnen Zellklon, oder eine Zelllinie.

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Der Begriff "Zelllinie" wie hier verwendet bezieht sich auf einen etablierten Klon eines bestimmten Zelltyps der die Fähigkeit erworben hat sich über einen längeren Zeitraum zu vermehren. Eine Zelllinie wird in der Regel zum Exprimieren eines endogenen oder rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Gens verwendet, eines Stoffwechselwegs oder von Produkten eines Stoffwechselwegs, um Fermentationsprodukte herzustellen, wie Biomasse oder Expressionsprodukte z.B., Polypeptide (einschließlich z.B., ein Protein von Interesse, POI), Nukleinsäureprodukte (zum Beispiel DNA oder RNA), Zellen und/oder Viren, oder Zellmetaboliten.

Eine "Produktionswirtszelllinie" oder "Produktionszelllinie" wird gewöhnlich verstanden eine Zelllinie zu sein gebrauchsfertig für Zellkultur in einem Bioreaktor um Fermentationsprodukte zu erhalten. Es wird wohlverstanden, dass sich der Begriff "Wirtszelle" auf rekombinante Wirtszellen bezieht und keine Menschen inkludiert. Spezifischerweise sind rekombinante Wirtszellen wie hier beschrieben künstliche Organismen und Derivate von nativen (Wildtyp-)Wirtszellen.

Spezifische hier beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf eine Wirtszelle welche wie hier beschrieben verändert ist, um einen FLS-Weg zu beinhalten und zu exprimieren wie hier beschrieben. Solch rekombinante Wirtszellen werden als isolierte Wirtszelle und entsprechende Wirtszelllinien oder -kulturen bereitgestellt. Rekombinante Wirtszellen können ex vivo kultiviert werden um Fermentationsprodukte herzustellen.

Der Begriff "Zellkultur" oder "Kultivierung" wie hier verwendet in Bezug auf eine Wirtszelle, bezieht sich auf die Aufrechterhaltung von Zellen in einer künstlichen, z.B., einer /n vitro Umgebung, unter Bedingungen begünstigend Wachstum, Differenzierung oder fortgesetzte Lebensfähigkeit, in einem aktiven oder ruhenden Zustand, der Zellen, spezifischerweise in einem kontrollierten Bioreaktor gemäß in der Industrie bekannten Methoden. Bei der Kultivierung einer Zellkultur unter Verwendung geeigneter Kulturmedien, werden die Zellen in Kontakt mit den Medien in einem Kulturgefäß gebracht oder mit Substrat unter Bedingungen geeignet die Kultivierung der Zellen in der Zellkultur zu unterstützen. Standard Zellkulturmedien und -techniken sind in der Fachwelt wohlbekannt.

Rekombinante Proteine oder zelluläre Metaboliten können unter Verwendung der hier beschriebenen Wirtszelle und entsprechenden Zelllinien hergestellt werden,

durch Kultivieren in einem geeigneten Medium, Isolieren des exprimierten Produkts

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oder Metabolits aus der Kultur, und sie gegebenenfalls reinigen durch geeignete Methoden.

Die hier beschriebene Wirtszelle kann getestet werden auf ihre Kapazität Expressionsprodukte herzustellen mit jedem der folgenden Tests: ELISA, Aktivitätsassay, Kapillarelektrophorese, HPLC, oder andere geeignete Tests, wie SDSPAGE und Western Blotting Techniken, oder Massenspektrometrie.

Der Begriff "Expression" wie hier verwendet bezieht sich auf Expression eines Polynukleotids oder Gens aus einer Expressionskassette, oder auf die Expression des entsprechenden Polypeptids oder Proteins.

Der Begriff "Expressionskassette" wird hier verstanden sich auf Nukleinsäuremoleküle (hier auch als Polynukleotide bezeichnet) zu beziehen, die eine gewünschte Codierungssequenz (hier als Gen bezeichnet) enthalten, und Kontrollsequenzen in funktionsfähiger Verknüpfung, so dass Wirte transformiert oder transfiziert mit diesen Molekülen die entsprechenden Sequenzen beinhalten und in der Lage sind die Expressionsprodukte herzustellen.

Eine Expressionskassette kann ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle (z.B., ein Gen) umfassen die endogen oder heterolog zu einer Wirtszelle sind. Spezifischerweise kann die Expressionskassette Polynukleotide umfassen codierend einen Stoffwechselweg, wie einen Weg umfassend den hier beschriebenen FLS-Weg. Spezifischerweise kann der hier beschriebene Stoffwechselweg durch Polynukleotide codiert werden, umfasst in einer oder mehreren Expressionskassetten, z.B., in einem oder mehreren Expressionskonstrukten enthalten in der Wirtszelle.

Eine Expressionskassette kann ex vivo oder in vivo verändert werden. Zum Beispiel kann eine Expressionskassette verändert werden als Teil eines Vektors oder eines künstlichen Expressionskonstrukts das bereitgestellt werden kann als isoliertes Expressionskonstrukt das verändert ist unter Verwendung von /n vitro Techniken, und gegebenenfalls eingefügt in eine Zellkultur.

Spezifischerweise umfasst die hier beschriebene rekombinante FLSExpressionskassette das FLS Spezifischerweise umfasst die Expressionskassette exprimierend die hier beschriebene rekombinante FLS ein oder mehrere regulatorische Elemente nicht nativ assoziiert mit dem Gen codierend die FLS. Solche Expressionskassetten umfassend

assoziiert mit dem Gen codierend die FLS. Solche Expressionskassetten umfassend

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ein oder mehrere Elemente die nicht nativ mit einem Gen assoziiert sind, werden hier als künstliche oder rekombinante Expressionskassetten verstanden.

Ein Element einer Expressionskassette das "nicht nativ assoziiert ist mit" solch einem Gen ist in der Regel nicht funktionsfähig verknüpft mit solch einem Gen in einer Wildtyp-Wirtszelle, während die Wildtyp-Wirtszelle solch ein Gen endogen exprimiert mit regulatorischen Elementen die "nativ assoziiert sind mit" solch einem Gen. Eine Wildtyp-Wirtszelle wird hier verstanden eine natürlich vorkommende Wirtszelle zu sein die nicht rekombiniert ist auf irgendeine künstliche Weise.

Eine oder mehrere Expressionskassetten werden hier auch verstanden als "Expressionssystem". Das Expressionssystem kann in einem Expressionskonstrukt inkludiert sein, wie einer künstlichen heterologen Expressionskassette, einem Vektor und insbesondere einem Plasmid. Die relevante DNA einer Expressionskassette oder eines Konstrukts kann auch in ein Wirtszellchromosom integriert sein. Expression kann sich auf sezernierte oder nicht sezernierte Expressionsprodukte beziehen, einschließlich Polypeptiden oder Metaboliten.

Expressionskassetten werden zweckmäßigerweise als Expressionskonstrukte bereitgestellt z.B., in Form von "Vektoren" oder "Plasmiden", die in der Regel DNASequenzen sind die benötigt werden für die Transkription von klonierten rekombinanten Nukleotidsequenzen d.h., von rekombinanten Genen und der Translation ihrer mRNA in einem geeigneten Wirtsorganismus. Expressionsvektoren oder Plasmide umfassen in der Regel einen Ursprung für autonome Replikation oder einen Locus für Genomintegration in den Wirtszellen, selektierbare Marker (z.B., ein Aminosäuresynthese Gen oder ein Gen verleihend Resistenz gegen Antibiotika wie Zeocin, Kanamycin, G418 oder Hygromycin, Nourseothricin), eine Reihe von Restriktionsenzym-Spaltstellen, eine geeignete Promotorsequenz und einen Transkriptionsterminator, welche Komponenten funktionsfähig miteinander verknüpft sind. Die Begriffe "Plasmid" und "Vektor" wie hier verwendet inkludieren sowohl autonom replizierende MNukleotidsequenzen als auch genomintegrierende Nukleotidsequenzen, wie künstliche Chromosomen z.B., ein bakterielles künstliches Chromosom (BAC) oder ein Hefe künstliches Chromosom (YAC).

Expressionsvektoren können inkludieren aber sind nicht beschränkt auf Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren und spezifischerweise entworfene Plasmide. Bevorzugte hier beschriebene Expressionsvektoren sind

Expressionsvektoren geeignet zum Exprimieren eines rekombinanten Gens in einer

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eukaryotischen Wirtszelle und werden abhängig vom Wirtsorganismus ausgewählt. Geeignete Expressionsvektoren umfassen in der Regel regulatorische Sequenzen, geeignet zum Exprimieren von DNA codierend Polypeptid oder Protein von Interesse in einer eukaryotischen Wirtszelle. Beispiele für regulatorische Sequenzen inkludieren Promotoren, Operatoren, Enhancer, ribosomale Bindungsstellen, und Sequenzen die Transkriptions- und Translationsinitierung und -terminierung steuern. Die regulatorischen Sequenzen sind in der Regel funktionsfähig verknüpft mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz.

