CN105814198A - 延胡索酸还原酶 - Google Patents
延胡索酸还原酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105814198A CN105814198A CN201480067432.2A CN201480067432A CN105814198A CN 105814198 A CN105814198 A CN 105814198A CN 201480067432 A CN201480067432 A CN 201480067432A CN 105814198 A CN105814198 A CN 105814198A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- seqidno
- sequence
- activity
- variant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
- C12Y103/01006—Fumarate reductase (NADH) (1.3.1.6)
Abstract
本发明涉及具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,其与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比具有经改变的NADP(H)依赖性活性和/或NAD(H)依赖性活性。为了提高二羧酸的生产,可以在宿主细胞内过表达这种变体。
Description
发明领域
本发明涉及具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽。本发明还涉及包含这种变体多肽的编码序列的核酸,涉及包含这种核酸的核酸构建体,涉及包含这种核酸或核酸构建体的重组表达载体,并且涉及包含这种核酸、核酸构建体或表达载体的重组宿主细胞。本发明还涉及一种具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽的生产方法以及一种二羧酸的生产方法。
发明背景
琥珀酸是许多化学品的潜在前体。例如,琥珀酸可以转化为1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁内酯。琥珀酸的另一个衍生产品是聚酯聚合物,它通过连接琥珀酸和BDO而制备。
琥珀酸主要是通过丁烷氢化的石油化学工艺生产。这些工艺被认为是对环境有害的并且成本高。发酵生产琥珀酸可以是琥珀酸生产的有吸引力的替代工艺,其中可以使用可再生原料作为碳源。
已知许多不同的细菌产生琥珀酸,例如Escherichiacoli和Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas物种的瘤胃菌。这些菌株的代谢工程提高了琥珀酸产量和/或产率,或减少了副产物形成。
WO2007/061590公开了丙酮酸脱羧酶阴性酵母,其被丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)转化用于生成苹果酸和/或琥珀酸。
尽管发酵生产琥珀酸已经有所改进,但仍需要用于发酵生产琥珀酸的改良微生物。
WO2009/065778公开了可以通过使用重组真核细胞来提高琥珀酸生产水平,所述重组真核细胞选自酵母和丝状真菌,其包含编码NAD(H)依赖性延胡索酸还原酶的核苷酸序列,该还原酶催化延胡索酸向琥珀酸转化。发现重组真核细胞产生琥珀酸的量高于不包含编码NAD(H)-依赖性延胡索酸还原酶核苷酸序列的真核细胞。
但是,在发酵工艺中实现甚至更高的琥珀酸生产水平将是期望的。
发明概述
本发明涉及具有延胡索酸还原酶(FRD)活性的变体多肽,即延胡索酸还原酶变体。与参照多肽相比,本发明的延胡索酸还原酶变体可以具有一种或多种经改变的,例如改良的性能,所述参照多肽通常具有延胡索酸还原酶活性,特别是关于NADP(H)依赖性活性和/或NAD(H)依赖性活性。与参照多肽相比,NADP(H)依赖性活性与NAD(H)依赖性活性的比率可以被改变。
参照多肽可以是野生型延胡索酸还原酶,例如源于原生动物的野生型延胡索酸还原酶,所述原生动物例如Trypanosomabrucei、Trypanosomacruzi、Leishmaniabraziliensis或LeishmaniaMexicana。该参照多肽可以是延胡索酸还原酶(NADH)EC1.3.1.6。
本发明的变体多肽可以被称为“延胡索酸还原酶(FRD)变体”、“改良的延胡索酸还原酶(FRD)”等等。
根据本发明,提供了具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比,其具有经改变的NADP(H)依赖性活性和/或经改变的NAD(H)依赖性活性。这种变体多肽能够催化延胡索酸向琥珀酸转化。
变体多肽可以在宿主细胞中表达,从而催化延胡索酸向琥珀酸转化。这种宿主细胞产生诸如琥珀酸的二羧酸的量高于表达参照多肽的细胞产生的琥珀酸量。
具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,所述变体多肽具有氨基酸序列,其与包含SEQIDNO:33所示序列的延胡索酸还原酶比对时,包含对应于第1042、1071、1072、1082或1083位的任意氨基酸的至少一种氨基酸残基替换,所述位置参照SEQIDNO:33定义,并且其中,与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比,所述变体具有一种或多种经改变的性能。
本发明还提供了:
-核酸,其包含根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽的编码序列;
-核酸构建体,其包含可操作地连接到能够引导在合适的表达宿主中表达延胡索酸还原酶的一种或多种控制序列的本发明的核酸;
-表达载体,其包含本发明的核酸或核酸构建体;
-宿主细胞,其包含本发明的核酸、核酸构建体或表达载体;
-一种延胡索酸还原酶的生产方法,其包括在适合延胡索酸还原酶生产的条件下培养本发明的宿主细胞,以及任选地回收延胡索酸还原酶;
-一种生产诸如琥珀酸的二羧酸的方法,所述方法包括在适合二羧酸例如琥珀酸产生的条件下发酵本发明的宿主细胞,并且任选地回收二羧酸如琥珀酸。
附图简述
图1示出片段1-8整合的示意图。片段1-8中所示的条纹部分表示独特的导致重组事件的同源重叠区域,如穿过同源区域间的虚线所示。片段1和片段8与染色体XI上的INT59位点是同源的,同源重组导致片段1-8被整合入INT59位点。
图2示出片段9-12整合的示意图。片段9-12中所示的条纹部分表示独特的导致重组事件的同源重叠区域,如穿过同源区域间的虚线所示。片段9和片段12与染色体XV上的INT1位点是同源的,同源重组导致片段9-12被整合入INT1位点。片段11可以被片段13-22置换,片段13-22含有与片段11相同的同源区域。
图3表示FCC变体的NADH和NADPH依赖性延胡索酸还原酶(FRD)活性。所示的是340nmmin1处的吸光度变化的斜率,它是延胡索酸还原酶活性的量度。使用等量的可溶性提取物来测量每个变体的NADH和NADPH依赖性活性,由此可以确定每个变体的突变对辅因子特异性的影响。显而易见的是,相对于参照(野生型蛋白减去C末端SKI),所有包含对增加琥珀酸生产的有益突变的FCC变体(下图所示的变体)均显示显著地改变了的辅因子特异性。在所有情况下,相比于参照,NADH依赖性FDR活性显著降低,在大多数情况下超过三倍。出人意料的是,对于许多FCC变体而言,相对于参照,NADPH特异性增加了50%-100%,表明我们得到除了对NADH还对NADPH显示显著依赖的延胡索酸还原酶变体(而相比于NADH活性,参照没有显著的NADPH依赖性活性)。虚线表示参照FRDg的背景NADPH活性。图3a:完整图。图3b:与图3a中所示相同,只是放大了y-轴的下部区域。标签对应参照活性的值。
图4表示片段10、11、23和24整合的示意图。片段10、11、23和24中所示的条纹部分表示独特的导致重组事件的同源重叠区域,如穿过同源区域间的虚线所示。片段11可以被片段13、16、17、19、21或22替换。片段23和片段24与染色体II上INT12位点的上游和下游区域,YOR071cORF的ATG的上游743bp以及YBL029C-A的ATG的下游618bp是同源的。同源重组导致片段10、11(或13、16、17、19、21或22)、23和24被整合入INT12位点。
图5表示菌株SUC-723中表达的FCC变体的NADH和NADPH依赖性延胡索酸还原酶(FRD)活性。所示的是归一化活性,是由340nm(min-1)处的吸光度变化除以可溶性细胞提取物的总蛋白浓度(mgmL-1)确定,它是延胡索酸还原酶活性的量度。使用等量的可溶性提取物来测量每个变体的NADH和NADPH依赖性活性,由此可以确定每个变体的突变对辅因子特异性的影响。显而易见的是,相对于参照(野生型FRD蛋白减C端SKI),所有包含对于增加琥珀酸生产的有益突变的FCC变体(下图所示的变体)均展示显著地改变了的辅因子特异性。这表现为以下事实:在所有情况下NADH依赖性FRD活性相比于参照显著减少,减少七到十六倍。相对于参照,变体FCC-034的NADPH特异性增加,表明我们生产了菌株SUC-723中的延胡索酸还原酶变体,其除了接受NADH外,还显示显著的NADPH依赖性。FCC_040的辅因子特异性完全转变,相比NADH倾向于NADPH,这表现为:其NADPH活性高于其NADH活性。出人意料的是,改变延胡索酸还原酶(图5)的NAD(P)H辅因子特异性有利于菌株SUC-723(表4)生产琥珀酸。图5a:完整的图。图5b:与图5a所示相同,只是放大了y-轴的下部区域。标签对应参照FRD活性的值。对照SUC-723(没有FRD讯在)的活性对应于提取物的背景活性。所有值都是三次测量的平均值。
图6表示片段25-28整合的示意图。片段25-28所示的条纹部分表示独特的同源重叠区域,该重叠区域引起重组事件,如穿过同源区域间的虚线所示。片段27可以单独被片段29-58替换。片段25和片段28与染色体IX上INT09.01位点的下游和上游区域,YIL009WORF的下游359bp是同源的。同源重组导致片段26和27或29-58中的各个、23和24被整合入INT09.01位点。
图7表示菌株CEN.PK113-7D中表达的FCC变体的NADH和NADPH依赖性延胡索酸还原酶(FRD)活性。所示的是归一化活性,是由340nm(min-1)处的吸光度变化除以可溶性细胞提取物的总蛋白浓度(mgmL-1)确定,它是延胡索酸还原酶活性的量度。使用等量的可溶性提取物来测量每个变体的NADH和NADPH依赖性活性,由此可以确定每个变体的突变对辅因子特异性的影响。显而易见的是,相对于参照(野生型FRD蛋白减C端SKI),均展示显著地改变了的辅因子特异性。这表现为以下事实:在所有情况下NADH依赖性FRD活性相比于参照显著减少,减少四到十五倍。出人意料的是,几个变体的辅因子特异性从NADH完全转换到NADPH,即FCC_097、098、105、106、107、108和109。这些变体对于延胡索酸还原酶反应的辅因子相比于NADH更倾向于NADPH;NADPH特异性归一化活性为参照的约11倍。出人意料的是,表现为引起这种NADH特异性到NADPH特异性的完全转换的位置是残基1083。这个残基与从较大的芳香族残基到较小的疏水残基(例如异亮氨酸或丙氨酸)的其他残基组合的突变使得辅因子特异性被完全转换。虚线表示参照(背景)NADPH-特异性FRD活性。
序列表说明
SEQIDNO:1示出片段2的核苷酸序列(图1),其包括针对在Saccharomycescerevisiae中的表达密码子对优化的来自Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶。
SEQIDNO:2示出片段3的核苷酸序列(图1),其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自S.cerevisiae的丙酮酸羧化酶(PYC2)。
SEQIDNO:3示出片段4的核苷酸序列(图1),其包括在S.cerevisiae中有功能的KanMX选择标记物。
SEQIDNO:4示出片段5的核苷酸序列(图1),其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自A.niger的推定二羧酸转运蛋白。
SEQIDNO:5示出片段6的核苷酸序列(图1),其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自S.cerevisiae的苹果酸脱氢酶(MDH3)。
SEQIDNO:6示出片段7的核苷酸序列(图1),其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自Escherchiacoli的延胡索酸酶(fumB)。
SEQIDNO:7示出片段10的核苷酸序列(图2),其包括在Saccharomycescerevisiae中有功能的诺尔丝菌素选择标记物。
SEQIDNO:8示出片段11的核苷酸序列(图2),其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自Trypanosomabrucei的延胡索酸还原酶(FRDg)的编码序列,用于。
SEQIDNO:9示出用于生成片段1的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:10示出用于生成片段1的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:11示出用于生成片段2的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:12示出用于生成片段2的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:13示出用于生成片段3的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:14示出用于生成片段3的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:15示出用于生成片段4的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:16示出用于生成片段4的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:17示出用于生成片段5的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:18示出用于生成片段5的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:19示出用于生成片段6的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:20示出用于生成片段6的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:21示出用于生成片段7的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:22示出用于生成片段7的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:23示出用于生成片段8的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:24示出用于生成片段8的引物核苷酸序列(图1)。
