CN112513261A - 富马酸还原酶过表达导致酵母中增加的发酵速率 - Google Patents

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Abstract

描述了涉及过表达富马酸还原酶的经修饰的酵母的组合物和方法。所述酵母细胞与它们的亲本细胞相比具有增加的发酵速率。这种酵母细胞对从淀粉底物大规模生产乙醇是特别有用的，其中乙醇生产的速率增加是希望的。

Description

富马酸还原酶过表达导致酵母中增加的发酵速率
技术领域
本发明的组合物和方法涉及过表达富马酸还原酶的经修饰的酵母细胞。所述酵母细胞与它们的亲本细胞相比具有增加的发酵速率。这种酵母对从淀粉底物大规模生产乙醇是特别有用的，其中乙醇生产的速率增加是希望的。
背景技术
基于酵母的乙醇生产是基于糖向乙醇的转化。当前通过此方法实现的年燃料乙醇生产在世界范围内为约900亿升。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为乙醇生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也具有巨大的经济影响。一摩尔葡萄糖转化为两摩尔乙醇和两摩尔二氧化碳的转化是氧化还原中性的，其最大理论产率为约51％。当前的工业产率为约45％；因此，存在增加乙醇生产的机会。尽管酵母生产率有所提高，但仍需要进一步改变酵母代谢途径来最大化乙醇生产，同时不增加不期望副产物的产生。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及过表达富马酸还原酶的经修饰的酵母细胞。所述酵母细胞与它们的亲本细胞相比具有增加的发酵速率，从而在短时间内产生相似的最大乙醇水平。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产速率的方法，所述方法包括：在亲本酵母细胞中引入遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的富马酸还原酶，其中在等同发酵条件下，所述经修饰的细胞与亲本细胞的发酵速率相比，发酵速率增加。
2.在如段落1所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变包括将核酸引入亲本细胞中，所述核酸能够指导富马酸还原酶以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.在如段落1所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变包括引入用于表达富马酸还原酶的表达盒。
4.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述富马酸还原酶是长的或短的形式。
5.在如段落4所述的方法的一些实施例中，所述富马酸还原酶是短的形式。
6.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，进入发酵24小时时测量乙醇生产。
7.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，乙醇生产的速率增加不是因为木糖的代谢。
8.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述碳水化合物底物基本上不含木糖。
9.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
10.在如段落9所述的方法的一些实施例中，所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
11.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，基于OSM1 mRNA表达，富马酸还原酶表达的增加量是等同条件下生长的亲本细胞的表达水平的约80倍。
12.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
13.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
14.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含用于制备乙醇的替代性途径。
15.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞属于酵母菌属(Saccharomyces)物种。
根据包括附图/图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
具体实施方式
I.定义
在详细地描述本发明的酵母和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。
如本文所使用的，术语“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物体。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物体以及用于生产可饮用醇的生物体，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”或“同源物”。这类蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物体，或不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的、或通过他们的功能确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有类似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所需活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多序列比对。它还可以标绘显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”和“X”决定了所述比对的灵敏度和速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
Figure BDA0002902732350000051
Figure BDA0002902732350000061