Um Expression einer rekombinanten Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle zu erlauben, reguliert und initiiert in der Regel eine Promotorsequenz die Transkription der nachfolgenden („downstream“) Nukleotidsequenz, mit der sie funktionsfähig verknüpft ist. Eine Expressionskassette oder ein Vektor umfasst in der Regel eine Promotor-Nukleotidsequenz die angrenzend zum 5'-Ende einer Codierungssequenz ist, z.B., vorhergehenden („upstream“) von und angrenzend an die Codierungssequenz (z.B., Gen von Interesse) oder wenn eine Signal- oder Leader-Sequenz verwendet wird, upstream von und angrenzend an besagte Signal- und Leader-Sequenz, jeweils, um die Translations-Initierung und Expression der Codierungssequenzen zu erleichtern um das Expressionsprodukt zu erhalten.

Wie hier verwendet, ist der Begriff "angrenzend" gemeint sich auf einen Abstand zwischen Elementen einer Nukleinsäuresequenz zu beziehen der "innerhalb von etwa 10 bp" oder "innerhalb von etwa 5 bp" der Nukleinsäuresequenz ist.

Spezifische hier beschriebene Expressionskassetten umfassen einen Promotor funktionsfähig verknüpft mit einer codierenden Nukleotidsequenz. Spezifischerweise kann der Promotor verwendet werden um Expression einer Codierungssequenz zu steuern, wobei der Promotor nicht nativ mit der Codierungssequenz assoziiert ist.

Spezifische hier beschriebene Expressionskonstrukte umfassen eine Codierungssequenz verknüpft mit einer Leader-Sequenz (z.B., einer Sekretionssignalpeptidsequenz (Prä-Sequenz), einer Pro-Sequenz, oder einer PräPro-Sequenz), die Transport des exprimierten Polypeptids oder Proteins in den Sekretionsweg und/oder die Sekretion aus der Wirtszelle bewirkt. Das Vorhandensein solch einer Sekretions-Leader-Sequenz in einer Expressionskassette oder einem Konstrukt wird in der Regel benötigt, wenn das Polypeptid oder Protein vorgesehen für

rekombinante Expression nicht natürlich von der Wirtszelle sezerniert wird und daher

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einer natürlichen Sekretions-Leader-Sequenz mangelt, oder dessen Nukleotidsequenz kloniert wurde ohne seine natürliche Sekretions-Leader-Sequenz.

In spezifischen Ausführungsformen können Multiklonierungs-Vektoren verwendet werden, die Vektoren sind mit einer Multiklonierungs-Stelle. Spezifischerweise können ein oder mehrere gewünschte Polynukleotide an einer Multiklonierungs-Stelle integriert oder beinhaltet sein um einen Expressionsvektor vorzubereiten. Im Falle von Multiklonierungs-Vektoren, wird in der Regel ein Promotor upstream von der Multiklonierungs-Stelle platziert um Expression von besagtem einen oder mehreren gewünschten Polynukleotiden zu steuern.

Der Begriff "Genexpression", "Exprimieren eines Polynukleotids", "Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls"” oder "Expressieren eines Wegs" wie hier verwendet, bedeutet mindestens einen Schritt zu umfassen ausgewählt aus der der Gruppe bestehend aus DNA-Transkription in mRNA, mRNA-Translation und -Prozessierung, MRNA-Reifung, mRNA-Export, Proteinfaltung und/oder Proteintransport, dadurch erhaltend Expressionsprodukte, Vorstufen oder Zwischenprodukte davon.

Die Begriffe "Polynukleotid", "Nukleinsäuremolekül(e)" oder

"Nukleinsäuresequenz(en)" werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination aus beiden, in einer polymeren unverzweigten Form beliebiger Länge. Vorzugsweise bezieht sich ein Polynukleotid auf Desoxyribonukleotide in einer polymeren unverzweigten Form beliebiger Länge. Hier bestehen Nukleotide aus einem Pentosezucker (Desoxyribose), einer stickstoffhaltigen Base (Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin) und einer Phosphatgruppe.

Der Begriff "endogen" wie hier verwendet bedeutet diese Moleküle und Sequenzen zu inkludieren, insbesondere Gene oder Proteine, die vorhanden sind in einer Wildtyp- (nativen, nicht rekombinanten) Wirtszelle oder exprimiert werden von solch einer Wildtyp-Wirtszelle, damit "endogen" zu besagter Wildtyp-Wirtszelle. Insbesondere ein endogenes Nukleinsäuremolekül (z.B., ein Gen) oder Protein das in einer bestimmten Wirtszelle vorkommt (und von ihr stammt, oder aus ihr gewonnen werden kann) wie es in der Natur gefunden wird, wird verstanden "wirtszellenendogen" oder "endogen zur Wirtszelle" zu sein. Darüber hinaus, eine Zelle "endogen exprimierend" eine Nukleinsäure oder ein Protein exprimiert diese Nukleinsäure oder dieses Protein ebenso wie eine Wirtszelle desselben bestimmten Typs wie es in der

Natur vorkommt. Darüber hinaus, eine Wirtszelle „endogen produzierend“ oder die

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„endogen produziert“ eine Nukleinsäure, Protein, oder andere Verbindung produziert diese Nukleinsäure, dieses Protein, oder diese Verbindung ebenso wie eine Wirtszelle desselben bestimmten Typs wie es in der Natur vorkommt. Ein endogenes Protein kann überexprimiert werden wie z.B., in einer veränderten Wirtszelle umfassend eine künstliche Expressionskassette die das Protein zu einem höheren Level exprimiert als im Vergleich zum Level exprimiert durch eine entsprechende Wildtyp-Wirtszelle ohne solch Engineering. Selbst wenn ein Protein nicht mehr produziert wird von einer Wirtszelle, wie z.B., einer Knockout-Mutante der Wirtszelle, wo das Protein codierende Gen inaktiviert oder deletiert ist, wird das Protein hier immer noch als "endogen" bezeichnet.

Der Begriff "heterolog" wie hier verwendet in Bezug auf eine Nukleotidsequenz, eine Expressionskassette oder ein Konstrukt, oder ein Element oder Teil von einer der vorgenannten, eine Aminosäuresequenz oder ein Protein, bezieht sich auf eine Verbindung die entweder fremd ist zu einer gegebenen Wirtszelle, d.h. "exogen", wie nicht vorkommend in der Natur in besagter Wirtszelle; oder die natürlich vorkommt in einer gegebenen Wirtszelle, z.B., ist "endogen", jedoch, im Kontext eines heterologen Konstrukts oder integriert in solch heterologes Konstrukt, z.B., anwendend eine heterologe Nukleinsäure fusioniert oder in Verknüpfung mit einer endogenen Nukleinsäure, wodurch das Konstrukt heterolog wird. Die heterologe Nukleotidsequenz wie endogen vorkommend kann in einer unnatürlichen, z.B., größer als erwarteten oder größer als natürlich vorkommenden, Menge in der Zelle hergestellt werden. Die heterologe Nukleotidsequenz, oder eine Nukleinsäure umfassend die heterologe Nukleotidsequenz, unterscheidet sich möglicherweise in der Sequenz von der endogenen Nukleotidsequenz, aber kann noch immer dasselbe Protein codieren wie endogen vorkommend. Spezifischerweise sind heterologe Nukleotidsequenzen solche die in der Natur nicht in der gleichen Beziehung zu einer Wirtszelle vorkommen. Jede rekombinante oder künstliche Nukleotidsequenz wird verstanden heterolog zu sein. Ein Beispiel eines heterologen Polynukleotids ist ein Fusionsprodukt einer Nukleotidsequenz codierend eine FLS die fusioniert ist mit einer PTS-codierenden Nukleotidsequenz mit der die jeweilige endogene, natürlich vorkommenden FLScodierende Sequenz normalerweise nicht fusioniert ist, oder eine Nukleotidsequenz funktionsfähig verknüpft mit einem Promotor mit dem die jeweilige endogene, natürlich vorkommende Nukleotidsequenz normalerweise nicht funktionsfähig verknüpft ist.

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Der Begriff "Formolase", abgekürzt FLS, wie hier verwendet bezieht sich auf ein Enzym das die Carboligation von drei 1-Kohlenstoff Formaldehyd-Molekülen zu einem 3-Kohlenstoff Dihydroxyaceton-Molekül katalysiert.

Eine FLS kann aus einer natürlichen Quelle stammen, oder kann eine funktionelle Mutante davon sein. Alternativ kann eine FLS ein computer-entworfenes Enzym sein abgeleitet von Benzaldehyd-Lyase (BAL).

Die FLS kann eine von Seq_31 oder Seq_32 umfassen oder daraus bestehen, oder eine funktionelle Variante von jeder der vorgenannten sein. Die FLS kann als ein Derivat von jeder der vorgenannten bereitgestellt werden z.B., ein Fusionsprotein umfassend die FLS-Sequenz und ein PTS.

Der Begriff "Methanol zu Formaldehyd umwandelndes Enzym", abgekürzt "MFCE”", wie hier verwendet bezieht sich auf eine "Alkoholoxidase", abgekürzt "AOX", oder "Methanoloxidase", oder "Methanoldehydrogenase", und bezieht sich auf ein Enzym das die Umwandlung von Methanol zu Formaldehyd katalysiert. Anders als Alkoholdehydrogenasen sind Alkoholoxidasen unfähig die umgekehrte Reaktion zu katalysieren. Bezug wird auf EC 1.1.3.13 (Alkoholoxidase) und EC 1.1.1.1 (Alkoholdehydrogenase) gemacht.

Eine MFCE kann aus einer natürlichen Quelle stammen, wie stammend aus einer methylotrophen Hefe, oder kann eine funktionelle Mutante davon sein. Alternativ kann eine MFCE ein computer-entworfenes Enzym sein abgeleitet von einer funktionellen Oxidoreduktase oder Dehydrogenase.