SEQIDNO:25示出用于生成片段9的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:26示出用于生成片段9的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:27示出用于生成片段10的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:28示出用于生成片段10的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:29示出用于生成片段12的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:30示出用于生成片段12的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:31示出用于生成片段11(FRDg参照)或片段13-22(FRD变体)的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:32示出用于生成片段11(FRDg参照)或片段13-22(FRD变体)的引物核苷酸序列(图2)。
SEQIDNO:33示出来自的T.brucei的延胡索酸还原酶蛋白的氨基酸序列,其没有C端SKI序列(FRDg参照)。
SEQIDNO:34示出用于生成片段23的引物核苷酸序列。
SEQIDNO:35示出用于生成片段23的引物核苷酸序列。
SEQIDNO:36示出用于生成片段24的引物核苷酸序列。
SEQIDNO:37示出用于生成片段24的引物核苷酸序列。
SEQIDNO:38示出PCR片段25的核苷酸序列,其由靶向CEN.PK113-7D的INT09.01位点的5’整合侧翼序列组成。
SEQIDNO:39示出PCR片段26的核苷酸序列,其包括在Saccharomycescerevisiae中有功能的诺尔丝菌素选择标记物。
SEQIDNO:40示出PCR片段27的核苷酸序列,其包括针对在S.cerevisiae中的表达密码子对优化的来自Trypanosomabrucei的延胡索酸还原酶(FRDg)的编码序列。
SEQIDNO:41示出PCR片段28的核苷酸序列,其由靶向CEN.PK113-7D的INT09.01位点的3’整合侧翼序列组成。
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求书,词语“包含”、“包括”和“具有”及其变体可解释为包含性的。也就是说,这些词语意指可能包括上下文允许但没有具体描述的其它要素或整数。
本文中不使用数量词修饰时是指一个(种)或者一个(种)以上(即,一个(种)或至少一个(种))语法上的物品对象。举例来说,“要素”可意指一个要素或者一个以上的要素。
还原性TCA途径包含两个需要消耗还原能(例如NADH或NADPH)的反应:苹果酸脱氢酶反应(草酰乙酸还原成苹果酸)和延胡索酸还原酶反应(延胡索酸还原成琥珀酸)。
Saccharomycescerevisiae具有两个内源性延胡索酸还原酶FRD1和OSM1。它们位于细胞质和线粒体二者中,也在血浆膜组分中检测到。它们都使用FADH2作为辅因子。然而,没有已知的细胞质FADH2源。与FADH2不同,诸如NADH和NADPH的含烟酰胺的辅因子可以再生,例如,通过糖酵解中的3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADH)或戊糖磷酸途径的氧化分支(NADPH)再生。
因此,引入使用含烟酰胺的辅因子的延胡索酸还原酶可以有利于发酵生产诸如琥珀酸的二羧酸。
目前,唯一已知的使用含烟酰胺的辅因子的延胡索酸还原酶类型来源于Trypanosoma和Leishmania物种,例如Trypanosomabrucei的延胡索酸还原酶基因及其同源物。酵母细胞质中这种FRD与酵母MDH的结合从而形成使用NADH作为辅因子的还原性TCA途径。
将还原性TCA途径中使用的辅因子从NADH变为NADPH可以有以下几种好处,包括:
1.因为细胞内[NADPH]/[NADP]的浓度比高于[NADH]/[NAD]的浓度比,所以热力学驱动力更强;
2.根据代谢产物的浓度检测([NADPH]>[NADH]),底物浓度更高;
3.辅因子再生不与糖酵解偶联;以及
4.通过诸如戊糖磷酸途径的其他途经实现额外的辅因子再生。
根据本发明,提供了具有延胡索酸还原酶(FRD)活性的变体多肽。本发明的变体多肽具有延胡索酸还原酶活性。延胡索酸还原酶活性是将延胡索酸转化成琥珀酸的活性:
琥珀酸+受体<=>延胡索酸+被还原的受体
与具有FRD活性的参照多肽相比,本发明的变体多肽具有经改变的NAD(H)依赖性活性。
这种变体多肽的NAD(H)依赖性活性可以比参照多肽低。
这种变体多肽的NADP(H)依赖性活性可以比参照多肽高。
本发明还提供了具有FRD活性的变体多肽,与具有FRD活性的参照多肽相比,其具有经改变的NADP(H)依赖性活性。
这种变体多肽的NADP(H)依赖性活性可以比参照多肽高。
这种变体多肽的NAD(H)依赖性活性可以比参照多肽低。
参照多肽可以是野生型延胡索酸还原酶,例如源于原生动物的野生型延胡索酸还原酶,原生动物例如Trypanosomabrucei、Trypanosomacruzi、Leishmaniabraziliensis或LeishmaniaMexicana。该参照多肽可以是延胡索酸还原酶(NADH)EC1.3.1.6。具有SEQIDNO:33所示氨基酸序列的FRD可以是合适的参照多肽。
根据本发明的变体多肽可以是非天然存在的多肽和/或可以通过非天然存在的多核苷酸序列编码的。
本文中术语“NADPH依赖性”通常是指酶的优先使用NADPH作为氧化还原辅因子而不是NADH的能力。因此,通常NADPH依赖性酶的活性在辅因子NADPH存在时比辅因子NADH存在时更高,例如,特异性常数(kcat/KM)更高,诸如通过实施例中所述的酶活性检测方法测定,。
本文中术语“NADH依赖性”通常是指酶的优先使用NADH作为氧化还原辅因子而不是NADPH的能力。因此,通常NADH依赖酶的活性在辅因子NADH存在时比辅因子NADPH存在时更高,例如,特异性常数(kcat/KM)更高,通过诸如实施例中所述的酶活性检测方法测定。
本发明变体多肽的活性可以根据实施例4所述的测定。酶对于NADH和NADPH的Vmax和KM可以通过Lineweaver-Burk作图(Lineweaver,H和Burk,D.(1934),"TheDeterminationofEnzymeDissociationConstants".JournaloftheAmericanChemicalSociety56(3):658-666)由v0测定,其中NADH或NADPH的浓度例如从25μΜ至400μΜ变化。
与参照多肽相比,本发明变体多肽可以显示NADP(H)活性相对于NAD(H)活性的增加。也就是说,与参照多肽相比,变体多肽可以显示NADP(H)活性到NAD(H)活性配给的下降。
本文中,本发明的变体多肽可以成为“FRD变体”、“FRD变体多肽”、“变体”、“变体多肽”或“FCC”或“FCC多肽”等等。
本发明的FRD变体多肽(例如具有本文中一种或多种替换的变体)可以与参照FRD多肽(如SEQIDNO:33所示的FRD)有至少约60%、70%、80%的同一性,例如与参照多肽至少约85%的同一性,如与参照多肽至少约90%的同一性,与参照多肽至少约95%的同一性,与参照多肽至少约98%的同一性,或与参照多肽至少约99%的同一性。这种变体通常会具有表1、2、4、5或6任一中所示的一种或多种替换或替换的集合。
本发明的FRD变体通常会保留FRD活性。也就是说,本发明的FRD变体通常能够催化上述反应,尽管其辅因子特异性相对于参照多肽被改变。
优选地是,与参照多肽相比,从其衍生的本发明FRD变体多肽通常显示改进的性能,通常在经改变的辅因子特异性方面。当该变体作为以下用途时,例如,二羧酸的生产方法中(通过表达FRD),这种提高的性能通常是有关的。
因此,本发明的FRD变体是通常能够增加重组微生物产生二羧酸的变体,该重组微生物能够产生所述二羧酸。也就是说,与过表达宿主多肽(如SEQIDNO:33所示的FRDg)的宿主细胞相比,本发明的FRD变体多肽在宿主细胞中过表达通常会导致二羧酸生产增加。
相对于参照FRD其性能提高的FRD变体是表现出相关性能可测量的降低或升高的变体,即NAD(H)依赖性或NADP(H)依赖性活性,通常使得该FRD变体更适合用于以下用途,例如用于二羧酸的生产方法。
FRD变体多肽包含氨基酸序列,该氨基酸序列具有与参照多肽相比的一种或多种氨基酸替换、缺失和/或插入,和/或与参照多肽相比的一种或多种截短。FRD变体多肽可以包含本文所述的一种或多种替换。
具有FRD活性的变体多肽,例如以上所述的,所述变体多肽具有氨基酸序列,其与包含SEQIDNO:33所示序列的延胡索酸比对时,包含对应于第1042、1071、1072、1082或1083位中任意氨基酸的至少一种氨基酸残基替换,所述位置参照SEQIDNO:33定义,并且其中与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比,该变体具有一种或更多种经改变的性能。
因此,在一个或多个所述位置上的氨基酸被与参照序列的那个位置上出现的氨基酸不同的氨基酸置换(参照SEQIDNO:33定义位置)。
1042位置上的替换(参考SEQIDNO:33所定义的)通常会是极性氨基酸,例如,非带负电荷的氨基酸,例如带正电荷的氨基酸。合适的带正电荷的氨基酸包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)。其他合适的极性氨基酸是谷氨酰胺(Q)。
1071位置上的替换(参考SEQIDNO:33所定义的)通常会是小氨基酸。合适的小氨基酸包括苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)和天门冬氨酸(D)。
1082位置上的替换(参考SEQIDNO:33所定义的)通常会是带正电荷的氨基酸。合适的带正电荷的氨基酸包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)。
1083位置上的替换(参考SEQIDNO:33所定义的)通常会是小疏水残基。合适的较小氨基酸包括异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)。
以上多种类型的氨基酸参照例如Betts和Russell,BioinformaticsforGeneticists,Barnes和Gray编,Wiley2003进行分类。
更详细地,变体多肽可以包含:
参照SEQIDNO:33所定义的第1042位上的R、K或Q;
参照SEQIDNO:33所定义的第1071位上的T或S;
参照SEQIDNO:33所定义的第1072位上的K;
参照SEQIDNO:33所定义的第1082位上的K或R;或者
参照SEQIDNO:33所定义的第1083位上的Y、I或A;
这种变体多肽可以被改变从而使得改变的性能是改变NAD(H)依赖性活性,例如减少的NAD(H)依赖性活性,和/或改变的NADP(H)依赖性活性,例如增强的NADP(H)依赖性活性。
根据前述权利要求任一所述的变体多肽,其包含除了上述五个位置以外的其他替换,例如一种或多种其他替换、添加或缺失。
本发明的变体可以包含不同类型的这种改变的组合。变体可以包含一种、二种、三种、四种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种或更多这种改变(它们可以都是同一种类型的改变或可以是不同类型的改变)。通常,其他改变可以是替换。
根据前述权利要求任一所述的变体多肽参考表1、2、4、5或6定义。也就是说,与合适的参照序列例如SEQIDNO:33所示的相比,变体多肽可以包含表1、2、4、5或6中所示的替换的任意组合。
通常,变体多肽可以包含SEQIDNO:33的序列,但其在第1042、1071、1072、1082或1083位中的一个或多个处存在与SEQIDNO:33该位置处所存在的不同的氨基酸(即该变体多肽包含第1042、1071、1072或1083位的一个或多个位置上的替换)。也就是说,该变体多肽可在1042位置处具有谷氨酸以外的其他氨基酸,和/或在1071位置处具有天门冬酰胺以外的其他氨基酸,和/或在1072位置处具有精氨酸以外的其他氨基酸,和/或在1082位置处具有甘氨酸以外的其他氨基酸,和/或在1083位置处具有苯丙氨酸以外的其他氨基酸。
表1:突变的延胡索酸还原酶,与参照序列(SEQIDNO:33)相比,其在以下所示的
氨基酸位置处含有突变。与使用参照序列(SEQIDNO:33)相比,这些序列可以有助于进一
步增加琥珀酸滴度。
与参照多肽相比,变体多肽的FRD活性通常会改变。一般来说,改变的活性可以用改变的辅因子依赖性来定义。这种NAD(H)依赖性或NADP(H)依赖性活性可以被改变,例如减少(在NAD(H)依赖性活性的情况下)至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。或者,性能可以增加(在NADP(H)依赖性活性的情况下)至少10%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。
此上下文中的百分比的减少或增加表示相对于参照FRD多肽(例如SEQIDNO:33)的百分比减少或增加。如何可以测量百分比变化是本领域技术人员公知的——其是活性的比较,例如,根据实施例所述的或如MiuraA.等,J.Bacteriol190:7170-717对参照FRD和变体FRD的NAD(H)依赖性或NADP(H)依赖性活性进行测量。
改变的活性可以对于以下定义:当宿主细胞中过表达变体FRD时二羧酸的生产比等价宿主细胞过表达参照多肽(例如SEQIDNO:33)时的生产水平提高。变体FRD可能够使生产水平增加至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少100%或更多。生产水平可以用g/L表示,从而二羧酸生产水平的增加将通过以g/L为单位的更高的生产水平来表示。
本文所用的词语“多肽”是包含超过约七个氨基酸残基的链。本文所有的多肽序列都是从左到右书写,并从氨基末端到羧基末端的方向书写。本文所用的氨基酸单字母代码是本领域公知的,可以在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)中找到。
本发明的FRD变体多肽可以是分离形式的,例如基本上分离的形式。“分离的”多肽或蛋白是指从其天然环境中移取的多肽或蛋白。例如,重组产生的多肽和宿主细胞表达的蛋白被认为是对于本发明的目的分离的,已经通过任何合适的技术基本被纯化重组多肽也是如此。根据本发明的FRD变体多肽可以通过本领域已知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化。
本发明的FRD变体多肽包括化学合成方法的产物,以及通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物,原核或真核宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产程序所使用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的多肽,或可以是非糖基化的多肽。另外,本发明的多肽还可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基,在某些情况下,其由宿主介导过程产生。
本发明的特征还在于:根据本发明FRD多肽变体的生物活性片段。这种片段被认为是术语“本发明的FRD变体”所涵盖的。
本发明FRD多肽变体的生物活性片段包括多肽,该多肽所包含的氨基酸序列与本发明变体蛋白的氨基酸序列足够相同或源自本发明变体蛋白的氨基酸序列,其包含比全长蛋白更少的氨基酸,但展示至少一种相应全长蛋白的生物活性。通常,生物活性片段包含具有本发明变体蛋白的至少一种活性的结构域或基序。本发明FRD变体的生物活性片段可以是多肽,举例而言,其具有10、25、50、100或更多的氨基酸长度。而且,其中蛋白其他区域缺失的其他生物活性部分可以通过重组技术来制备,并针对一种或多种天然形式的本发明多肽的生物活性进行评价。
通常,本发明FRD变体的蛋白片段将包含本文所述的一种或多种替换。
本发明的特征还在于:编码以上生物活性片段的核酸片段(这种生物活性片段本身就是本发明的变体)。