Die MFCE kann eine von Seq_27, 28, 29 oder 30, umfassen oder daraus bestehen, oder eine funktionelle Variante von jeder der vorgenannten sein. Eine "funktionelle Mutante" oder "funktionelle Variante" eines Enzyms wie FLS oder MFCE, wie hier verwendet bedeutet eine Variante in der mindestens eine Aminosäure unter den Wildtyp-Enzym Aminosäuren substituiert, eingefügt, entfernt oder modifiziert ist, vorzugsweise wobei die Mutation eine begrenzte Anzahl von Punktmutationen (eine Punktmutation ist die Substitution, Insertion, Entfernung oder Modifikation von nur einer Aminosäure in einer Sequenz) ist, wie bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oder 1 Punktmutation(en), und/oder wobei die Enzym-Mutante eine bestimmte Sequenzidentität umfasst mit der Wildtyp-Sequenz, wie mindestens eine von 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität.

Der Begriff "isoliert" wie hier verwendet in Bezug auf ein Polynukleotid,

Nukleinsäuremolekül, Expressionskassetten oder -konstrukte, oder Wirtszellen

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beziehen sich auf solch eine Verbindung die ausreichend von der Umgebung getrennt wurde mit der sie natürlicherweise assoziiert wäre. Jedoch, "isoliert" bedeutet nicht notwendigerweise den Ausschluss künstlicher oder synthetischer Mischungen mit anderen Verbindungen oder Materialien, oder das Vorhandensein von Verunreinigungen die die grundlegende Aktivität nicht beeinträchtigen, und die anwesend sein können, zum Beispiel, aufgrund unvollständiger Reinigung. Isolierte Verbindungen können weiter formuliert werden um Zubereitungen davon herzustellen, und immer noch für praktische Zwecke isoliert werden. Zum Beispiel, ein isoliertes Expressionsprodukt kann mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Hilfsstoffen gemischt werden, wenn in der Diagnose oder Therapie verwendet.

Der Begriff "Metabolit" wie hier verwendet bezieht sich auf ein Produkt von Stoffwechselreaktionen katalysiert von einem oder mehreren Enzymen eines Stoffwechselwegs einer Wirtszelle enthaltend den Weg, und kann Reaktanten-, Produkt- und Cofaktormoleküle besagter Enzyme inkludieren. Metaboliten können auftreten in dem/den gleichen Weg(en) wie der Zell-Stoffwechselweg oder Wegen codierend ein Enzym das die Synthese des Zellwachstums- und/oder Produktivitätsinhibitors oder Zwischenprodukts davon katalysiert oder können in einem verzweigten Weg synthetisiert werden.

Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" wie hier verwendet bezieht sich auf die Assoziation von Nukleotidsequenzen auf einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, z.B., einem Vektor, einer Expressionskassette oder einem Expressionskonstrukt, in einer Weise so dass die Funktion einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen beeinflusst wird durch mindestens eine andere Nukleotidsequenz anwesend auf besagtem Nukleinsäuremolekül. Durch funktionsfähige Verknüpfung wird eine Nukleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz auf demselben Nukleinsäuremolekül gestellt. Zum Beispiel, ein Promotor und/oder ein Genschalter ist funktionsfähig verbunden mit einer Codierungssequenz eines rekombinanten Gens, wenn er in der Lage ist die Expression dieser Codierungssequenz zu beeinflussen. Spezifischerweise können solch funktionsfähig miteinander verknüpfte Nukleinsäuren direkt verknüpft sein d.h., unmittelbar verknüpft, bedeutend ohne zusätzliche Elemente oder Nukleinsäuresequenzen zwischen den Nukleinsäuren. Alternativ kann eine geeignete

Verknüpfungssequenz verwendet werden wie z.B., eine Klonierungsstelle positioniert

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zwischen dem Promotor und/oder Genschalter und einem Gen von Interesse z.B., einem Zielgen.

Eine Promotorsequenz wird in der Regel verstanden funktionsfähig mit einer Codierungssequenz verknüpft zu sein, wenn der Promotor die Transkription der Codierungssequenz steuert. Wenn eine Promotorsequenz nicht nativ assoziiert ist mit der Codierungssequenz, wird ihre Transkription in nativen (Wildtyp-)Zellen entweder nicht durch den Promotor gesteuert oder die Sequenzen werden mit anderen zusammenhängenden Sequenzen rekombiniert.

Der Begriff "Promotor" wie hier verwendet bedeutet sich auf ein Nukleinsäuremolekül zu beziehen das die Expression eines proteincodierenden Polynukleotids (DNA) initiiert, reguliert, oder anderweitig vermittelt oder steuert. Promotor-DNA und/oder codierende DNA kann native DNA sein wie vorkommend oder stammend aus einer Wildtyp-Zelle z.B., aus demselben Gen oder aus verschiedenen Genen, oder kann aus demselben oder verschiedenen Organismen sein, aber kann rekombinant oder künstlich sein. Ein heterologer Promotor kann heterolog sein zu einem zu exprimierenden Polynukleotid und/oder ein künstlicher Promotor, oder ein Promotor der aus der Wildtyp-Wirtszelle stammt, aber positioniert im WirtszellenGenom innerhalb einer heterologen Expressionskassette oder positioniert an einer Stelle wo er nicht natürlich vorkommt in der Wildtyp-Wirtszelle.

Spezifische Promotoren sind regulierbar z.B., induzierbar oder unterdrückbar durch eine Verbindung, oder konstitutiv.

Beispielhafte Promotoren die verwendet werden können für den hier beschriebenen Zweck um die rekombinante FLS in der eukaryotischen Wirtszelle zu exprimieren sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanol-induzierbaren Promotoren, wie dem AOX1 oder AOX2 Promotor, oder einem konstitutiven Promotor wie MDH3, POR1, PDC1, FBA1-1, oder GPM1 (Prielhofer et al. 2017, BMC Sys Biol. 11: 123), oder einer funktionellen Variante jeder der vorgenannten.

Als eine Alternative zu nativen oder Wildtyp-Promotorsequenzen, können funktionelle Varianten von solchen nativen oder Wildtyp-Promotorsequenzen (hier verstanden als Elternpromotoren) verwendet werden, die mindestens eine von 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100 % Sequenzidentität aufweisen und funktionell sind im Steuern der Expression eines Gens in wesentlich ähnlicher Weise, z.B. ein induzierbarer Promotor oder konstitutiver Promotor wie der Elternpromotor

sind, und vorzugsweise etwa die gleiche oder eine erhöhte Promotorstärke haben.

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Spezifischerweise umfasst eine hier beschriebene funktionelle Variante eines Promotors eine gewisse Sequenzidentität mit dem Promotor von dem sie abgeleitet ist, über die volle Länge oder den Teil am 3'-Ende der Promotorsequenz der eine Länge von mindestens 300, 400, oder 500 bp hat, und der funktionell ist um funktionsfähig die Expression des zu exprimierenden Polynukleotids zu steuern, insbesondere mit etwa der gleichen Promotoraktivität (z.B. +/- einer von 50%, 40%, 30%, 20%, oder 10%), obwohl die Promotoraktivität erhöht sein kann auf mehr als 100% verglichen mit dem Promotor von dem sie abgeleitet ist.

Die Promotoraktivität kann bestimmt werden durch Messen der Stärke des Promotors. Die Promotorstärke wird in der Regel verstanden als die Transkriptionsstärke. Es gibt Standardmethoden um die Transkriptionsstärke eines Promotors zu bestimmen, wie durch Messen der Menge an Transkripten, z.B., Anwenden eines Microarrays, oder andernfalls in einer Zellkultur, wie durch Messen der Menge der jeweiligen Genexpressionsprodukte in rekombinanten Zellen. Insbesondere kann die Transkriptionsrate bestimmt werden durch die Transkriptionsstärke auf einem Microarray, Northern Blot oder mit quantitativer RealTime PCR (qRT-PCR) oder mit RNA-Sequenzierung (RNA-seq).

Ein "Methanol-induzierbarer Promotor" wird hier verstanden als ein natürlich vorkommender oder Wildtyp-Promotor steuernd die Expression von Genen des Methanoldissimilationswegs von Organismen, insbesondere von methylotrophen Mikroorganismen.

Für den hier beschriebenen Zweck kann die Expression der rekombinanten FLS durch einen Methanol-induzierbaren Promotor gesteuert werden, wie dem AOX1 oder AOX2 Promotor, oder einer funktionellen Variante von jedem der vorgenannten.

Gemäß dem Methanoldissimilationsweg in methylotrophen Hefen, wie P. pastoris, diffundiert Methanol passiv in das Hefeperoxisom. Dort wird es zu Formaldehyd umgewandelt durch eines von zwei verschiedenen AlkoholoxidaseIsoenzymen (Aox1, Aox2). In einer Wildtyp methylotrophen Hefe, kann Formaldehyd weiter oxidiert werden zu COz in mehreren Schritten über den Methanoldissimilationsweg. Alternativ wird Formaldehyd in den Pentosephosphatweg eingebaut über eine Kondensationsreaktion mit Xylulose-5-Phosphat, eine Reaktion katalysiert von einem spezialisierten Transketolase-Enzym genannt DiHydroxyAcetonSynthase (Das). Diese Reaktion ergibt ein Molekül Dihydroxyaceton (DHA) und ein

Molekül Glyceraldehyd-3-phosphat. Jede dieser Reaktionen findet in Peroxisomen in

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methylotrophen Hefen statt. Als eine Alternative zu solch Wildtyp-Wegen wird Formaldehyd direkt umgewandelt zu DHA durch die rekombinante FLS in einer veränderten Zelle wie hier beschrieben.

Der Begriff "Nukleotidsequenz” oder "Nukleinsäuresequenz" wie hier verwendet bezieht sich entweder auf DNA oder RNA. "Nukleinsäuresequenz"” oder "Polynukleotidsequenz" oder einfach "Polynukleotid" bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen gelesen vom 5' zum 3'-Ende. Er inkludiert Expressionskassetten, selbstreplizierende Plasmide, infektiöse Polymere von DNA oder RNA, und nicht-funktionale DNA oder RNA.

Der Begriff "peroxisomales Targeting-Signal" (PTS) wie hier verwendet bezieht sich auf kurze Nukleinsäuresequenzen, die wenn verknüpft mit oder positioniert innerhalb einer Codierungssequenz, z.B. als eine Nukleotidsequenz codierend ein Cterminales Peptid oder ein N-terminales Peptid von in der Regel 3-9 Aminosäuren, steuert die Expression des Expressionsprodukts auf das Peroxisom der Wirtszelle. Durch solch ein funktionelles PTS, kann ein Enzym verlagert werden in das Peroxisom. Die meisten Organismen inkludierend Pichia pastoris haben zwei verschiedene Targeting-Systeme. Das erste (PTS1) verwendet den Rezeptor Pex5 um das Peroxisom anzusteuern. Das zweite (PTS2) verwendet Pex7 als Rezeptor. Ein funktionelles PTS ist eine Aminosäuresequenz die spezifischerweise erkannt wird von einem der Rezeptoren Pex5 (PTS1) oder Pex7 (PTS2), dabei den Rezeptor aktiviert und die Expression des Gens das mit solchem PTS fusioniert ist zum WirtszellenPeroxisom steuert.

Eine Nukleotidsequenz codierend das PTS1 ist in der Regel verknüpft mit einem Gen am 3'-Ende, so dass das PTS fusioniert ist am Carboxyterminus des jeweiligen Genexpressionsprodukts. Dabei ist der C-Terminus der Aminosäuresequenz des Genexpressionsprodukts direkt verknüpft mit dem N-Terminus des PTS.

Eine Nukleotidsequenz codierend das PTS2 ist in der Regel verknüpft mit einem Gen am 5'-Ende oder integriert in Nähe zum 5'-Ende, so dass das PTS fusioniert ist am —Aminoterminus oder nahe zum —Aminoterminus des jeweiligen Genexpressionsprodukts. Dabei ist der N-Terminus der Aminosäuresequenz des Genexpressionsprodukts direkt verknüpft mit dem C-Terminus des PTS2.

Die folgenden Werkzeuge können verwendet werden um Targeting-Signale in einer gegebenen Proteinsequenz zu bestimmen: PTS1 predictor (Neuberger G,

Maurer-Stroh S, Eisenhaber B, Hartig A, Eisenhaber F. Motif refinement of the

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peroxisomales Targeting signal 1 and evaluation of taxon-specific differences. J Mol Biol. 2003 May 2;328(3):567-79.), oder das PTS-Vorhersagewerkzeug WoLF PSORT (Horton P, Park K-J, Obayashi T et al. WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Res 2007; 35:W585-7.).

Der Begriff "Protein von Interesse" oder "(PO)" wie hier verwendet bezieht sich auf ein Polypeptid oder ein Protein das hergestellt wird mittels rekombinanter Technologie in einer Wirtszelle. Spezifischerweise, kann das Protein entweder ein Polypeptid sein nicht natürlich vorkommend in der Wirtszelle, d.h. ein heterologes Protein, oder kann andernfalls nativ sein zur Wirtszelle, d.h. ein endogenes Protein zur Wirtszelle, aber ist hergestellt, zum Beispiel, durch Transformation oder Transfektion mit einem selbstreplizierenden Vektor enthaltend die Nukleinsäuresequenz codierend das POlI, oder durch Integration mittels rekombinanter Techniken von einer oder mehrerer Kopien der Nukleinsäuresequenz codierend das POI in das Genom der Wirtszelle, oder mittels rekombinanter Modifikation einer oder mehrerer regulatorischer Sequenzen steuernd die Expression des Gens codierend das POl, z.B., der Promotorsequenz.

Der Begriff "Sequenzidentität" einer Variante, eines Homologs oder Orthologs im Vergleich zu einer Elternnukleotid- oder Aminosäuresequenz zeigt den Grad der Identität von zwei oder mehr Sequenzen an. Zwei oder mehr Aminosäuresequenzen können die gleichen oder konservierte Aminosäurereste an einer entsprechenden Position haben, bis zu einem gewissen Grad, bis zu 100 %. Zwei oder mehr Nukleotidsequenzen können die gleichen oder konservierte Basenpaare an einer entsprechenden Position haben, bis zu einem gewissen Grad, bis zu 100 %.

Sequenzähnlichkeitssuche ist eine wirksame und zuverlässige Strategie zum Identifizieren von Homologen mit übermäßiger (z.B., mindestens 50%) Sequenzidentität. Sequenzähnlichkeitssuch-Werkzeuge häufig verwendet sind z.B., BLAST, FASTA, und HMMER.

Sequenzähnlichkeitssuchen können solch homologe Proteine oder Gene identifizieren durch Detektieren übermäßiger Ähnlichkeit, und statistisch signifikanter Ähnlichkeit die gemeinsame Abstammung widerspiegelt. Homologe können orthologe Proteine umfassen, die hier verstanden werden als dasselbe Protein in verschiedenen Organismen, z.B., Varianten solch eines Proteins in verschiedenen Organismen oder

Spezies.

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"Prozentuale (%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf eine Aminosäuresequenz, Homologe und Orthologe hier beschrieben ist definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz die identisch sind mit den Aminosäureresten in der spezifischen Polypeptidsequenz, nach Ausrichten der Sequenz und Einfügen von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen, und nicht berücksichtigend irgendwelche konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Fachpersonen können geeignete Parameter zum Messen der Ausrichtung bestimmen, einschließlich aller Algorithmen erforderlich um maximale Ausrichtung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen zu erreichen.

Für hier beschriebene Zwecke, kann die Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen bestimmt werden unter Verwendung des NCBI BLASTProgramms Version BLASTP 2.8.1 mit den folgenden beispielhaften Parametern: „Program: blastp, Word size: 6, Expect value: 10, Hitlist size: 100, Gapcosts: 11.1, Matrix: BLOSUM62, Filter string: F, Compositional adjustment: Conditional compositional score matrix adjustment“.

Für paarweise Proteinsequenz-Ausrichtung von zwei Aminosäuresequenzen entlang ihrer gesamten Länge kann der EMBOSS Needie Webserver verwendet werden mit Standardeinstellungen (Matrix: EBLOSUME2; Gap open: 10; Gap extend: 0.5; End Gap Penalty: false; End Gap Open: 10; End Gap Extend: 0.5). EMBOSS Needle verwendet den Needleman-Wunsch Ausrichtungs-Algorithmus um die optimale Ausrichtung (einschließlich Lücken) der beiden Eingabesequenzen zu finden und schreibt ihre optimale globale Sequenzausrichtung in eine Datei.

"Prozentuale (%) Identität" in Bezug auf eine Nukleotidsequenz z.B., einer codierenden oder nicht codierenden Nukleotidsequenz, ist definiert als der Prozentsatz von Nukleotiden in einer Kandidaten-Nukleotidsequenz die identisch ist mit den Nukleotiden in der Nukleotidsequenz, nach Ausrichten der Sequenz und Einfügen von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen, und nicht berücksichtigend irgendwelche konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Ausrichtung zum Zweck der Bestimmung der prozentualen Nukleotidsequenz-Identität kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden die innerhalb der Fachwelt sind, zum Beispiel, unter Verwendung Öffentlich verfügbarer Computersoftware. Fachpersonen können geeignete Parameter zum Messen der

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Ausrichtung bestimmen, einschließlich aller Algorithmen erforderlich um maximale Ausrichtung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen zu erreichen.

Für hier beschriebene Zwecke (sofern nicht anders angegeben), kann die Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen bestimmt werden unter Verwendung des NCBI BLAST-Programms Version BLASTN 2.8.1 mit den folgenden beispielhaften Parametern: „Program: blastn, Word size: 11, Expect threshold: 10, Hitlist size: 100, Gap Costs: 5.2, Match/Mismatch Scores: 2,-3, Filter string: Low complexity regions, Mark for lookup table only“.