优选地是,本发明的FRD变体缺少过氧化物酶体或线粒体靶向信号,该信号用于在合适的宿主细胞中表达编码核苷酸序列后酶的细胞质活性。
本发明提供多核苷酸,其包含本发明FRD变体多肽的编码序列(及其生物活性片段)。本发明还涉及编码本发明FRD多肽变体的至少一个功能性结构域的分离的多核苷酸。通常,这种结构域会包含本文所述的一种或多种替换。
本发明的核酸分子可以使用本领域技术人员公知的标准分子生物学技术与本文所提供的序列信息来生成。例如,使用标准合成技术,所需的核酸分子可以通过PCR生成或从头合成。这种合成过程通常会是自动化的过程。
与参照FRD的编码核酸相比,本发明的核酸可以包含一种或多种缺失,即缺口。这种缺失/缺口也可以使用恰当的寡核苷酸的定点突变来生成。生成这种缺失的技术是本领域技术人员公知的。
并且,与根据本发明的核苷酸序列对应的寡核苷酸或能与根据本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸可以通过标准合成技术来生成,例如,使用自动化DNA合成仪。
另外,本发明包括互补核酸及反义核酸。与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与该另一核苷酸序列足够互补,使得它可以与该另一核苷酸序列杂交从而形成稳定二链体的核酸分子。
本发明的一个方面涉及分离的核酸分子,其编码本发明的变体多肽或其生物活性片段或结构域,以及足以用作杂交探针的核酸分子,其用来鉴定本发明多肽的编码核酸分子,和适合用作扩增或突变核酸分子的PCR引物的这种核酸分子的片段,例如用于制备本发明的核酸分子。
“分离的核酸”或“分离的多核苷酸”是没有与在其所衍生的生物体内天然存在的基因组中与其直接邻接(一个在5’端,一个在3’端)的两个编码序列直接邻接的DNA或RNA。因此,在一个实施方式中,分离的核酸包括部分或全部5’非编码(如启动子)序列,这些序列与编码序列直接邻接。因此该术语包括,例如,重组DNA,其整合入到载体中,整合入到自主复制质粒或病毒中,或整合入到原核生物或真核生物的基因组DNA,或它作为独立于其他序列的单独分子存在(如通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。它还包括作为编码其他多肽的杂合基因的一部分的重组DNA,该其他多肽基本上没有细胞物质、病毒物质、或培养基质(当通过重组DNA技术生产时)或者化学前体或其他化合物(当通过化学合成时)。此外,“分离的核酸片段”是非天然地作为片段存在的核酸片段,并且在自然状态下找不到。
如本文中所使用的,术语“核酸”、“多核苷酸”、或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA),RNA分子(例如,mRNA)以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链DNA,优选是双链DNA。核酸可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如,肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成。这种寡核苷酸可以用来,例如,制备具有改变的碱基配对能力或具有增强的核酸酶抗性的核酸。
本发明还涉及核酸构建体,其包含编码本发明变体多肽的核酸序列并可操作地与使得该核酸序列在宿主细胞中表达的控制序列连接。该核酸构建体可以整合入载体中,例如表达载体和/或整合入宿主细胞,从而影响该变体多肽的表达。
本文所使用的术语“核酸构建体”是指单链或双链核酸分子,其从天然存在的基因分离,或更常见的是,其已被修饰以包含核酸区段,这些核酸区段组合和并列的方式不会存在在自然界中。当核酸构建体包含所有表达编码序列所需的控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义词,其中所述控制序列可操作地连接到所述编码序列。
如本文所使用的,术语“可操作地连接”是指以功能性关系的多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列与另一核酸序列发生功能关系时,其被“可操作地连接”。举例来说,当启动子或增强子影响到编码序列的转录时,其被可操作地连接到该编码序列
如本文所使用的,术语“启动子”是指核酸片段,其作用是控制一个或多个基因的转录,相对于基因的转录起始位点的转录方向,其位于上游,并且,通过有DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和本领域技术人员已知的任何其他DNA序列的存在进行结构鉴定。“组成型”启动子是在大多数环境和生长条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是环境或发育调控下有活性的启动子。
可用来表达编码诸如NAD(H)依赖性延胡索酸还原酶的酶或任何其他本发明真核细胞中引入的酶的核苷酸序列的启动子对于编码待表达的酶的核苷酸序列可以不是天然的,即,对于可操作地与其连接的该核苷酸序列(编码序列),启动子是异源的。优选地是,该启动子是同源的,即对于宿主细胞是内源性的。
本上下文中的合适启动子包括组成型和诱导型天然启动子以及工程化启动子,其对于本领域技术人员是公知的。真核宿主细胞中的合适启动子可以是GAL7、GAL10、或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其他合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。
通常编码酶的核苷酸序列包含终止子。在真核细胞中有功能的任何终止子可以在本发明中使用。优选的终止子是从宿主细胞的天然基因中获得。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地是,这种终止子与防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA降解的突变相结合(例如参见Shirley等,2002,Genetics161:1465-1482)。
本发明还涉及载体,优选地是表达载体,其包含本发明的核酸或核酸构建体(即包含本发明变体FRD多肽的编码序列)。
为了方便ISP的表达和/或翻译,编码ISP的核酸序列可以包含在表达载体中,使得编码ISP的基因可操作地连接到用于体外或本发明宿主细胞内表达和/或翻译的合适控制序列。也就是说,本发明提供表达载体,其包含本发明的核酸或核酸构建体。
表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),它可以方便地进行重组DNA过程,可以引起编码FRD变体多肽的多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与其待被引入的细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体,即,载体作为染色体外的实体存在,载体的复制不依赖于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。如果想用于真菌来源的宿主细胞时,合适的附加体核酸构建体可以例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等,1991,Biotechnology9:968-975),或AMA质粒(Fierro等,1995,CurrGenet.29:482-489)。
或者,表达载体可以是如下表达载体:当其引入宿主细胞时,被整合入基因组中并与其整合的染色体一起被复制。该整合性克隆载体可以在随机位点或预定目标位点处整合入宿主细胞的基因组中。在本发明的一个优选实施方式中,该整合性克隆载体包含DNA片段,其与宿主细胞基因组的预定目标位点的DNA片段是同源的,用于将克隆载体靶向整合到这个预定位点。为了促进靶向整合,克隆载体优选地在细胞转化前进行线性化。优选地进行线性化,使得克隆载体的至少有一端但最好是两端的侧翼为与目标位点同源的序列。目标位点侧翼的同源序列的长度优选地是至少20bp、至少30bp、至少50bp、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb或更长。通过增强宿主细胞的同源重组能力来增加靶向整合入宿主细胞基因组的效力,即整合入预定目标位点。
与目标位点同源的克隆载体中的同源侧翼DNA序列衍生自高表达位点,这意味着其衍生自能够在宿主细胞中高表达的基因。本文所定义的能够高水平表达的基因即高表达基因是在例如诱导条件下其mRNA可以构成至少0.5%(重量/重量)的细胞总mRNA的基因,或是其基因产物可以构成至少1%(重量/重量)的细胞总蛋白的基因,或在分泌的基因产物情况下,可以分泌到至少0.1g/l的水平。
核酸构建体或表达载体可以在本发明的宿主细胞内进行体内组装,并且任选地是,以单一步骤整合入细胞的基因组中(例如参见WO2013/076280)。
多于一个拷贝的本发明核酸构建体或表达载体可以被插入到丝状真菌宿主细胞中,以增加由包含在该核酸构建体中的核酸序列编码的FRD变体多肽的产生(过表达)。优选地是,这可以通过在其基因组整合入两个或更多个核酸拷贝来实现,更优选地是,通过将核酸靶向整合在如上所述的高表达位点处来实现。
本领域的技术人员将理解,表达载体的设计取决于这样的因素,例如,待转化的宿主细胞、期望的蛋白表达水平,等等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞,从而产生由本文所述的核酸编码的蛋白或肽(例如,SEQIDNO:33的FRD变体,例如,功能等同物或片段,或包含一种或多种这样变体的融合蛋白)。
本发明的核酸构建体和载体可以设计用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的FRD变体多肽。
本发明的核酸构建体和/或表达载体可以通过常规的转化或转染技术引入原核或真核细胞。如本文所使用的,术语“转化”和“转染”意在指多种本领域公知的用于在本领域技术人员公知的宿主细胞中引入外源核酸(如DNA)的技术。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)),Davis等人,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)以及其他实验手册中找到。
本文所用的术语“功能等同物”和“功能性变体”是可以互交换的。根据本发明的功能等同物是分离的核酸片段,其编码展示本文所述的FRD变体的特定功能的多肽。因此,功能等同物还涵盖生物活性片段,并其本身涵盖在本发明的术语“FRD变体”中。
优选地是,本发明的功能等同物包含本文所述的一种或多种替换。但除了上述替换外,功能等同物还可以包含一种或多种修饰。
功能性核酸等同物通常可以含有沉默突变或不改变编码的FRD变体多肽的生物功能的突变。相应地,本发明提供编码变体FRD蛋白的核酸分子,其含有对于特定生物活性即FRD活性是非必需的氨基酸残基的变化。
这种FRD变体蛋白的功能等同物的氨基酸序列与其所源自的亲代FRD变体序列不同,但仍保留亲代FRD变体序列的至少一种生物活性,优选地它们保留至少FDR活性。本领域技术人员将认识到可以通过突变在根据本发明的核苷酸序列中引入改变,从而在基本上不改变这种蛋白功能的情况下使所产生的蛋白的氨基酸序列发生改变。
在一个实施方式中,分离的核酸分子包含编码蛋白的核苷酸序列,其中该蛋白所包含的氨基酸序列与亲代FRD变体或与参照氨基酸序列(例如,SEQIDNO:33中所示的序列)具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。
相应地,本发明FRD变体的功能等同物优选是蛋白,该蛋白所包含的氨基酸序列与亲代FRD变体氨基酸序列或参照多肽序列(例如,SEQIDNO:33中所示的序列)具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性,并且通常还保留了亲代FRD多肽的至少一种功能活性。
本发明的变体FRD多肽可以通过筛选合适参照多肽的突变体(例如替换突变体)的文库进行鉴定。当在宿主细胞内表达时,候选突变体可以根据它们增加的二羧酸产生(例如琥珀酸生产)能力进行筛选(与表达参照多肽的宿主细胞相比)。
根据本发明的核酸片段可以包含不编码功能性多肽的序列或由其组成。这种核酸可以用作探针或PCR反应的引物。
不管是否编码功能性或非功能性多肽,根据本发明的核酸可以用作杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明不编码具有FRD活性的多肽的核酸分子的用途尤其包括:(1)原位杂交(例如FISH)至中期染色体压片,以提供精确的FRD编码基因的染色体定位,参见Verma等,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988);(2)检测特定组织和/或细胞中FRDmRNA表达的Northern印迹分析;以及(3)可以用作诊断工具的探针和引物,用来分析在给定生物样品(例如组织样品)中是否存在能够与这种探针和引物杂交的核酸。
给定的参照FRD酶的变体可以通过以下标准过程获得:
-变体的诱变(易错、掺杂寡聚物(dopedoligo)、掺入寡聚物(spikedoligo))或合成
-转化入例如S.cerevisiae
-转化株的培养,转化株的选择
-在例如S.cerevisiae中的表达
-根据例如二羧酸产生进行初筛
-改进变体的鉴定(例如根据改变的辅因子特异性)
在一个实施方式中,本发明涉及一种生产根据本发明的FRD多肽变体的方法,所述方法包括:
a)选择参照FRD多肽;
b)替换对应于1042、1071、1072、1082或1083中任意位置的至少一个氨基酸残基,
所述位置参照SEQIDNO:33定义;
c)任选地替换一个或多个如b)中所定义的其他氨基酸;
d)制备步骤a)-c)得到的变体;
e)确定变体的特性,例如如实施例中所示出的;以及
f)选择其特性与参照FRD多肽相比发生改变的变体,。
在一个优选实施方式中,生产根据本发明的FRD多肽变体的方法中,参照FRD多肽具有SEQIDNO:33所示的序列。
更优选地是,根据本发明的方法的步骤b)中,对应1042、1071、1072、1082或1083中任意位置的至少一个氨基酸残基被替换,
所述位置参照SEQIDNO:33定义。参照多肽可以与SEQIDNO:33具有至少约80%的同源性。
在另一个实施方式中,本发明的特征在于宿主细胞,例如,转化的宿主细胞或重组的宿主细胞,其包含本发明的核酸、核酸构建体或载体。根据本发明的“宿主细胞”或“重组细胞”通常是已通过重组DNA技术将根据本发明的核酸(即编码本发明的FRD的核酸)引入其中(或引入其祖细胞中)的细胞。本发明的背景中,根据本发明的“宿主细胞”或者所述宿主细胞的亲代细胞可以是任何类型的宿主细胞。
根据前述权利要求中任一所述的宿主细胞,其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞。因此,真核细胞和原核细胞都被包括,例如,细菌、真菌、酵母等等,特别优选地是来自酵母的细胞,例如,S.cerevisiaeK.lactis。宿主细胞还包括,但不限于哺乳动物细胞系,例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38以及脉络丛细胞系。
由此本发明提供一种生产FRD的方法,所述方法包括在适合生产FRD的条件下培养本文所述的宿主细胞,并且任选地回收FRD。通常,宿主细胞能够产生诸如琥珀酸的二羧酸。
宿主细胞可以是原核细胞。优选地是,原核细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性微生物和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可以是,举例而言,属于Mannheimia,例如M.succiniciproducens,Actinobacillus,例如A.succinogenes,Anaerobiospirillum,Bacteroides,Succinimonas,Escherichia,例如E.coli。