Der Begriff "rekombinant" wie hier verwendet bedeutet "hergestellt durch oder das Ergebnis von genetischem Engineering". Eine "rekombinante Zelle" oder "rekombinanten Wirtszelle" wird hier verstanden als eine Zelle oder Wirtszelle die genetisch verändert oder modifiziert wurde um eine Nukleinsäuresequenz zu umfassen die nicht nativ zu besagter Zelle war. Ein rekombinanter Wirt kann verändert sein um ein oder mehrere Nukleotide oder Nukleotidsequenzen zu löschen und/oder inaktivieren, und kann _spezifischerweise einen Expressionsvektor oder Klonierungsvektor umfassen enthaltend eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, insbesondere anwendend einer dem Wirt fremden MNukleotidsequenz. Ein rekombinantes Protein wird hergestellt durch Exprimieren einer entsprechenden rekombinanten Nukleinsäure in einem Wirt. Der Begriff "rekombinant" wie hier verwendet in Bezug auf Expressionsprodukte, inkludiert diejenigen Verbindungen die auf rekombinantem Wege hergestellt, exprimiert, kreiert oder isoliert werden, wie isoliert aus einer Wirtszelle transformiert oder transfiziert um die Expressionsprodukte zu exprimieren.

Bestimmte rekombinante Wirtszellen sind "veränderte" Wirtszellen die verstanden werden als Wirtszellen die verändert wurden unter Verwendung von genetischem Engineering, d.h., durch menschliches Eingreifen. Wenn eine Wirtszelle verändert wird um einen bestimmten Weg, Gen oder das entsprechende Protein zu exprimieren, ko-exprimieren oder überexprimieren, ist die Wirtszelle verändert so dass die Wirtszelle die Fähigkeit hat solch Weg, Gen und Protein, jeweils, zu exprimieren in einem anderen Ausmaß verglichen mit der Wirtszelle unter der gleichen Bedingung wie vor der Veränderung, oder verglichen mit den Wirtszellen die nicht verändert sind so dass besagtes Gen oder Protein exprimiert, ko-exprimiert oder überexprimiert wird.

Der Begriff "synthetisch" wie hier verwendet im Kontext mit einem synthetischen

Weg bedeutet einen Weg der rekombinant ist.

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Wie hier beschrieben, wurde festgestellt, dass der Methanolassimilationsweg (Xylulose-Monophosphat-Zyklus, XuMP) kompartimentiert ist in Peroxisomen und Ähnlichkeiten hat mit dem _Calvin-Benson-Bassham-Zyklus und dem Pentosephosphatweg (Rußmayer et al., 2015). Jedoch erfordert dieser Weg mindestens 10 Enzyme um die Umwandlung von Methanol zu DHA zu ermöglichen. Zusätzlich werden drei (3) Mol ATP benötigt für die Umwandlung von drei (3) Mol Formaldehyd zu einem (1) Mol Dihydroxyacetonphosphat (DHAP). Um ATP zu erzeugen muss eine signifikante Menge Methanol dissimiliert werden zu COz2 durch eine Zelle wie P. pastoris erhaltend NADH und damit ATP über die Atmungskette. Die Bildung von Dihydroxyacetonphosphat ist daher nicht so energieeffizient wie der neue hier beschriebene FLS-Weg, der direkt Dihydroxyaceton bilden kann aus drei (3) Mol Formaldehyd. Dann wird nur ein (1) Mol ATP benötigt (statt drei Mol ATP) um Dihydroxyacetonphosphat zu bilden, das ein Zwischenprodukt der Glykolyse ist und damit des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels. Daher wurde ein rekombinanter Weg implementiert in eukaryotische Zellen, insbesondere in Mikroorganismen, um Formaldehyd Umwandlung in Biomasse über die Formosereaktion zu ermöglichen. Dies kann eine energieeffiziente Umwandlung von C1 Bausteinen in Kohlenstoffmoleküle mit mehreren C-C-Bindungen ermöglichen.

In einem spezifischen Beispiel wurde ein FLS-Gen (Version FLS-M3) wie veröffentlicht von (Cai et al. 2021) codon-optimiert für Komagataella phaffii und eine PTS1-Sequenz wurde an den C-Terminus angehängt um die Ausrichtung auf Peroxisomen von K. phaffii zu ermöglichen. Die Codierungssequenz wurde platziert unter der Kontrolle eines starken Methanol-induzierbaren Promotors (entweder pAOX1 oder pDAS2) und Expressionskassetten wurden integriert in einen K. phaffıl Stamm der eine Deletion in DAS1 und DAS?2 hat (Mut: Stamm). Ein Mut: Stamm ist nicht in der Lage auf Methanol als Kohlenstoffquelle zu wachsen. Das Vorhandensein der Expressionskassette kann überprüft werden durch zum Beispiel PCR-Verfahren. Erhaltene Stämme können auf einem Medium mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen und zeigen Formolase-Aktivität in einem zellfreien Extrakt.

Der hier beschriebene Formolase-Weg ermöglicht eine effizientere Nutzung einer C1 (Ein-Kohlenstoff) Kohlenstoffquelle wie Methanol. Methanol ist eine wichtige Kohlenstoffquelle für das Wachstum von methylotrophen Hefen wie Pichia pastoris (Komagataella sp.) um hauptsächlich Proteine und Enzyme herzustellen. Weiters, ist

die Herstellung Einzellen-Proteinen für Lebens- und Futtermittelanwendungen wieder

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im Fokus der Industrie. Mit einer effizienteren Methanol-Assimilation kann eine höhere Ausbeute an den gebildeten Produkten (z.B., Proteine, organische Säuren, DNA, RNA, Lipide, Biomasse, ...) erzielt werden. Weiters, da der Weg effizienter ist wird eine geringere Wärmeentwicklung erwartet, wenn dieser Weg betrieben wird. Kühlung von Bioreaktoren auf z.B., 30°C ist kostenintensiv wenn eine exotherme Reaktion stattfindet.

Formaldehyd ist ein reaktives Molekül, das in vielen Fällen zytotoxisch für Mikroorganismen ist, wenn intrazellulär gebildet in höheren Konzentrationen oder ohne spezialisierte Kompartimentierung in der Zelle. Gemäß einem spezifischen Beispiel um einen Formolase-Weg in vivo zu etablieren, wird ein intrazelluläres Kompartiment der Zelle genutzt (oder erzeugt), wo sowohl Formaldehyd gebildet als auch umgewandelt wird durch Formolase zu Dihydroxyaceton.

Gemäß einem spezifischen Aspekt werden biochemische Reaktionen führend zur Bildung von Formaldehyd im selben Kompartiment platziert wie die FormoseReaktion durchführt durch das Enzym Formolase (FLS) um Dihydroxyaceton aus Formaldehyd zu bilden. Dabei ist ein Kompartiment ein subzellulärer Behälter, der sein Inneres räumlich von der umliegenden Umgebung trennt durch eine biochemische Barriere. Diese biochemische Barriere kann eine Lipidmembran sein, bestehend aus Phospholipiden (z.B., Organellen wie Peroxisomen, Mitochondrien, Vakuolen, endoplasmatisches Retikulum) oder eine künstliche Hülle gebildet aus Proteinstrukturen wie in bakteriellen Mikrokompartimenten.

Der FLS-Weg wie hier beschrieben verwendet Formaldehyd als Substrat oder Zwischenprodukt. Vorzugsweise ist der FLS-Weg räumlich lokalisiert in das gleiche subzelluläre Kompartiment wie dem Peroxisom. Auf diese Weise werden andere zelluläre Verbindungen wie DNA, RNA oder Proteine nicht ungezielt verändert durch Formaldehyd.

Die vorgehende Beschreibung wird besser verständlich mit Bezug zu den folgenden Beispielen. Solche Beispiele sind, jedoch, lediglich repräsentativ für Methoden zur Durchführung einer oder mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung verstanden

werden.

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BEISPIELE

Beispiel 1: Konstruktion einer FLS-Codierungssequenz mit einer peroxisomalen Targeting-Sequenz

Eine verbesserte Version der Formolase (FLS), die als FLS-M3 beschrieben wurde (Cai et al., 2021), wurde auf das Peroxisom von Pichia pastoris ausgerichtet, durch Fusionieren einer peroxisomale Targeting-Sequenz an den C-Terminus des Proteins. Die Targeting-Sequenz, die vom C-Terminus des nativen AOX1 von P. pastoris stammt (im Protein-Dodekamer dargestellt: LGTYEKTGLARF, Seq_19, hier bezeichnet als PTS1), wurde an den C-Terminus der FLS fusioniert (Proteinsequenz: Seq_2), FLS:PTS1 ergebend. Die entsprechende Proteinsequenz wurde codonoptimiert für P. pastoris und die resultierende DNA-Sequenz wurde bei TWIST Bioscience (South San Francisco, CA, USA) bestellt (DNA-Sequenz: Seq_1). Alternativ können auch andere Targeting-Signale für die peroxisomale Lokalisierung zum Protein hinzugefügt werden, was auf den PEX5-Rezeptor (hauptsächlich PTS1) abzielt oder wie PTS2 (über PEX5- oder PEX7-Rezeptor) oder PTS3 (Kempinski et al., 2020). Proteine die eine peroxisomale Lokalisierung zeigen, wurden bereits früher berichtet zusammen mit entsprechenden Targeting-Signalen (Rußmayer et al., 2015).

Die codierende Sequenz wurde bestellt mit flankierenden Bpil (Bbsl)-Stellen und entsprechenden Fusionsstellen (FS2, FS3) um kompatibel mit der zuvor beschriebenen Golden Gate-Klonierungspipeline GoldenMOCS zu sein (Sarkari et al., 2017).