根据本发明的宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选地是,真核宿主细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。更优选地是,真核细胞是真菌细胞。举例而言,合适的真菌细胞可以属于Saccharomyces,Aspergillus,Penicillium,Pichia,Kluyveromyces,Yarrowia,Candida,Hansenula,Humicola,Issatchenkia,Torulaspora,Trichosporon,Brettanomyces,Rhizopus,Zygosaccharomyces,Pachysolen或Yamadazyma属。举例而言,真菌细胞可以属于以下物种:Saccharomycescerevisiae,Saccharomycesuvarum,Saccharomycesbayanus,Aspergillusniger,Penicilliumchrysogenum,Pichiastipidis,Kluyveromycesmarxianus,K.lactis,K.thermotolerans,Yarrowialipolytica,Candidasonorensis,Candidakruisei,C.glabrata,Hansenulapolymorpha,Issatchenkiaorientalis,Torulasporadelbrueckii,Brettanomycesbruxellensis,Rhizopusoryzae或Zygosaccharomycesbailii.。在一个实施方式中,本发明方法中的真菌细胞是酵母,例如属于Saccharomyces属,如Saccharomycescerevisiae。
具体宿主酵母细胞的示例包括:C.sonorensis,K.marxianus,K.thermotolerans,C.methanesorbosa,Saccharomycesbulderi(S.bulderi),I.orientalis,C.lambica,C.sorboxylosa,C.zemplinina,C.geochares,P.membranifaciens,Z.kombuchaensis,C.sorbosivorans,C.vanderwaltii,C.sorbophila,Z.bisporus,Z.lentus,Saccharomycesbayanus(S.bayanus),D.castellii,C,boidinii,C.etchellsii,K.lactis,P.jadinii,P.anomala,Saccharomycescerevisiae(S.cerevisiae),Pichiagaleiformis,Pichiasp.YB-4149(NRRL命名),Candidaethanolica,P.deserticola,P.membranifaciens,P.fermentans和Saccharomycopsiscrataegensis(S.crataegensis)。K.marxianus和C.sonorensis的合适菌株包括WO00/71738Al、WO02/42471A2、WO03/049525A2、WO03/102152A2和WO03/102201A2中所述。I.orientalis的合适菌株为ATCC菌株32196和ATCC菌株PTA-6648。本发明中,宿主细胞可以是克拉布特里(Crabtree)阴性野生型菌株。克拉布特里效应的定义为高比生长率(长期效应)或高浓度葡萄糖(短期效应)条件下培养时,微生物的氧消耗抑制导致有氧条件下发酵代谢的发生。克拉布特里阴性表型不表现出这种效果,因此即使在高生长率或高浓度葡萄糖存在条件下也能够消耗氧气。
除了编码本发明FRD变体多肽的核酸,本发明的宿主细胞还可以过表达核苷酸序列,其包含以下一种或多种的编码序列:丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、异柠檬酸裂合酶、苹果酸合酶和二羧酸转运蛋白。优选地是,过表达一种或多种这样的酶时,它们在细胞质中是有活性的。
因此,本发明的宿主细胞可以过表达编码内源和/或异源酶的适合同源或异源核苷酸序列,所述酶在细胞内催化反应以增加二羧酸的形成流,二羧酸例如是苹果酸、延胡索酸和/或琥珀酸。
本发明的宿主细胞可以过表达以下所述的内源或异源核酸序列。
宿主细胞可以过表达丙酮酸羧化酶(PYC),丙酮酸羧化酶催化从丙酮酸到草酰乙酸的反应(EC6.4.1.1)。丙酮酸羧化酶在基因表达后在例如细胞质中是有活性的。宿主细胞可以过表达内源或异源丙酮酸羧化酶。
优选地是,本发明的宿主细胞在细胞质中表达编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧激酶的核苷酸序列。优选地是,编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧激酶的核苷酸序列被过表达。该PEP羧激酶(EC4.1.1.49)优选地是异源酶,优选地是源自细菌,更优选地是,具有PEP羧激酶活性的酶源自Escherichiacoli,Mannheimiasp.,Actinobacillussp.,或Anaerobiospirillumsp.,更优选地源自Mannheimiasucciniciproducens。编码PEP羧激酶的基因可以被过表达,可以在真菌细胞的细胞质中表达并有活性。优选地是,根据本发明的酵母细胞是经PEP羧激酶遗传修饰的,该PEP羧激酶与SEQIDNO:1所示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少80、85、90、95、99或100%的序列同一性。
在另一个实施方式中,本发明的宿主细胞过表达丙酮酸羧化酶(PYC),丙酮酸羧化酶催化从丙酮酸到草酰乙酸的反应(EC6.4.1.1)。优选地是,基因表达后丙酮酸羧化酶在细胞质中是有活性的。优选地是,内源或同源丙酮酸羧化酶被过表达。优选地是,根据本发明的宿主细胞是经丙酮酸羧化酶遗传修饰的,该丙酮酸羧化酶与SEQIDNO:2所示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少80、85、90、95、99或100%的序列同一性。
在一个实施方式中,宿主细胞经核酸修饰,该核酸包含编码苹果酸脱氢酶(MDH)的序列,该核酸表达后,苹果酸脱氢酶在细胞质中是活性的。细胞质的表达可以通过过氧化物酶体靶向信号的缺失实现。苹果酸脱氢酶可以被过表达。细胞质MDH可以是任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶,其催化从草酰乙酸到苹果酸的反应(EC1.1.1.37),例如,该酶源自S.cerevisiae。
优选地是,MDH是S.cerevisiaeMDH3,更优选地是其C端SKL缺失,使得其在细胞质内是有活性的。优选地,根据本发明的宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列,该苹果酸脱氢酶与SEQIDNO:4所示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少70%,优选地至少75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。
在另一个实施方式中,本公开的宿主细胞经延胡索酸酶编码基因修饰,该延胡索酸酶催化从苹果酸到延胡索酸的反应(EC4.2.1.2)。包含编码延胡索酸酶的序列的核酸可以有任何合适的来源,优选地是微生物来源,例如,诸如Saccharomyces的酵母,或诸如Rhizopusoryzae的丝状真菌,或诸如Escherichiacoli的细菌。本发明的宿主细胞可以过表达编码延胡索酸酶的核苷酸序列。核苷酸序列表达后,延胡索酸酶在细胞质内可以是活性的,这通过例如去除过氧化物酶体靶向信号来实现。
优选地是,本发明的宿主细胞过表达编码延胡索酸酶的核苷酸序列,延胡索酸酶与SEQIDNO:6所示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少70%,优选至少75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%或100%的序列同一性。
根据本发明的宿主细胞可以在细胞质中表达编码二羧酸转运蛋白,优选地是苹果酸转运蛋白(MAE)的核苷酸序列。优选地是,二羧酸转运蛋白被过表达。二羧酸转运蛋白可以是任何合适的同源或异源蛋白。优选地是,二羧酸转运蛋白是异源蛋白。二羧酸转运蛋白可以来源于任何合适的生物体,优选地来源于酵母或真菌,例如,Schizosaccharomycespombe或Aspergillusniger。优选地是,二羧酸转运蛋白是苹果酸转运蛋白(MAE),其与SEQIDNO:5所示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少80、85、90、95、99或100%的序列同一性。
本发明的宿主细胞可以过表达包含异柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.1)编码序列的核酸,该异柠檬酸裂合酶可以是任何合适的异源或同源酶。异柠檬酸裂合酶可以获得自例如Kluyveromyceslactis或Escherichiacoli。
经遗传修饰的真菌细胞可以进一步过表达包含苹果酸合酶(EC2.3.3.9)编码序列的核酸。苹果酸合酶可以通过例如过氧化物酶体靶向信号的缺失在细胞质中过表达和/或有活性。如果苹果酸合酶是S.cerevisiae苹果酸合酶,那么例如,天然苹果酸合酶通过缺失SKL羧基端序列来改变。
在另一个实施方式中,本发明的宿主细胞可以包含乙醇发酵途径的酶的编码基因的破坏。乙醇发酵途径的酶的编码基因可以是丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1),其催化丙酮酸到乙醛的反应,或醇脱氢酶(EC1.1.1.1),其催化乙醛到乙醇的反应。优选地是,本发明的宿主细胞包含一种,两种或更多种醇脱氢酶的编码基因的破坏。如果真菌细胞是酵母,例如S.cerevisiae,该酵母优选地包含一种或多种醇脱氢酶基因的破坏(adh1adh2、adh3、adh4、adh5)。
作为替代或另外,本发明的宿主细胞可以包含至少一个非功能性的3-磷酸甘油脱氢酶编码基因。本文中使用非功能性的3-磷酸甘油脱氢酶基因是为了描述真核细胞,该真核细胞所包含的3-磷酸甘油脱氢酶活性通过例如3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的突变,破坏或缺失而降低,从而相对于野生型细胞甘油形成减少。
上述这些酶的细胞质内表达可以通过过氧化物酶体或线粒体靶向信号的缺失来实现。过氧化物酶体或线粒体靶向信号的存在可以通过例如Schlüter等人公开的方法进行检测(Schlüter等,NucleidAcidResearch2007,35,D815-D822)。
如本文所使用的,根据本发明的经遗传修饰的酵母定义为含有核苷酸序列或多肽或经核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰的细胞,该核苷酸序列或多肽在酵母细胞中不是天然存在的,或者含有内源核酸序列的一个或多个额外拷贝,或含有内源或同源核苷酸序列的缺失或破坏。本文所使用的野生型真核细胞定义为重组细胞的亲代细胞。
如本文所使用的,术语“基因”和“重组基因”是指核酸分子,其包括编码本文所述的FRD变体或其他酶的开放阅读框。基因可以包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。也就是说,本文所使用的“基因”可以指如本文所定义的分离的核酸分子。因此,在本申请的上下文中,术语“基因”并不仅指天然存在的序列。
当用来表示给定的(重组的)核酸或多肽分子与给定的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时,术语“内源的”理解为表示,在自然中核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或生物体产生,优选地是相同品种或菌株。
当对核酸(DNA或RNA)或蛋白使用时,术语“异源的”是指核酸或蛋白不作为生物体、细胞、基因组或其所在的DNA或RNA序列的一部分天然存在,或该核酸或蛋白在与自然界中发现的其所在的位置不同的细胞内或在基因组位置或DNA或RNA序列中被发现。异源核酸或蛋白对于其所引入的细胞不是内源性的,但已经从另一细胞获得或合成或重组生产。
本发明涉及一种二羧酸的生产方法。术语“二羧酸”和“二羧酸盐”,例如“琥珀酸”和“琥珀酸盐”在本文中是相同的含义,可以互换使用,前者是后者的氢化形式。
根据本发明,由此提供了一种诸如琥珀酸的二羧酸的生产方法,该方法包括在适合诸如琥珀酸的二羧酸生产的条件下发酵如本文所述的宿主细胞,以及任选地回收例如琥珀酸的二羧酸。
在所述方法中,宿主细胞在包含合适发酵培养基的容器中发酵。如本文所使用的术语“发酵”是指化合物的微生物生产,本文中是从碳水化合物生产二羧酸。
优选地是,发酵产物是二羧酸,二羧酸优选地是苹果酸、延胡索酸或琥珀酸或己二酸,优选地是琥珀酸。
本文所定义的分批发酵是发酵中所有营养物质都在发酵开始时添加。
分批补料发酵是分批发酵中营养物质在发酵过程中添加。分批发酵和分批补料发酵的产物可以在合适的时间收获,例如在一种或多种营养物质耗尽时收获。
连续发酵是营养物质持续添加到发酵中并且其中产物持续从发酵中除去的发酵。
在一个实施方式中,本发明方法中宿主细胞的发酵是在碳水化合物限制条件下进行。如本文中所使用的,碳水化合物限制条件的定义是维持碳水化合物的浓度低于10g/l,例如约5g/l。
根据本发明二羧酸的生产方法可以在任何合适的体积和规模下进行,优选地是在工业规模下进行。如本文所定义的工业规模是体积至少10或100升,优选地是至少1立方米,优选地是至少10或100立方米,优选地是至少1000立方米,通常低于10,000立方米。
本发明方法中宿主细胞的发酵可以在任何合适的发酵培养基中进行,该发酵培养基包含合适的氮源、碳水化合物和其他在本发明方法中生长和二羧酸生产所需的营养物质。根据本发明发酵方法中的合适碳水化合物可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖或麦芽糖。
在一个实施方式中,发酵过程是在CO2分压为5%和60%之间的条件下进行,优选地是约50%。
用于二羧酸生产的方法中二羧酸生产过程的pH通常较低。优选地是,用于二羧酸生产的方法中pH为1和5之间,优选地是1.5和4.5之间,更优选地是2和4之间。
在另一个优选的实施方式中,根据本发明的方法包括在有氧条件下与碳水化合物一起预培养宿主细胞的步骤。优选地是,预培养过程中宿主细胞的发酵在pH为4和6之间的条件下进行。优选地是,预培养过程中碳水化合物是非抑制性碳水化合物,优选地是半乳糖。已经发现在非抑制碳水化合物中预培养宿主细胞是有利的,因为它防止葡萄糖抑制的发生,葡萄糖抑制可对生物质的产量产生负面影响。此外,已经发现在有氧条件下预培养宿主细胞的步骤具有更高的生物质产量和更快的生长。优选地是,预培养以分批方式进行。
通常进行生产提高的生物量的繁殖步骤,优选地在碳水化合物限制条件下进行。
二羧酸的生产方法可以在任何合适的温度下进行。例如,合适的温度可以为约10到约40摄氏度之间,例如约15到约30摄氏度之间。
二羧酸的生产方法可以进一步包括回收二羧酸。回收二羧酸可以通过任何合适的方法进行。
在一个实施方式中,如文公开方法生产的二羧酸从发酵培养基中回收。回收二羧酸可以通过任何本领域已知的合适方法进行,例如通过结晶、铵沉淀、离子交换技术、离心或过滤或这些方法的任何合适组合进行。
在一个优选实施方式中,回收二羧酸包括结晶二羧酸并形成二羧酸晶体。优选地是,结晶二羧酸包括去除部分发酵培养基,优选地是通过蒸发去除,得到浓缩培养基。
根据本发明,诸如琥珀酸的二羧酸的回收可以通过使诸如琥珀酸的二羧酸从pH为1和5之间并包含琥珀酸的水溶液结晶而实现,包括蒸发部分的水溶液以得到浓缩溶液,降低浓缩溶液的温度至5和35摄氏度之间,其中形成琥珀酸晶体。优选地是,结晶包括控制浓缩培养基的温度至10和30摄氏度之间,优选地是15和25摄氏度之间。优选地是,发酵培养基的pH为1.5和4.5之间,优选地是2和4之间。
已经发现,诸如琥珀酸的二羧酸在例如10和30摄氏度之间的较高温下结晶所形成的诸如琥珀酸的二羧酸晶体中,诸如有机酸、蛋白、颜色和/或气味等杂质的量比诸如琥珀酸的二羧酸在低于10摄氏度的低温下结晶更少。
在较高温下结晶琥珀酸的另一个益处是冷却水溶液所需的能量比在低于10或5摄氏度下结晶二羧酸的方法更少,其更经济并且是可持续方法。
优选地是,诸如琥珀酸的二羧酸的结晶包括清洗二羧酸晶体的步骤。诸如琥珀酸的二羧酸可以直接从pH为1和5之间的发酵培养基中结晶出来,纯度为至少90%w/w,优选地是至少95、96、97、或至少98%、或99至100%w/w。
优选地是,二羧酸优选琥珀酸的回收包括从发酵培养基去除生物质并结晶二羧酸,优选地是如本文所述的结晶。优选地是,通过过滤去除生物质。
在一个优选实施方式中,二羧酸的生产方法进一步包括在工业过程中使用二羧酸。二羧酸的工业过程可以是作为化妆品添加剂、防冻剂、食品添加剂的应用或者作为(生物)聚合物的构建块。
在一个优选实施方式中,发酵培养基包含琥珀酸,其含量为1g/l和150g/l之间,优选地是5g/l和100g/l之间,更优选地是10g/l和80g/l之间或15g/l和60g/l之间。在任何情况下,与表达参照多肽的等同宿主细胞相比,本发明的宿主细胞通常能够在发酵培养基中积累更多琥珀酸。
在另一个方面,本发明涉及从pH为1和5之间包含琥珀酸的水溶液中结晶琥珀酸的方法,其包括通过蒸发去除部分水溶液,得到浓缩溶液,并控制浓缩溶液的温度至10和30摄氏度之间,其中形成琥珀酸晶体。优选地是,结晶包括控制浓缩溶液的温度至15和25摄氏度之间,优选地是18和22摄氏度之间。优选地是,水溶液的pH为1.5和4.5之间,优选地是2和4之间。水溶液可以是任何包括琥珀酸的合适的溶液。水溶液可以包括可溶性组分和不可溶组分,例如,微生物细胞(微生物细胞的碎片)、蛋白、植物生物质木质纤维素、纤维素等等。优选地是,水溶液是发酵培养基,优选地是,发酵培养基能通过本文所述的二羧酸生产方法获得。
优选地是,根据本发明方法制备的诸如琥珀酸的二羧酸进一步转化成期望的产品。例如,期望的产品可以是聚合物,如聚丁烯琥珀酸(PBS)、防冻剂或表面活性剂。也就是说,本发明提供例如聚合物的产品的生产方法,该产品例如是聚丁烯琥珀酸(PBS)、防冻剂或表面活性剂,这种方法包括:生产本文所述的羧酸,并在所述产品的生产中使用所述二羧酸。
为了实现本发明的目的,此处的定义:为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比,以最佳的比较目的对序列进行比对。为了最优化两个序列间的比对,可以在进行比较的两个序列中任一个引入缺口。在被比较序列的全长上进行这样的比对。或者,对较短长度进行比对,例如约20、约50、约100或更多个核酸/基或氨基酸。序列同一性是在报告的比对区域中两个序列之间的相同匹配的百分比。
标准遗传学技术,例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的基因改造或杂交技术,是本技术领域公知的方法,例如Sambrook和Russel(2001)(MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress),或F.Ausubel等编(”Currentprotocolsinmolecularbiology",GreenPublishingandWileyInterscience,NewYork(1987))所述的。真菌宿主细胞的转化方法、基因改造等从例如EP-A-0635574、WO98/46772、WO99/60102和WO00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265,186中已知。
两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比的确定可使用数学算法实现。技术人员将了解到该事实,若干不同的计算机程序可用来比对两个序列和确定两个序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)Anoverviewofsequencecomparison,D.Sankoff和J.B.Kruskal编,Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,第1-44页AddisonWesley)。两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法计算(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和和核苷酸序列两者均可通过算法比对。已经在计算机程序NEEDLE中实施了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的,使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本,EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)第276-277,页<http://emboss.bioinformatics.nl/>)。对于蛋白质序列,使用EBLOSUM62作为替换矩阵。对于核苷酸序列,使用EDNAFULL。所使用的可选参数为空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解,所有这些不同的参数将得到稍有不同的结果,但是当使用不同算法时,两个序列的总体同一性百分比并未显著改变。
用如上所述的程序NEEDLE进行比对之后,查询序列和本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下:将比对中显示出两个序列中的相同氨基酸或者相同核苷酸的相应位置的数目除以减去比对中的空位总数之后的比对总长度。在本文中定义的同一性可通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE中获得并且在程序的输出中标记为“最长同一性”。
本发明的核酸序列和蛋白质序列还可用作“查询序列”以执行对公共数据库的检索,从而例如识别其它家族成员或相关序列。此类检索可使用Altschul,等.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来执行。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序,得分=100、字长=12来执行,以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序,得分=50、字长=3来执行,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空位比对,可使用如在Altschul等,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的空位化BLAST(GappedBLAST)。当利用BLAST和空位化BLAST程序时,可使用相应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的国家生物技术信息中心的主页。
在本文中对专利文献或者作为现有技术给出的其它事物的引用不应被视为承认文献或事物为在权利要求书中任一项的优先权日时为已知的或者其所含有的信息在权利要求书中任一项的优先权日时为公知常识的部分。
本文提出的每一参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。
本发明通过以下实施例进一步说明:
实施例
实施例1:构建菌株SUC-1099
生成PCR片段
根据制造商的说明书,使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,USA)生成PCR片段。
使用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的引物序列,利用Saccharomycescerevisiae菌株CEN.PK113-7D(MATaHIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2)的基因组DNA作为模板生成PCR片段1,该PCR片段1由5’INT59整合位点组成,见Daran-Lapujade等,(FEMSYeastRes(2003)4:285–296)。
使用SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的引物序列,利用SEQIDNO:1作为模板生成PCR片段2。SEQIDNO:1编码来自Actinobacillussuccinogenes的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCKa),如专利申请WO2009/065780所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该基因序列针对在S.cerevisiae中表达进行密码子对优化,如专利申请WO2008/000632所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即TPI1启动子控制PCKa基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即GND2终止子。
使用SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的引物序列,利用SEQIDNO:2作为模板生成PCR片段3。SEQIDNO:2编码来自Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶(PYC2),如专利申请WO2009/065780所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该基因序列是针对在S.cerevisiae中表达密码子对优化的,如专利申请WO2008/000632所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即PGK1启动子控制PYC2基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即ADH1终止子。
使用SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的引物序列,利用SEQIDNO:3作为模板生成PCR片段4。SEQIDNO:3编码在Saccharomycescerevisiae起作用的KanMX选择标记物,其从质粒pUG7-EcoRV扩增而来。质粒pUG7-EcoRV是质粒pUG6的变体,如Gueldener等(NucleicAcidsRes.1996Jul1;24(13):2519-24)所述,其中存在于pUG6中的loxP的位点变为lox66位点和lox71位点(Lambert等,Appl.Environ.Microbiol.2007Feb;73(4):1126-35.Epub2006Dec1.)。
使用SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的引物序列,利用SEQIDNO:4作为模板生成PCR片段5。SEQIDNO:4编码来自Aspergillusniger的推定二羧酸转运蛋白,如EP2495304所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该基因序列是针对在S.cerevisiae中表达密码子对优化的,如专利申请WO2008/000632所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即ENO1启动子控制DCT_02基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即TEF2终止子。
使用SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示的引物序列,利用SEQIDNO:5作为模板生成PCR片段6。SEQIDNO:5编码来自Saccharomycescerevisiae的苹果酸脱氢酶(MDH3),如专利申请WO2009/065778所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该基因序列是针对在S.cerevisiae中表达密码子对优化的,如专利申请WO2008/000632所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即FBA1启动子控制MDH3基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即GPM1终止子。
使用SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示的引物序列,利用SEQIDNO:6作为模板生成PCR片段7。SEQIDNO:6编码来自Escherichiacoli(E.C.4.2.1.2,UniProt登记号P14407)的延胡索酸酶(fumB)。该基因序列针对在S.cerevisiae中表达优化密码子对的,如专利申请WO2008/000632所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自Kluyveromyceslactis的启动子,即3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子控制fumB基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即TDH1终止子。
使用SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示的引物序列,利用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板生成PCR片段8,PCR片段8由3’INT59整合位点组成。
根据制造商的说明书,使用DNAClean&ConcentratorTM-25试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)纯化PCR片段1至8。
转化至CEN.PK113-7D以构建菌株SUC-1099
通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。S.cerevisiae菌株CEN.PK113-7D用纯化的PCR片段1-8进行转化。PCR片段2-7含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段1和8分别含有在其3'端和5'端的重叠,允许所有八个片段进行同源重组。PCR片段1的5'端和PCR片段8的3'端与INT59位点同源,使得所有八个PCR片段能够在INT59位点上整合(见图1)。由此形成一个线性片段,该线性片段由整合在INT59位点上的PCR片段1-8组成。这个整合方法如专利申请WO2013076280所述。该INT59位点位于染色体XI,YKR092C下游923bp和YKR093W上游922bp。