Beispiel 2: Konstruktion von DNA-Kassetten und Erzeugung von FLS

exprimierenden Hefestämmen im Peroxisom

Der Genotyp des elterlichen Stammes (Komagataella phaffüi CBS7435 ADASI, ADAS2, AAOX1T = MUT”) wurde bestimmt durch Amplifikation der CDS von DAS, DAS2, und AOXT aus isolierter genomischer DNA in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) unter Verwendung von Seq_5, Seq_6, Seq_7, Seq_8, Seq_9, Seq_10 als Primer-Oligonukleotidpaare. Die Sequenzierungsergebnisse (Seq_13, Seq_14, und Seq_15) bestätigten die Deletion

der erwähnten Gene im Genom des elterlichen Pichia pastoris MUT" Stammes. Dieser

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Deletionsstamm kann nicht auf Methanol wachsen. Der Methanol-Assimilationsweg (Xylulose-Monophosphat-Zyklus) ist blockiert, wenn beide DAS1/DAS2-Gene deletiert sind (Gassler et al., 2020).

In diesen Stamm Hintergrund wurde das Fusionsprotein FLS::PTS1 exprimiert unter Verwendung eines starken induzierbaren Methanol-Promotors unter Verwendung von pDAS2 oder pAOX1 durch Integrieren entsprechender Expressionskassetten in das Genom.

Die Integrationskassetten (Abbildung 1) wurden konstruiert unter Verwendung einer Golden-Gate-Klonierungsstrategie GoldenMOCS und in elektrokompetente P. pastoris ADAS1, ADAS2 und AAOX1 Zellen transformiert. 5 ug DNA wurden in jede kompetente Zelle transformiert. Die fertig inkubierten Zellen wurden auf YPD-AgarPlatten plattiert mit 500 ug mL” G418 oder 200 ug mL Hygromycin als antibiotische Selektionsmarker.

Nach 48 Stunden Inkubation bei 28°C wurden die einzelnen Kolonien von den Platten gepickt und zweimal auf antibiotischen Platten (Hygromycin, G418) und einmal auf M2 Media + 0.5 % Methanol + 1.5 % Agar ausgestrichen.

Die Transformanten, die auf beiden antibiotischen (Hygromycin oder G418) und Methanolplatten wuchsen wurden ausgewählt. Eine Zellbank von den ausgewählten Stämmen wurde vorbereitet, in 1 mL Aliquoten und bei -80°C gelagert. Die Extraktion der genomischen DNA zur Überprüfung der Integration der Gene von Interesse in das Genom erfolgte durch Aufbrechen der Zellen mit Glasperlen in einem Bead Ruptor Gerät (FastPrep-24, MP Biomedical, 6 m/s), und genomische DNA wurde isoliert unter Verwendung eines Ethanol-Präzipitationsprotokolls (Promega-Kit).

Die Seq_3 und Seq_4 wurden amplifiziert aus Hefe genomischer DNA in PCRReaktionen unter Verwendung von OneTaq DNA-Polymerase (NEB) mit Seq_11 und Seq_12 als die Primer-Oligonukleotide. Die DNA-Fragmente der Größe 4,6 kb für Seq_3 (pDAS2::FLS::HpH") und 4,3 kb für Seq_4 (pAOX1::FLS::G418') wurden erwartet. Das Vorhandensein der genannten Fragmente wurde überprüft auf einem 1% Agarosegel (Abbildung 2). Die positiven P. pastoris Transformanten, die Seq_4 (Abbildung 2, Lane 1-6) oder Seq_5 (Abbildung 2, Lane 7, 9-12) in ihr Genom integriert

hatten wurden ausgewählt und für weitere Experimente verwendet.

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Beispiel 3: Kultivierung von FLS exprimierenden Hefestämmen auf synthetischen Medien beinhaltend Methanol

Eine einzelne Kolonie von jeder der beschriebenen P. pastoris Transformanten von YPD-Agarplatten wurde entnommen und beimpft in Schüttelkolben enthaltend 40 mL YPD-Medium, kultiviert über Nacht bei 28°C in einem Schüttelinkubator bei 200 rpm. Am nächsten Tag wurden die Hefezellen gesammelt bei 5000g, für 5 Minuten und in 20 mL M2-Medium ohne einer Kohlenstoffquelle resuspendiert. Die optische Dichte (OD) wurde bei 600 nm gemessen und die Zellen wurden beimpft zu den 50 mL M2Medien (in 500 mL Weithalskolben mit Watte) enthaltend 5 g L” Methanol um die Ausgangs-OD von 2,5 zu erreichen. Die Kolben wurden inkubiert bei 28°C und 200 rpm. Das Wachstum der Hefekulturen auf Methanol als die einzige Kohlenstoffquelle wurde überwacht über einen Zeitraum von 40 Stunden durch Messung der OD zu den Zeitpunkten dargestellt in Abbildung 3. Die Methanolfütterungsstrategie ist in Tabelle 1 dargestellt. Die erzielte Wachstumsrate ist in Tabelle 2 dargestellt.

Stämme die das FLS exprimieren können auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Kein Wachstum wurde erzielt bei einer leeren VektorKontrolle und dem elterlichen MUT: Stamm auf Methanol. Aus Abbildung 4 ist ersichtlich, dass Stämme die FLS exprimieren eine dichte und knospende Hefekultur auf Methanol unter dem Mikroskop zeigen verglichen mit dem nicht wachsenden elterlichen Stamm.

Medienzusammensetzungen:

YPD-Medien: 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose.

Synthetische Medien (M2 GCitrat gepuffert): Pro Liter; 3.15 g (NH4)zHPO«4, 0.49 g MgSO4.7H20, 0.80 g KCI, 0.0268 g CaCl2.2H20, 22.0 g Zitronensäure-Monohydrat, 1.47 mL Spurensalz (PTMO), 4 mL Biotin (0.1 g L'), 4 mL Thiamin-Hydrochlorid (5 g L1). Der pH-Wert der Medien wurde eingestellt auf 6 durch Zugabe von KaliumhydroxidPellets.

Spurensalzlösung (PTMO): Pro Liter; 5 mL Schwefelsäure (95%-98%), 65 g FeSO4.7H20, 20 g ZnCl2z, 6 g CuSO4.5H20O, 3.36 g MnSO«4.H2O, 0.82 g CoCl2.6H20O, 0.2 g Na2MoO«4.2H2O, 0.08 g Nal, 0.02 g H3BOzs.

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Tabelle 1. Methanolfütterungsstrategie in 40 Stunden Kultivierung von P, pastoris Stämmen in synthetischen M2/Methanol Medien

Zeit (h) MeOH Fütterung 0 0.50%

17 0.60%

19 0

21 0

24 0.50%

40 0.60%

Tabelle 2. Vergleich des Wachstums und der Enzymaktivität des P. pastoris MUT" elterlichen Stammes mit P. pastoris FLS exprimierenden Transformanten

Genotyp Wachstumsrate | FLS (h”) Enzymaktivität ADAS1, ADAS2, AAOX1 0.019 ADAS1, ADAS2, AAOX1, (HpH')+ -0.004 ADAS1, ADAS2, AAOX1, (pDAS2-FLS-HpH')* 0.074 + ADAS1, ADAS2, AAOX1, (pAOX1-FLS-G418')* | 0.13 +

Beispiel 4: Enzymatischer Assay zur Messung der FLS-Aktivität in zellfreien Extrakten

Der enzymatische Test wurde mit einem kolorimetrischen Assayprotokoll durchgeführt (Cai et al., 2021). Nach der Kultivierung in synthetischen Medien, wurden die Hefezellenpellets gesammelt und resuspendiert in HEPES-NaCl-Puffer (100 mM, pH 7.5). Die Zellen wurden aufgebrochen durch Zugabe von Glasperlen in einem Bead Ruptor Gerät (4 m/s). Der zellfreie Extrakt enthaltend das FLS-Enzym wurde getrennt von den Zelltrümmern. Der Enzymaktivität Assay wurde durchgeführt in Mikrotiterplatten. 50 mL Formaldehydlösung (von 20 bis 100 mM reichend) enthaltend 1 mM Thiaminpyrophosphat (TPP) wurde hinzugefügt zu 50 uUL zellfreier ExtraktVerdünnungen. Nach Inkubation bei 30°C, wurden 60 uL der Enzymlösung (0.3 mg

15

20

25

30

35

40

TUO0O5AT -37- A 50597/2022

mL Galaktoseoxidase, 35 U mL” Meerrettichperoxidase) und 50 uL der 8 mM ABTSLösung in jede Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde einer UV/Vis-Messung bei 410 nm unterzogen unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts. Die Blindprobe hatte dieselben oben genannten Reaktionslösungen, aber 50 ul Puffer wurde statt des zellfreien Extrakts hinzugefügt. Der zellfreie Extrakt des elterlichen Stammes (ADAS1, ADAS2, AAOX1) wurde gemessen als negative Kontrolle.

Stämme exprimierend FLS zeigen enzymatische Aktivität für FLS, wenn auf Methanol gewachsen. Keine FLS-Aktivität wird erhalten für eine leere Vektor-Kontrolle

und dem elterlichen MUT- Stamm.