转化混合物铺在YEPh-琼脂上(每升:10克酵母提取物、20克植物蛋白胨、20克半乳糖、20克琼脂),该培养基每毫升含有100μgG418(SigmaAldrich,Zwijndrecht,TheNetherlands)。30℃条件下培养三天后,各个转化株重新在YEPh-琼脂平板上划线,该平板每升含有20克半乳糖和每毫升100μgG418。通过PCR确定所有引入基因的存在,PCR使用的引物序列可以退火至SEQIDNO:2至SEQIDNO:6所编码的ORF的编码序列。得到的菌株命名为SUC-1099。
实施例2:延胡索酸还原酶转化菌株SUC-1099并在所得的转化株中产生琥珀酸
生成PCR片段
根据制造商的说明书,使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,USA)生成PCR片段。
使用SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示的引物序列,利用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板生成PCR片段9,该PCR片段9由5’INT1整合位点组成。
使用SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示的引物序列,利用SEQIDNO:7作为模板生成PCR片段10。SEQIDNO:7编码在Saccharomycescerevisiae中有功能的诺尔丝菌素选择标志物,其从质粒pUG7-Nat的经修改版扩增而来。pUG7-Nat是质粒pUG6的变体,由Gueldener等(NucleicAcidsRes.1996Jul1;24(13):2519-24)描述,其中pUG6中的loxP位点变成lox66位点和lox71位点(Lambert等人,Appl.Environ.Microbiol.2007Feb;73(4):1126-35.电子出版2006年12月1日),并且其中KanMX标志物由诺尔丝菌素标志物置换(Goldstein和McCusker,Yeast.1999Oct;15(14):1541-53)。
使用SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的引物序列,利用SEQIDNO:8作为模板生成PCR片段11。SEQIDNO:8编码来自Trypanosomabrucei的延胡索酸还原酶(FRDg),如专利申请WO2009/065778所公开的。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。该基因序列是针对在S.cerevisiae中表达优化密码子对的,如专利申请WO2008/000632所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即TDH3启动子控制FRDg基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即TAL1终止子。
使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的引物序列,利用CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板生成PCR片段12,该PCR片段12由3’INT1整合位点组成。
根据制造商的说明书,使用DNAClean&ConcentratorTM-25试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)纯化PCR片段9至12。
转化至SUC-1099
通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。S.cerevisiae菌株CEN.PK113-7D用纯化的PCR片段9-12转化。PCR片段10和11含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段9和12分别含有在其3'端和5'端的重叠,允许所有四个PCR片段进行同源重组。PCR片段9的5'端和PCR片段12的3'端与INT1位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT1位点上整合(见图2)。由此形成一个线性片段,该线性片段由整合在INT1位点上的PCR片段9-12组成。这个整合方法如专利申请WO2013076280所述。该INT1位点位于染色体XV,YOR071c下游659bp和YOR070c上游998bp。这种方法导致如SEQIDNO:33所示的1139个氨基酸的延胡索酸还原酶蛋白的表达,相对于T.brucei天然序列,该蛋白缺少C端氨基酸SKI。
转化株混合物铺在YEPh琼脂上(每升:10克酵母提取物、20克植物蛋白胨、20克半乳糖、20克琼脂),该培养基每毫升含有100μg诺尔丝菌素(JenaBioscience,Germany)。30℃条件下培养三天后,各个转化株重新在YEPh琼脂平板上划线,该YEPh琼脂平板每升含有20克半乳糖和每毫升100μg诺尔丝菌素。通过使用PCR确定引入基因的存在,PCR使用的引物序列可以退火至SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所编码的ORF的编码序列。得到的三种单独菌落命名为PS107#1_#02、PS107#1_#03和PS107#1_#04。
产生琥珀酸
为了确定琥珀酸产生,菌株SUC-1099一式三份培养,转化株PS107#1_#02、PS107#1_#03和PS107#1_#04在使用半乳糖作为C源的微孔板中培养。在产生生物质的生长期后,通过在培养基中重悬细胞开始进行产生试验。产生试验开始时,30g/L琥珀酸被添加到培养基中。培养96小时后取出上清液样品。
流动NMR的样品通过以下制备:从每个培养瓶中取出600微升培养物,并以14,000rpm离心1分钟,50微升上清液移至96深孔MTP板。将450微升内标物(20g/L马来酸、40g/lEDTA的D2O液)和500微升比例为80:20的H2O/D2O添加到每个样品中。用BrukerBESTavanceII500MHz光谱仪检测发酵上清液中包括琥珀酸浓缩物在内的二羧酸以及诸如葡萄糖的其他化合物。27摄氏度下用水抑制脉冲程序记录NMR光谱,松弛延迟为30s。
菌株SUC-1099的上清液中,测量到琥珀酸的平均滴度为30.9g/L。当菌株SUC-1099中引入并过表达FRDg时,测量到琥珀酸的平均滴度为53.5g/L。
实施例3:延胡索酸还原酶变体转化菌株SUC-1099并在所得的转化株中产生琥珀
酸
生成PCR片段
如实施例2所述生成PCR片段9、10和12。
编码如SEQIDNO:33所述的参照延胡索酸还原酶序列的不同蛋白变体的合成核苷酸序列通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。这些合成核苷酸序列编码相对于参照FRDg序列(SEQIDNO:33)在表2所示位置的突变的氨基酸。除了编码表2所示的突变氨基酸,该合成核苷酸序列变体与SEQIDNO:8一致。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即TDH3启动子控制突变FRDg基因(FCC)的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即TAL1终止子。
含有TDH3启动子–突变FRD–TAL1终止子等的合成基因序列进行PCR扩增,扩增使用SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的引物,以生成PCR片段13-22(见表2)。
根据制造商的说明书,使用DNAClean&ConcentratorTM-25试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)纯化PCR片段9、10、12和13-22。
转化至SUC-1099
菌株SUC-1099用各个纯化的PCR片段9、10和12与各PCR片段13-22一起转化。PCR片段10和PCR片段13-22含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段9和12分别含有在其3'端和5'端的重叠,允许所有四个PCR片段进行同源重组。PCR片段9的5'端和PCR片段12的3'端与INT1位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT1位点上整合(见图2)。如实施例2所述转化并选择转化株。
产生琥珀酸
为了确定琥珀酸产生,四个独立的表达突变延胡索酸还原酶序列的SUC-1099转化株如实施例2所述在微孔板中培养和测量琥珀酸滴度。琥珀酸的平均滴度在表2中示出。表达突变延胡索酸还原酶序列的多个SUC-1099转化株的琥珀酸平均产量超过55g/L琥珀酸。这显著高于参照FRDg序列转化的SUC-1099的平均琥珀酸滴度。显著高意味着具有参照延胡索酸还原酶序列和改良的突变延胡索酸还原酶序列的菌株的琥珀酸滴度95%置信区间不重叠。
表2:菌株SUC-1099培养4天后测量生产基质上清液中平均琥珀酸滴度,该菌株表
达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCKa)、丙酮酸羧化酶(PYC2)、苹果酸脱氢酶(MDH3)、延胡索酸酶
(fumB)、二羧酸转运蛋白(DCT_02),参照延胡索酸还原酶(SEQIDNO:33)或突变延胡索酸
还原酶转化,突变延胡索酸还原酶含有相对于参照序列的以下氨基酸位置的突变。
在1082氨基酸位置引入带正电荷的残基(赖氨酸或精氨酸;K或R)是独一无二的,因为参照延胡索酸还原酶序列在这个位置含有小的不带电荷的甘氨酸(G)。此外,先前描述的延胡索酸还原酶自然变体或公开发布的延胡索酸还原酶突变体在1082位置均不含有带电荷的残基。如表2所示,参照FRDg序列的甘氨酸被带电荷的残基置换有利于提高琥珀酸滴度。
实施例4:测量延胡索酸还原酶(FRD)变体的NADH和NADPH比活性
实施例3生成的转化株如实施例2所述进行培养。通过离心(4000rpm,10min,4℃)收获生物质,并用PBS(磷酸盐缓冲盐水,SigmaAldrich)洗涤2次,然后细胞沉淀物在-20℃冰冻。在方孔96深孔微孔板(MTP)中进行细胞破碎,使用0.5mm酸洗玻璃珠以及TissueLyserII(Qiagen)(3000rpm,2次,每次10秒钟)。在加入体内类分析培养基之前,将600μl体积的玻璃珠加入细胞沉淀物中,该体内类分析培养基如vanEunen等人所述(FEBSJournal277:749-760),含有0.5mMDTT(二硫苏糖醇,SigmaAldrich)和0.1mMPMSF(苯甲基磺酰氟,Amresco)。将含有冰冻沉淀物的深孔MTP倒扣在每个孔充满玻璃珠(300μl体积)的标准MTP上,然后二个微孔板都翻转,以加入玻璃珠,使得玻璃珠落入细胞沉淀物上。重复这个过程以使细胞沉淀物中有600μl玻璃珠。细胞破碎后,离心沉淀细胞碎片(4000rpm,30min,4℃)。收集上清液(可溶性细胞提取物)并在冰上储存。通过Bradford法检测提取物的蛋白浓度,使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准物。
通过跟踪NADH或NADPH氧化成NAD+或NADP+导致340nm吸光度减少用分光光度法测定延胡索酸还原酶(FRD)活性。体内类分析培养基中分析混合物含有150μMNADH或NADPH、1mM延胡索酸、0.5mg蛋白mL-1可溶性细胞提取物,终体积为200μl。反应通过加入延胡索酸开始,30摄氏度下追踪反应9分钟,斜率被作为NADH或NADPH依赖性FRD活性的量度。使用TecanInfiniteM1000酶标仪测量吸光度。每个变体的NADH依赖性活性与NADPH活性进行对比。计算每个变体的NADPH依赖性活性与NADH依赖性活性的比率,以便这些变体能够被排名。图3a和3b显示所有变体的NADH和NADPH依赖性FRD活性,这些变体含有有利于提高实施例3所述的琥珀酸生产的突变。
实施例5:构建菌株SUC-501
菌株SUC-501通过将WO2013/004670所述的菌株SUC-401的两个SpMAE1二羧酸转运蛋白置换成DCT_02二羧酸转运蛋白而构建,与WO2013/004670所述的菌株SUC-489类似。SUC-401用限制酶Bsu36I和FseI处理的质粒pSUC174的经纯化7.7kB片段转化。质粒pSUC174如WO2013/004670所述。该7.7kB片段在其5’端含有FUMR合成基因、DCT_02转运蛋白和由lox66/lox71位点侧翼化的KanMX选择标志物(LambertJM,BongersRS,KleerebezemM.,ApplEnvironMicrobiol.2007Feb;73(4):1126-35),在其3’端含有MDH3合成基因。
首先针对它们由于整合了KanMX抗性标志物而产生的G418抗性选择正确的转化株。然后,对中间菌株SUC-461进行诊断性PCR以确认SpMAE1合成基因被DCT_02合成基因置换。使用含有腐草霉素抗性标记物的质粒pSH65,通过转化Cre重组酶(GüldenerU,HeckS,FielderT,BeinhauerJ,HegemannJH.,NucleicAcidsRes.1996Jul1;24(13):2519-2524)将lox66和lox71位点侧翼化的KanMX标志物从菌株SUC-461中除去。接着,通过在非选择性培养基(YEP2%半乳糖)上培养使质粒pSH65从细胞消除,一个lox72保留在基因组DNA中。
所得到的菌株命名为SUC-464。
然后,SUC-401基因组DNA中的SpMAE1基因的第二个拷贝被置换。用Bsu36I和FseI限制性处理的质粒pSUC174的经纯化7.7kB片段转化SUC-464。首先针对它们由于整合了KanMX抗性标志物而产生的G418抗性选择正确的转化株。来自pSUC174的片段可以置换残留的SpMAE1基因或引入的DCT_02基因。对转化株进行诊断性PCR以确认两个SpMAE1合成基因都被DCT_02合成基因置换。一个含有两个DCT_02基因拷贝的转化株被命名为SUC-467。使用含有腐草霉素抗性标记物的质粒pSH65,通过转化Cre重组酶(GüldenerU,HeckS,FielderT,BeinhauerJ,HegemannJH.,NucleicAcidsRes.1996Jul1;24(13):2519-2524)将lox66和lox71位点侧翼化的KanMX标志物从菌株SUC-467中除去。接着,通过在非选择性培养基(YEP2%半乳糖)上培养使质粒pSH65从细胞消除,一个lox72保留在基因组DNA中。
所得到的菌株命名为SUC-501(MATaura3,52HIS3LEU2TRP1
sit2::TPI1p-PCKa-PMA1t;TDH3p-FRDg-TDH3t
sit4::TDH3p-MDH3-TDH3t;ENO1p-DCT_02-ENO1t;TPI1p-FUMR-PMA1t;lox72adh1::PGK1p-PYC2-PGK1t;URA3p-URA3-URA3tMAL2-8SUC2)。
实施例6:从SUC-501的适应性进化选择菌株SUC-723
在30℃下,在含有琥珀酸浓度为50g/L的pH3的培养基的2升发酵罐中培养SUC-501,其添加有1.5升auxostat培养物。搅拌棒速度设置为150rpm,气流设置为2Nl/hr。接种量为150g生物质(Verduyn培养基的摇瓶中培养(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517)含有半乳糖作为碳源)。经60天时间auxostat培养物的培养基给料速率逐渐增加。初始给料速率设置为稀释率0.05h-1,最终给料速率设置为稀释率0.16-1。补料速率最大化以确保培养物有最大可能的生长速率,同时避免乙醇形成和培养物冲蚀。
供给培养基是基于Verduyn等人(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517),其碳源和氮源有如下修改(见表3),pH设置为3(使用1MKOH/1MH2SO4)。
auxostat培养物生长的60天间,在多个时间点使用WO2013/004670实施例2所述的方法测量琥珀酸的产量。30天后,auxostat培养物产生的琥珀酸滴度与未进化的菌株SUC-501相似。适应进化60天后,auxostat培养物的琥珀酸滴度下降,比SUC-501减少超过50%。
auxostat培养物中培养60天后SUC-501培养物的单个菌落分离物命名为SUC-723。使用集成开放阅读框特异性引物,通过本领域技术人员已知的方法对SUC-501菌株(FUMR,MDH3,PCKa,FRDg,PYC2,DCT02)中存在的琥珀酸基因进行PCR分析,结果显示SUC-723中没有FRDg基因。SUC-501菌株中存在的其他所有琥珀酸基因也可以在SUC-723中存在。
表3实施例6中描述的SUC-501适应进化所使用的供给培养基的培养基组成。该供
给的培养基是基于Verduyn等人(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijken
JP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517)。
实施例7:延胡索酸还原酶转化菌株SUC-723并在所得到的转化株中产生琥珀酸
为了检验SUC-723琥珀酸产生减少是否仅归因于FRDg基因缺失(由此SUC-723可以随后被用来评估FRDg基因变体对琥珀酸产生的作用),在SUC-723菌株中整合FRDg表达构建体。
生成PCR片段
根据制造商的说明书,使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,USA)生成PCR片段。
使用SEQIDNO:34和SEQIDNO:35所示的引物序列,利用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板生成PCR片段23,该PCR片段23由5’INT12整合位点组成。
如实施例2所述生成PCR片段10和11。
使用SEQIDNO:36和SEQIDNO:37所示的引物序列,利用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板生成PCR片段24,该PCR片段24由3’INT12整合位点组成。
根据制造商的说明书,使用DNAClean&ConcentratorTM-25试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)纯化PCR片段10、11、23和24。
转化至SUC-723
通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。S.cerevisiae菌株SUC-723用纯化的PCR片段10、11、23和24转化。PCR片段10和11含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段23和24分别含有在其3'端和5'端的重叠,从而允许所有四个PCR片段进行同源重组(见图4)。PCR片段23的5'端和PCR片段24的3'端与INT12位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT12位点上整合(见图4)。由此形成一个线性片段,该线性片段由整合在INT12位点上的PCR片段10、11、23和24组成。这个整合方法如专利申请WO2013076280所述。该INT12位点位于染色体II,YOR071cORF的ATG上游743bp和YBL029C-A的ATG下游618bp。这种方法导致如SEQIDNO:33所示的1139个氨基酸的延胡索酸还原酶蛋白的在菌株SUC-723中表达,相对于T.brucei天然序列,其缺少C端氨基酸SKI。
转化株混合物铺在YEPh琼脂上(每升:10克酵母提取物、20克植物蛋白胨、20克半乳糖、20克琼脂),该培养基每毫升含有100μg诺尔丝菌素(JenaBioscience,Germany)。30℃条件下培养3-4天后,各个转化株重新在YEPh琼脂平板上划线,该YEPh琼脂平板每升含有20克半乳糖,每毫升含有100μg诺尔丝菌素。通过PCR确定引入基因的存在,PCR使用的引物序列可以退火至SEQIDNO:7(诺尔丝菌素标志物)和SEQIDNO:8(延胡索酸还原酶基因)所编码的ORF的编码序列。得到的菌命名为SUC-723-FRDg。
SUC-723和SUC-723-FRDg产生琥珀酸
为了确定琥珀酸产生,菌株SUC-723和SUC-723-FRDg在使用半乳糖作为碳源的微孔板中一式三份培养。产生生物质的生长期后,通过在培养基中重悬细胞开始进行产生试验。产生试验开始时,30g/L琥珀酸被添加到培养基中。培养96小时后取出上清液样品。
流动NMR的样品通过以下制备:从每个培养瓶中取出600微升培养物,并以14,000rpm离心1分钟,50微升上清液移至96深孔MTP板,将450微升内标物(20g/L马来酸、40g/lEDTA的D2O液)和500微升比例为80:20的H2O/D2O添加到每个样品中。用BrukerBESTavanceII500MHz光谱仪检测发酵上清液中的包括琥珀酸浓缩物在内的二羧酸以及诸如葡萄糖的其他化合物。27摄氏度下用水抑制脉冲程序记录NMR光谱,松弛延迟为30s。
菌株SUC-723的上清液中,测量到琥珀酸的平均滴度为37.4g/L。当菌株SUC-723中引入并过表达FRDg时,即SUC-723-FRDg中,测量到琥珀酸的平均滴度为49.5g/L。
实施例8:延胡索酸还原酶变体转化菌株SUC-723并在所得到的转化株中产生琥珀
酸
生成PCR片段
如实施例2所述生成PCR片段10。
如实施例7所述生成PCR片段23和24。
编码如SEQIDNO:33所述的参照延胡索酸还原酶序列的不同蛋白变体的合成核苷酸序列通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。这些合成核苷酸序列编码相对于参照FRDg序列(SEQIDNO:33)的如表4所示位置的突变氨基酸。除了编码表4所示的突变氨基酸,该合成核苷酸序列变体与SEQIDNO:8一致。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自S.cerevisiae的启动子,即TDH3启动子控制突变FRDg基因(FCC)的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即TAL1终止子。
含有TDH3启动子–突变FRD–TAL1终止子等的合成基因序列进行PCR扩增,扩增使用SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的引物,以生成PCR片段13、16、17、19、21和22(见表4)。
根据制造商的说明书,使用DNAClean&ConcentratorTM-25试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)纯化PCR片段10、12、13、16、17、19、21、22、23和24。
转化至SUC-723
菌株SUC-723用纯化的PCR片段23、10和24与各PCR片段13、16、17、19、21和22一起转化。PCR片段10、13、16、17、19、21和22含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段23和24分别含有在其3'端和5'端的重叠,从而允许所有四个PCR片段进行同源重组。PCR片段23的5'端和PCR片段24的3'端与INT12位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT12位点上整合(见图4)。如实施例2所述转化并选择转化株。
每个转化株的三个菌落通过PCR检测,检测使用FRDg基因上杂交的引物以及PCR片段23的同源区域的基因组DNA5’端的和PCR片段24的同源区域的基因组DNA3’端上杂交的引物。对于所有的转化株,鉴定有至少有一个正确的转化株。转化有PCR片段13、16、17、19、21和22的菌株的一个菌落分别命名为SUC-723-FCC_40、SUC-723-FCC_48、SUC-723-FCC_65、SUC-723-FCC_70、SUC-723-FCC_76和SUC-723-FCC_78。
产生琥珀酸
为了确定琥珀酸产生,SUC-723-FCC_40、SUC-723-FCC_48、SUC-723-FCC_65、SUC-723-FCC_70、SUC-723-FCC_76和SUC-723-FCC_78在微孔板中一式三份培养,如实施例2所述测量琥珀酸滴度。琥珀酸的平均滴度在表4中示出。表达突变延胡索酸还原酶序列的多个SUC-723转化株的琥珀酸平均产量超过54g/L琥珀酸。这显著高于参照FRDg序列转化的SUC-723的平均琥珀酸滴度,其产生49.5g/L琥珀酸。显著高意味着具有参照延胡索酸还原酶序列和改良的突变延胡索酸还原酶序列的菌株的琥珀酸滴度95%置信区间不重叠。
表4:菌株SUC-723培养4天后测量生产基质上清液中平均琥珀酸滴度,该菌株表达
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCKa)、丙酮酸羧化酶(PYC2)、苹果酸脱氢酶(MDH3)、延胡索酸酶
(fumB)、二羧酸转运蛋白(DCT_02),转化有参照延胡索酸还原酶(SEQIDNO:33)或突变延
胡索酸还原酶,所述突变延胡索酸还原酶含有相对于参照序列的以下氨基酸位置的突变。
在1082氨基酸位置引入带正电荷的残基(赖氨酸或精氨酸;K或R)是独一无二的,因为参照延胡索酸还原酶序列在这个位置含有小的不带电荷的甘氨酸(G)。此外,先前描述的延胡索酸还原酶自然变体或公开发布的延胡索酸还原酶突变体在1082位置均不含有带电荷的残基。如表4所示,参照FRDg序列1082位置的甘氨酸被带电荷的残基置换有利于提高琥珀酸滴度。在实施例3中在菌株SUC-1099显示了这些,本实施例中在不同的菌株背景即菌株SUC-723下显示相同的效果。
实施例9:测量菌株SUC-723中表达的延胡索酸还原酶(FRD)变体的NADH和NADPH比
活性
实施例7和8生成的转化株如实施例2所述的进行培养。收获生物质,破碎细胞,并如实施例4所述的检测蛋白浓度。如实施例5所述一式三份用分光光度法测定延胡索酸还原酶(FRD)活性。图5a和5b显示在菌株SUC-723表达的变体FCC_40、FCC_48、FCC_65、FCC_70、FCC_76、FCC_78的NADH和NADPH依赖性FRD活性以及参照FRD。采用没有转化FRD的SUC-723菌株作为对照。这六个测试FRD变体是含有突变的变体,突变有利于提高如实施例3和8所述的琥珀酸产生。
实施例10:延胡索酸还原酶转化菌株CEN.PK113-7D
生成PCR片段
使用扩增SEQIDNO:38所示的全部核苷酸序列的引物,利用SEQIDNO:38的PCR扩增生成PCR片段25。SEQIDNO:38描述5’INT09.01整合侧翼。SEQIDNO:38包括与位于SEQIDNO:383’端的PCR片段26同源的50bp区域。INT09.01整合位点位于染色体IX上YIL009WORF的下游359bp。
使用扩增SEQIDNO:39所示的全部核苷酸序列的引物,利用SEQIDNO:39的PCR扩增生成PCR片段26。SEQIDNO:39编码在Saccharomycescerevisiae中有功能的诺尔丝菌素选择标志物,其扩增自质粒pUG7-Nat的改良版本。pUG7-Nat是质粒pUG6的变体,见Gueldener等人(NucleicAcidsRes.1996Jul1;24(13):2519-24)所述,其中pUG6存在的loxP位点变成lox66和lox71位点(Lambert等人,Appl.Environ.Microbiol.2007Feb;73(4):1126-35.Epub2006Dec1),并且其中KanMX标记物被诺尔丝菌素标记物置换(Goldstein和McCusker,Yeast.1999Oct;15(14):1541-53)。
使用扩增SEQIDNO:40所示的全部核苷酸序列的引物,利用SEQIDNO:40的PCR扩增生成PCR片段27。
如专利申请WO2009/065778所公开的,如SEQIDNO:33所示的,SEQIDNO:40编码来自Trypanosomabrucei的延胡索酸还原酶(FRDg)。这个合成序列包括具有合适限制性位点的启动子-基因-终止子序列,通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。如专利申请WO2008/000632所公开的,该基因序列是针对在S.cerevisiae中表达优化密码子对的,如专利申请WO2008/000632中所公开的。该合成基因受控于(或可操作地连接到)来自Kluyveromyceslactis的启动子,即PGK13磷酸甘油酸激酶(uniprot登记号P14828)启动子控制FRDg基因的表达。正常终止是由来自S.cerevisiae的终止子序列控制,即ADH1终止子。
使用扩增SEQIDNO:41所示的全部核苷酸序列的引物,利用SEQIDNO:41的PCR扩增生成PCR片段28。SEQIDNO:41描述3’INT09.01整合侧翼。PCR片段28的5’端由与PCR片段27及片段29-58的3’端同源的50bp区域组成。
使用与生成PCR片段27相似的方法生成PCR片段29-58。与片段27的PCR使用SEQIDNO:40作为靶标不同的是,使用编码SEQIDNO:33所示的参照延胡索酸还原酶序列的不同蛋白变体的合成核苷酸序列。这些合成核苷酸序列通过DNA2.0(MenloPark,California,USA)合成。这些合成核苷酸序列编码相对于参照FRDg序列(SEQIDNO:33)在表5所示位置的突变氨基酸。
除了编码表5所示的突变氨基酸,这些合成核苷酸序列变体与SEQIDNO:40一致。这些序列通过PCR扩增,扩增使用PCR片段27扩增所使用的引物,以生成PCR片段29-58(见表5)。
表5:相对于PCR片段27上的参照延胡索酸还原酶(SEQIDNO:33),PCR片段29-58
上的突变延胡索酸还原酶变体存在的突变。PCR片段29-60中,突变如下所示存在于氨基酸
位置1042、1071、1072、1082和1083。
转化CEN.PK113-7D以构建菌株CPK-FRDg
通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。S.cerevisiae菌株CENPK.113-7D(MATaHIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2)用纯化的PCR片段25-28转化。PCR片段26和27含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段25和26分别含有在其3'端和5'端的重叠,允许所有四个片段进行同源重组。PCR片段25的5'端和PCR片段28的3'端与INT09.01位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT09.01位点上整合(见图6)。
转化株混合物铺在YEPh琼脂上(每升:10克酵母提取物、20克植物蛋白胨、20克半乳糖、20克琼脂),该培养基每毫升含有100μg诺尔丝菌素(JenaBioscience,Germany)。30℃条件下培养三天后,各个转化株重新在YEPh琼脂平板上划线,该YEPh琼脂平板每升含有20克半乳糖,每毫升含有100μg诺尔丝菌素。通过PCR确定引入基因的存在,PCR使用的引物序列可以退火至SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所编码的ORF的编码序列。选择单独菌落并命名为CPK-FRDg。
转化CEN.PK113-7D以构建菌株CPK-FCC_097至CPK-FCC_124和CPK-FCC_030和CPK-
FCC_028.