REFERENZEN

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AT TU005ATTechnische Universität WienTechnische Universitaet WienSYNTHETIC FORMOLASE PATHWAY341764 DNAPATsource1..176440/ 104

AT

TU005AT

Technische Universität Wien

Technische Universitaet Wien

SYNTHETIC FORMOLASE PATHWAY

341764 DNAPATsource1..176440/ 104

source

1..1764

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mol_typeother DNA

mol_type

other DNA

organismsynthetic construct

organism

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41 / 104

587AAPATsource1..587mol_typeproteinorganismsynthetic construct42 / 104

source

1..587mol_typeproteinorganismsynthetic construct42 / 104

mol_typeprotein

mol_type

protein

organismsynthetic construct42 / 104

organism

synthetic construct

42 / 104

MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGLHIDTIFQACLDHDVPIID TRHEAAAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANARLDRTPVLFLTGSGALRDDETNTL QAGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMOAIRAALSAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIP DLVLSAHGAHPDPADLDQALALLRKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSML SGLPDAMRGGLVONLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLHTGHGSGQLIPHSAQVIQVDPDACELGR LQGIALGIVADVGGTIEALAQATAQ DAAWPDRGDWCAKVTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHAS QVIAKHVDAGVTVVADGGLTYLWLSEVMSRVKPGGFLCHGYLNSMGVGFGTALGAQVADLEAGR RTILVTGDGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIIMNNQSWGWTLHFOQLAVGPNRVTGTRLENGSYHG VAAAFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVALDPIPPEELILIGMDPFAGSTENLYFQSG ALGTYEKTGLARF

2987 DNAPATsource1..2987mol_type43 / 104

source

1..2987mol_type43 / 104

mol_type43 / 104

mol_type

43 / 104

organismsynthetic construct

organism

synthetic construct

caatctgtggtttgctaaactggaagtctggtaaggactctagcaagtecgttactca aaaagtcataccaagtaagattacgtaacacctgggcatgactttctaagttagcaagtcaccaagagggtcctatttaacgttt ggcggtatctgaaacacaagacttgcctateccatagtacatcatattacctgtcaagctatgetaccccacagaaataccccaa aagttgaagtgaaaaaatgaaaattactggtaacttcaccccataacaaacttaataatttctgtagccaatgaaagtaaaCcCcC cattcaatgttccgagatttagtatacttgcccctataagaaacgaaggatttcagcettecttaccccatgaacagaaatcetteca tttaccccccactggagagatccgceccaaacgaacagataatagaaaaaagaaattcggacaaatagaacactttctcagcc aattaaagtcattccatgcactecetttagetgecgttecateecectttgttgagcaacaccatcgttagccagtacgaaagaggaa acttaaccgataccttggagaaatctaaggcgcgaatgagtttagcctagatatccttagtgaagggttgttccgatacttcteca cattcagtcatagatgggcagctttgttatcatgaagagacggaaacgggcattaagggttaaccgccaaattatataadagaC aacatgtccccagtttaaagtttttetttectattettgtatectgagtgaccgttgtgtttaatataacaagttcgttttaacttaaga ccaaaaccagttacaacaaattataacccctctaaacactaaagttcactettatcaaactatcaaacatcaaaacatggcaat gatcacgggcggagaactggtagttagaacactcattaaggccggtgtggaacatttgtttggtctgcatggtctgcatatagac acaattttccaagcctgettggaccacgatgttcctatcattgacactaggcacgaagccgccgctggacatgctgcecgagggct atgcacgtgctggagctaaattaggcgttgccttagtcaccgccggaggagggttcacaaatgcagttactcccattgetaacg ccagactagatcgaacacctgttttatttctaaccggcagtggtgcattgagagacgacgaaactaatacactgcaggccgga atcgaccaggtcgccatggccgeccctataactaaatgggcacatcgtgttatggcaacagagcatatcccgaggcttgttatg caagcaatccgtgcagctettteagcaccccgtggaccagtettgctagacttaccatgggacattctcatgaatcaaatagatg aggactccgtgattataccagacctecgtactatecgeccacggtgetecatecagacccagetgacctegaccaggcecctagetet gcttagaaaggccgaacgtectgtecategtacteggatcagaagctagtegtactgcacgtaagactgcattaagcgcatttgtc gcagcaactggagtacccgtgttegcagactacgaaggcctgtcaatgttgagcgggscttcctgatgctatgcgaggtggattg gtccagaatctetatteecttegcaaaagctgacgcetgetecggatttggtattgatgttgsgtgcccgtttcggtctacatactgscc acggatcaggacaactgatccctcattetgcacaggtcatccaagttgatcctgacgcttgtgagttgsgacgtctacaggggat tgctttaggaatcgtagccgatgttggtggtacaattgaggcacttgceccaggccaccgcacaagatgccgettggcccgacag 44 / 104

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DNA

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source

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source1..9mol_typeproteinorganismSaccharomyces cerevisiaeRLQSIKDHL 69/ 104

source1..9mol_typeproteinorganismSaccharomyces cerevisiae

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Saccharomyces cerevisiae

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AA

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source1..9mol_typeproteinorganismHansenula polymorpha RLRQIASQA

source1..9mol_typeproteinorganismHansenula polymorpha

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Hansenula polymorpha

source1..663mol_typeproteinorganismKomagataella phaffii

source

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mol_typeprotein

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protein

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Komagataella phaffii

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1..663mol_typeproteinorganismKomagataella phaffii721/104

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organism

Komagataella phaffii

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663AAPATsource1..663731/104

source

1..663731/104

protein

organismCandida boidinii

organism

Candida boidinii

MAIPEEFDVIVEGGGSTGCVIAGRLANVDENLKVLLIENGENNLN NPWVYLPGIYPRNMRLDSKTATFYNSRPSKHLNGRRAIVPQANILGGGSSINFMMYTRASASDYDD WESEGWTTDELLPLMKKFETYQRPCNNRDVHGFDGPIKVSFGNYTYPQCQDFLRACETQGIPYVD DLEDLKTSHGAEQWLKWINRDFGRRSDTAHAFIHSTMRNKENLFLMTNTKVDKVIIEDGRAVAVRT VPSKPIGDSKVSRTFKARKQIVVSCGTVSSPMVLORSGIGEPSKLRAAGVKPIVELPGVGRNFQDHFC YFVPYRIKQDSESFDAFVSGDKEAQKSAFDQWYATGAGPLATNGIEAGVKIRPTEAELATADKAFOQ GWESYFENKPDKPLMHYSVISGFFGDHTRLPPGKYMTMFHFLEYPFSRGWLHISSDDPYAAPDFDP GFMNDDRDMWPMVWAFKKSRETARRMECFAGEPTAFHPHYKVDSPARALEQSAEDTKKVAGPL HLTANLYHGSWSTPIGEADKHDPNHVTSSHINVYSKDIQYTKEDDEAIENYIKEHAETTWHCLGTNS MAPREGNKNAPEGGVLDPRLNVHGVKGLKVADLSVCPDNVGCNTFSTALTIGEKAAVLVAEDLGYS GSELDMEVPOQHKLKTYEQTGAARY

664AA74 / 104

AA

74 / 104

source

1..664mol_typeproteinorganismHansenula polymorpha

mol_typeprotein

mol_type

protein

organismHansenula polymorpha

organism

Hansenula polymorpha

MAIPDEFDIIVGGGSTGCCIAGRLANLDDQNLTVALIEGGENNIN NPWVYLPGVYPRNMRLDSKTATFYSSRPSKALNGRRAIVPCANILGGGSSINFLMYTRASASDYDD WESEGWSTDELLPLIKKIETYQRPCNNRDLHGFDGPIKVSFGNYTYPTCQDFLRAAESQGIPVVDDL EDFKTSHGAEHWLKWINRDLGRRSDSAHAYVHPTMRNKOQSLFLITSTKCDKVIIEDGKAVAVRTVP MKPLNPKKPVSRTFRARKQIVISCGTISSPLVLORSGIGAAHHLRSVGVKPIVDLPGVGENFQDHYCF FTPYYVKPDVPTFDDFVRGDPVAQKAAFDQWYSNKDGPLTTNGIEAGVKIRPTEEELATADEDFRR GYAEYFENKPDKPLMHYSVISGFFGDHTKIPNGKFMTMFHFLEYPFSRGFVRITSANPYDAPDFDPG FLNDERDLWPMVWAYKKSRETARRMESFAGEVTSHHPLFKVDSPARARDLDLETCSAYAGPKHLT

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mol_typeprotein

mol_type

protein

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organism

synthetic construct

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575AAPATsource1..575mol_typeprotein771/104

source

1..575mol_typeprotein771/104

mol_typeprotein771/104

mol_type

protein

organismsynthetic construct

organism

synthetic construct

MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGIHIDTIFQACLDHDVPIIDT RHEAAAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANARTDRTPVLFLTGSGALRDDETNTLQ AGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMQOAIRAALSAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIPDL VLSAHGAHPDPADLDQALALLRKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSMLSG LPDAMRGGLVONLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLNTGHGSGQOLIPHSAQVIQVDPDACELGRLQ GIALGIVADVGGTIEALAQATAQ DAAWPDRGDWCAKVTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHASQV IAKHVDAGVTVVADGGLTYLWLSEVMSRVKPGGFLCHGYLNSMGVGFGTALGAQVADLEAGRRTI LVTGDGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIIMNNQSWGWTLHFOQLAVGPNRVTGTRLENGSYHGVAA AFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVALDPIPPEELILIGMDPFAGSTENLYFQSGA| NSDSeg_sequence> 563AAPATsource78/104