通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。S.cerevisiae菌株CENPK.113-7D(MATaHIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2)分别用纯化的PCR片段25、26、28和片段29-58转化。PCR片段26和片段29-58含有在其5'端和3'端的重叠,PCR片段25和28分别含有在其3'端和5'端的重叠,允许所有四个片段进行同源重组,如图6所示。PCR片段25的5'端和PCR片段28的3'端与INT09.01位点同源,使得所有四个PCR片段都能够在INT09.01位点上整合(见图6)。
转化株混合物铺在YEPh琼脂上(每升:10克酵母提取物、20克植物蛋白胨、20克半乳糖、20克琼脂),该培养基每毫升含有100μg诺尔丝菌素(JenaBioscience,Germany)。30℃条件下培养三天后,各个转化株重新在YEPh琼脂平板上划线,该YEPh琼脂平板每升含有20克半乳糖,每毫升含有100μg诺尔丝菌素。通过测量延胡索酸还原酶活性推断引入基因的存在。
实施例11:测量菌株CEN.PK113-7D中表达的延胡索酸还原酶(FRD)变体的NADH和
NADPH比活性
实施例10中生成的转化株在24深孔板(Axygen)中培养,培养所用的Verduyn培养基(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517)含有半乳糖作为碳源,每毫升含有150μg诺尔丝菌素(JenaBioscience,Germany)。收获生物质,破碎细胞并通过实施例4所述的测量蛋白浓度。如实施例4所述用分光光度法测定延胡索酸还原酶(FRD)活性,有以下小的改变:使用400μM而不是150μM的NADH或NADPH。所测量的活性通过除以分析中总蛋白浓度对存在的总蛋白进行归一化,通过Bradford使用牛血清白蛋白作为标准物进行测定。表6列出每一变体的特异性比率;NADPH:NADH依赖性活性的比率=(NADPH340nm斜率)/(NADH340nm斜率)。计算这个比率,使得变体能够根据改变的辅因子特异性进行分级(见表6)。相对于参照菌落比率的值增加表明辅因子特异性已经改变。这个可以表明NADH特异性减少,NADPH活性增强,或两者的组合。图7显示CEN.PK113-7D中表达的FRD变体的NADPH和NADH依赖性FRD活性。菌株CEN.PK113-7D没有转化FRD,取其作为阴性对照。
表6菌株CEN.PK113-7D中表达的FRD变体的NADPH:NADH特异性比率。通过计算
NADPH和NADH特异性FRD活性之间的比率,变体能够被分级并容易与参照序列比较。令人惊
讶地是,与参照FRD相比,所有变体表现出改变的辅因子特异性,许多改变非常显着,如不同
的特异性比率所证明的。
Claims (22)
1.具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,其与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比具有经改变的NADP(H)依赖性活性。
2.根据权利要求1所述的变体多肽,其与所述参照多肽相比具有增加的NADP(H)依赖性活性。
3.根据权利要求1或2所述的变体多肽,其与所述参照多肽相比具有降低的NAD(H)依赖性活性。
4.具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,任选地根据权利要求1所述的变体多肽,其与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比具有经改变的NAD(H)依赖性活性。
5.根据权利要求4所述的具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,其与所述参照多肽相比具有降低的NAD(H)依赖性活性。
6.根据权利要求4或5所述的变体多肽,其与所述具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比具有增加的NADP(H)依赖性活性。
7.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其中所述变体多肽包含氨基酸序列,所述氨基酸序列在与包含SEQIDNO:33所示序列的延胡索酸还原酶比对时,包含对应于以下任意氨基酸位置的氨基酸残基的至少一个替换
1042、1071、1072、1082或1083
所述位置参照SEQIDNO:33定义。
8.具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽,所述变体多肽具有氨基酸序列,所述氨基酸序列在与包含SEQIDNO:33所示序列的延胡索酸还原酶比对时,包含对应于以下任意氨基酸位置的氨基酸残基的至少一个替换
1042、1071、1072、1082或1083
所述位置参照SEQIDNO:33定义,并且其中所述变体与具有延胡索酸还原酶活性的参照多肽相比具有一个或多个经改变的特性。
9.根据权利要求8所述的变体多肽,其中所述经改变的特性是经改变的NADP(H)依赖性活性例如增加的NADP(H)依赖性活性,和/或经改变的NAD(H)依赖性活性例如增加的NAD(H)依赖性活性。
10.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其中所述参照多肽包含SEQIDNO:33的延胡索酸还原酶。.
11.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其中所述变体多肽是非天然存在的多肽。
12.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其包含除权利要求7或8所定义的那些之外的额外的替换。
13.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其如表1所定义。
14.根据前述权利要求中任一所述的变体多肽,其与SEQIDNO:33具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
15.核酸,其包含根据前述权利要求中任一所述的变体多肽的编码序列.
16.核酸构建体,其包含权利要求15所述的核酸序列,所述核酸序列可操作地连接到能够引导延胡索酸还原酶在合适表达宿主中表达的一种或多种控制序列。
17.表达载体,其包含根据权利要求15所述的核酸或根据权利要求16所述的核酸构建体。
18.宿主细胞,其包含根据权利要求15所述的核酸,根据权利要求16所述的核酸构建体或根据权利要求17所述的表达载体。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞,其是原核细胞,例如细菌细胞,或真核细胞,例如酵母细胞或丝状真菌细胞。
20.根据权利要求19所述的宿主细胞,其中所述酵母细胞是Saccharomycescerevisiae宿主细胞。
21.一种延胡索酸还原酶的生产方法,其包括在适合生产所述延胡索酸还原酶的条件下培养根据权利要求18-20中任一项所述的宿主细胞,以及任选地回收所述延胡索酸还原酶。
22.一种二羧酸例如琥珀酸的生产方法,所述方法包括在适合生产琥珀酸的条件下发酵根据权利要求18-20中任一所述的宿主细胞,以及任选地回收所述琥珀酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010993538.2A CN112094826B (zh) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | 延胡索酸还原酶 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13196950 | 2013-12-12 | ||
EP13196950.3 | 2013-12-12 | ||
PCT/EP2014/077638 WO2015086839A1 (en) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | Fumarate reductases |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010993538.2A Division CN112094826B (zh) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | 延胡索酸还原酶 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105814198A true CN105814198A (zh) | 2016-07-27 |
Family
ID=49726663
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480067432.2A Pending CN105814198A (zh) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | 延胡索酸还原酶 |
CN202010993538.2A Active CN112094826B (zh) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | 延胡索酸还原酶 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010993538.2A Active CN112094826B (zh) | 2013-12-12 | 2014-12-12 | 延胡索酸还原酶 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9944905B2 (zh) |
EP (1) | EP3080251B1 (zh) |
CN (2) | CN105814198A (zh) |
BR (1) | BR112016013526A2 (zh) |
CA (1) | CA2931591C (zh) |
EA (1) | EA037088B1 (zh) |
ES (1) | ES2790573T3 (zh) |
WO (1) | WO2015086839A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112513261A (zh) * | 2018-05-25 | 2021-03-16 | 丹尼斯科美国公司 | 富马酸还原酶过表达导致酵母中增加的发酵速率 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10787649B2 (en) * | 2016-07-13 | 2020-09-29 | Dsm Ip Assets B.V. | Malate dehyrogenases |
CN114806913B (zh) * | 2022-04-15 | 2023-11-28 | 盛虹控股集团有限公司 | 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101978063A (zh) * | 2007-11-20 | 2011-02-16 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 在真核细胞中生产琥珀酸 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3176265A1 (en) * | 2008-07-08 | 2017-06-07 | DSM IP Assets B.V. | Dicarboxylic acid production by fermentation at low ph |
WO2010111344A2 (en) * | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Microbia, Inc. | Methods and microorganisms for production of c4-dicarboxylic acids |
EP2419518A1 (en) * | 2009-04-15 | 2012-02-22 | DSM IP Assets B.V. | Dicarboxylic acid production process |
-
2014
- 2014-12-12 EP EP14833137.4A patent/EP3080251B1/en active Active
- 2014-12-12 WO PCT/EP2014/077638 patent/WO2015086839A1/en active Application Filing
- 2014-12-12 EA EA201691208A patent/EA037088B1/ru unknown
- 2014-12-12 BR BR112016013526A patent/BR112016013526A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-12-12 US US15/103,237 patent/US9944905B2/en active Active
- 2014-12-12 CN CN201480067432.2A patent/CN105814198A/zh active Pending
- 2014-12-12 ES ES14833137T patent/ES2790573T3/es active Active
- 2014-12-12 CA CA2931591A patent/CA2931591C/en active Active
- 2014-12-12 CN CN202010993538.2A patent/CN112094826B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101978063A (zh) * | 2007-11-20 | 2011-02-16 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 在真核细胞中生产琥珀酸 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BESTEIRO S.等: "AAN40014", 《GENBANK》 * |
BESTEIRO S等: "Succinate secreted by Trypanosoma brucei is produced by a novel and unique glycosomal enzyme,NADH-dependent fumarate reductase.", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
COUSTOU V等: "A mitochondrial NADH-dependent fumarate reductase inolved in the production of succinate excreted by procyclic Trypanosoma brucei.", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
JACKSON A.P.等: "CCC47841", 《GENBANK》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112513261A (zh) * | 2018-05-25 | 2021-03-16 | 丹尼斯科美国公司 | 富马酸还原酶过表达导致酵母中增加的发酵速率 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015086839A1 (en) | 2015-06-18 |
ES2790573T3 (es) | 2020-10-28 |
EA201691208A1 (ru) | 2016-12-30 |
EA037088B1 (ru) | 2021-02-04 |
EP3080251B1 (en) | 2020-03-04 |
WO2015086839A9 (en) | 2016-09-09 |
US20160319245A1 (en) | 2016-11-03 |
EP3080251A1 (en) | 2016-10-19 |
US9944905B2 (en) | 2018-04-17 |
CN112094826A (zh) | 2020-12-18 |
CA2931591C (en) | 2023-09-19 |
CA2931591A1 (en) | 2015-06-18 |
BR112016013526A2 (pt) | 2017-10-03 |
CN112094826B (zh) | 2023-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101903522B (zh) | 在真核生物中生产二羧酸 | |
US20110045559A1 (en) | Malic acid production in recombinant yeast | |
US20150104543A1 (en) | Organic acid production by fungal cells | |
US20080090273A1 (en) | Malic Acid Production in Recombinant Yeast | |
WO2010111344A2 (en) | Methods and microorganisms for production of c4-dicarboxylic acids | |
EP2470667B1 (en) | Dicarboxylic acid fermentation process | |
CN112204146A (zh) | 具有受抑制的乙醇产生途径的耐酸酵母及使用其生产乳酸的方法 | |
US11339379B2 (en) | Malate dehyrogenases | |
CA2714088A1 (en) | Process for the production of a dicarboxylic acid | |
CN105814198A (zh) | 延胡索酸还原酶 | |
US20070087421A1 (en) | Transformant and process for producing polyester using the same | |
WO2024033303A1 (en) | Synthetic formolase pathway | |
CN117467551A (zh) | 一种高产l-苹果酸的耐酸酵母菌株及其构建方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230619 Address after: Nanterre, France Applicant after: Technip Energy France Address before: Holland Heerlen Applicant before: DSM IP ASSETS B.V. |