563AAPATsource78/104

source

mol_typeprotein

mol_type

protein

organismPseudomonas fluorescens

organism

Pseudomonas fluorescens

MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGAHIDTIFQACLDHDVPIID TRHEAAAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANAWLDRTPVLFLTGSGALRDDETNTL QAGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMOAIRAALSAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIP DLVLSAHGARPDPADLDQALALLRKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSMLS GLPDAMRGGLVONLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLNTGHGSGQLIPHSAQVIQVDPDACELGRL QGIALGIVADVGGTIEALAQATAQ DAAWPDRGDWCAKVTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHASQ VIAKHVDAGVTVVADGALTYLWLSEVMSRVKPGGFLCHGYLGSMGVGFGTALGAQVADLEAGRRTI LVTGDGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIMNNQSWGATLHFQQLAVGPNRVTGTRLENGSYHGVAA AFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVALDPIPPEELILIGMDPFA

12 AAPATsource1..12mol_typeproteinorganismsynthetic constructGSTENLYFQSGA

AA

PAT

source1..12mol_typeproteinorganismsynthetic constructGSTENLYFQSGA

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mol_typeprotein

mol_type

protein

organismsynthetic construct

organism

synthetic construct

Claims (15)

15 20 25 30 TUO0O5AT -39- A 50597/2022 PATENTANSPRÜCHE

1. Eine eukaryotische Zelle, welche verändert ist, um einen synthetischen Formolase (FLS)-Weg zu exprimieren, umfassend eine rekombinante FLS um

Formaldehyd zu Dihydroxyaceton zu biotransformieren.

2, Die Zelle von Anspruch 1, wobei der FLS-Weg weiters ein oder mehrere Enzyme umfasst um eine C1 Verbindung in Formaldehyd zu biotransformieren, vorzugsweise wobei die C1 Verbindung eine von Methanol, Formiat, Methan, Kohlenmonoxid, oder Kohlendioxid ist.

3. Die Zelle von Anspruch 1 oder 2, wobei der FLS-Weg weiters ein Methanol zu Formaldehyd umwandelndes Enzym ("MFCE"), vorzugsweise eine Alkoholoxidase oder eine Methanol-Dehydrogenase umfasst, um Methanol in Formaldehyd zu

biotransformieren.

4. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 3, welche ist:

a) eine Hefezelle, vorzugsweise aus einer Gattung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pichia, Komagataella, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Ogataea, Yarrowia und Geotrichum, vorzugsweise Pichia pastoris, Komagataella phafflii, Komagataella pastoris, Komagataella pseudopastoris, Saccharomyces cerevisiae, Ogataea minuta, Kluyveromces lactis, Kluyveromyes marxianus, Yarrowia lipolytica oder Hansenula polymorpha, vorzugsweise eine methylotrophe Hefe;

b) eine Zelle von Fadenpilzen, vorzugsweise aus einer Gattung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Neurospora, Rhizopus, vorzugsweise Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Rhizopus oryzae, Penicillium chrysogenum oder Trichoderma reesei;

c) eine nicht-menschliche Primaten-, Menschen-, Nagetier-, oder Rinderzelle, vorzugsweise eine Mausmyelom (NSO)-Zelllinie, eine Chinese Hamster Ovary (CHO)Zelllinie, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, MDCK, NIH3T3, PC12, BHK (Baby Hamster Kidney Cell), VERO, SP2/0, YB2/0, YO, C127, L cell, COS, QC1-3, HEK-293, PER. C6, HeLA, EBI, EB2, EB3, onkolytische oder Hybridom-Zelllinie;

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TUO0O5AT -40- A 50597/2022

d) eine Insektenzelle, vorzugsweise eine Sf9-, MimicTM-Sf9-, Sf21-, High Five(BT1-TN-5B1-4) oder BT1-Ea88-Zelle;

e) eine Algenzelle, vorzugsweise aus der Gattung Amphora, Bacillariophyceae, Dunaliella, Chlorella, Chlamydomonas, Cyanophyta (Cyanobakterien), Nannochloropsis, Spirulina oder Ochromonas; oder

f) eine Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Zelle aus einkeimblättrigen Pflanzen, vorzugsweise Mais, Reis, Weizen, oder Setaria, oder aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, vorzugsweise Maniok, Kartoffel, Sojabohne, Tomate, Tabak, Alfalfa,

Physcomitrella patens oder Arabidopsis.

5. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der FLS-Weg in einer

Organelle der Zelle, vorzugsweise einem Peroxisom oder Mitochondrium, umfasst ist.

6. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die FLS als FLSFusionsprotein exprimiert wird, das die FLS fusioniert mit einem peroxisomalen Targeting-Signal (PTS) umfasst, vorzugsweise wobei das PTS eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SKL, Seq_17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, und 26.

7. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die FLS Seq_31 oder Seq_32, oder eine funktionelle Variante von irgendeiner der vorgenannten umfasst oder daraus besteht, vorzugsweise wobei a) die funktionelle Variante von Seq_31 mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W umfasst, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen, ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu Seq_31;

b) die funktionelle Variante von Seq_32 mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28l, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N, und A480W umfasst, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen, ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität zu Seq_32.

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8. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 7, die eine veränderte Mut Hefe ist, vorzugsweise verändert, um Expression einer Dihydroxyaceton-Synthase (DAS) zu reduzieren im Vergleich zu einer endogenen Expression derselbigen, vorzugsweise

durch eine Deletion von einem oder beiden der DAS1- und DAS2-Gene.

9. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 8, die in der Lage ist eine C1 Verbindung als einzige Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Biomasse und/oder

eines Expressionsprodukts zu verwenden.

10. Eine Methode zur Kultivierung der Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 9 in einer Zellkultur unter Verwendung einer C1 Verbindung als Kohlenstoffquelle, dadurch Biomasse und/oder ein Expressionsprodukt in der Zellkultur erhaltend, vorzugsweise wobei die C:1 Verbindung die einzige Kohlenstoffquelle ist.

11. Die Methode von Anspruch 10, wobei das Expressionsprodukt ein Protein von Interesse (POl) oder ein Metabolit ist, vorzugsweise wobei:

a) das POI ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen-bindenden Protein, einem therapeutischen Protein, einem Enzym, einem Peptid, einem Protein-Antibiotikum, einem Toxin-Fusionsprotein, einem Kohlenhydrat-Protein-Konjugat, einem Strukturprotein, einem regulatorischen Protein, einem Impfstoff-Antigen, einem Wachstumsfaktor, einem Hormon, einem Zytokin, einem Prozess-Enzym ist;

b) der Metabolit eine Aminosäure, eine organische Säure, ein Alkohol, ein Zuckeralkohol, ein Kohlenhydrat, ein Vitamin, ein Amin, ein Aldehyd, ein Keton, oder ein Polyhydroxyketon ist, vorzugsweise wobei der Metabolit aus der Gruppe bestehend aus Milchsäure, Zitronensäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Hexansäure, Adipinsäure, _Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, 2,5Furandicarbonsäure, Asparaginsäure, Glucarsäure, Gluconsäure, Glutaminsäure, Itaconsäure, Lävulinsäure, Acrylsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Butandiol, 1,3Propandiol, 1,2-Propandiol, 2-Amino-1,3-Propandiol, 3-Hydroxybutyrat, Poly-3Hydroxybutyrat, 3-Hydroxypropionaldehyd, 3-Hydroxybutyrolacton, Xylit, Arabinit,

Sorbit, Mannit, Vitamin C, Riboflavin, Thiamin, Tocopherol, Cobalamin,

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Pantothensäure, Biotin, Pyridoxin, Niacin, Folsäure, Diamino-Pentan, Diamino-Hexan und Dihydroxyaceton ausgewählt ist.

12. Eine Methode zur Herstellung von Biomasse und/oder eines 5 Expressionsprodukts in einer Zellkultur unter Verwendung einer Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 9 und einer C1 Verbindung, vorzugsweise wobei die C1 Verbindung

die einzige Kohlenstoffquelle in der Zellkultur ist.

13. Ein Fusionsprotein umfassend eine Formolase (FLS) die an ein 10 peroxisomales Targeting-Signal (PTS) fusioniert ist, vorzugsweise wobei das Fusionsprotein durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist: a) das PTS umfasst eine oder besteht aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SKL, Seq_17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, und 26; 15 b) die FLS umfasst oder besteht aus Seq_31 oder Seq_32, oder einer funktionellen Variante von irgendeiner der vorgenannten, vorzugsweise wobei i.) die funktionelle Variante von Seqg_31 mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28L, W89R, R188H, N283H, A394G, G419N, und A480W umfasst, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen, 20 ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu Seq_31; il.) die funktionelle Variante von Seqg_32 mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 (alle) der Punktmutationen A28l, W89R, L90T, R188H, A394G, G419N und A480W 25 umfasst, vorzugsweise mindestens 3, 4, oder 5 Mutationen, ausgewählt aus W89R, R188H, A394G, G419N, oder A480W, Punktmutationen im Vergleich zu Seq_33, und mindestens eine von 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität zu Seq_32.

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14. Ein Nukleinsäuremolekül codierend das Fusionsprotein von Anspruch 13,

vorzugsweise wobei das Nukleinsäure Molekül codon-optimiert für die Expression in einer eukaryotischen Wirtszelle ist.

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15. Eine Expressionskassette umfassend das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 14 und regulatorische Sequenzen um das Fusionsprotein in einer

eukaryotischen Wirtszelle zu exprimieren.