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。当生物体含有多于一个相似基因时，术语“等位基因”通常是优选的，在这种情况下，每个不同的相似基因被称为不同的“等位基因”。
如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。当实验条件允许时，过表达可能以mRNA水平或多肽水平进行描述。
如本文所使用的，“表达盒”是指包括启动子、和氨基酸编码区与终止子(即启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许在细胞中产生编码的多肽需要的其他核酸序列的DNA片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
如本文所使用的，关于两个DNA片段的术语“融合的”和“融合”(例如启动子和多肽的编码区)是指致使两个DNA片段变成单个分子的物理键合。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然”可互换地使用，并且是指在自然界中发现的基因、蛋白质或菌株，或者不是为了目前所述酵母的优点而有意修饰的基因、蛋白质或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、可选择标记、信号转导子、受体、转运体、转录因子、翻译因子、辅因子等，并且可以被表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白)的遗传的或化学的操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用CRISPR、RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。如本文所使用的，“基因缺失”是指该基因从宿主细胞的基因组中去除。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。基因缺失也指编码序列的一部分、或与基因编码序列紧邻或不紧邻的启动子的一部分的缺失，其中工程化细胞中不存在目的基因的功能活性。
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、结合活性、表面活性特性、信号转导子、受体、转运体、转录因子、翻译因子、辅因子等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有减少的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白质/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生特定蛋白质”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即，生物化学途径)泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间体的通量的任何遗传的或化学的操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧气存在下生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，表达“发酵结束”是指就固定和可变成本而言，当连续发酵产生少量额外的醇的经济优势被连续发酵的成本超过时的发酵阶段。在更一般的意义上，“发酵结束”是指发酵将不再产生大量另外的醇，即不超过约1％的额外的醇，或无更多的用于进一步醇生产的底物剩余的点。
如本文所使用的，“葡糖淀粉酶单位(GAU)”被定义为在60℃和pH 4.2的测定条件下，每小时从可溶的淀粉底物(4％ds)中生产1g葡萄糖所需的葡糖淀粉酶的量。
如本文所使用的，“分光光度酸蛋白酶单位(SAPU)”是在标准测定条件下，每分钟从酪蛋白底物中释放一微摩尔酪氨酸的蛋白酶活性的量。
如本文所使用的，“可溶淀粉单元(SSU)”是基于在pH 4.5、50℃等分试样的α-淀粉酶对可溶的马铃薯淀粉底物(4％DS)的水解程度。使用DNS方法(如Miller,G.L.((1959)Anal.Chem.[分析化学]31:426-28中所描述的)测量还原糖含量。
如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
AA α-淀粉酶
AADH 乙醛脱氢酶
ADH 醇脱氢酶
bp 碱基对
DNA 脱氧核糖核酸
ds或DS 干固体
EC 酶学委员会
EtOH 乙醇
g或gm 克
g/L 克/升
GA 葡糖淀粉酶
GAU 葡糖淀粉酶单位
H2O 水
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kg 千克
M 摩尔
mg 毫克
min 分钟
mL或ml 毫升
mM 毫摩尔
mRNA 信使RNA
N 正常
nm 纳米
PCR 聚合酶链式反应
PKL 磷酸转酮酶
ppm 份/百万份
PTA 磷酸转乙酰酶
SAPU 分光光度酸蛋白酶单位
SSU 可溶淀粉单元
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM 微摩尔
II.富马酸还原酶在酵母中过表达增加乙醇生产的速率
描述了经修饰的酵母和涉及经修饰的酵母的淀粉加工的方法，所述经修饰的酵母具有与相应的(即，其他方面相同的)亲本细胞相比导致产生增加量的富马酸还原酶的遗传改变。富马酸还原酶(E.C.1.3.1.6)催化富马酸盐还原为琥珀酸盐，并且其是在厌氧条件下细胞内NADH再氧化所需的。
申请人发现，酵母细胞过表达富马酸还原酶减少了发酵次数，这导致与其他方面相同的亲本细胞相比在淀粉底物开始发酵后的较早时间的增加的乙醇量。虽然显示富马酸还原酶能提高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中D-木糖发酵(
Figure BDA0002902732350000111
L.等人(2013)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学和生物技术杂志]40:1383-92)，但迄今为止还没有报道富马酸还原酶能增加乙醇生产速率。
示例的富马酸还原酶来自酿酒酵母S288c(Genbank登录号NP_012585.1；SEQ IDNO:3(下文))。然而，Genbank列出了大约20种其它的与SEQ ID NO:3具有约99％氨基酸序列同一性的富马酸还原酶多肽序列，随后是大量其他类似的多肽。这些相似多肽中的大部分(如果不是全部的话)有望在酵母细胞中产生相似的结果。
值得注意的是，富马酸还原酶基因(OSM1)被转录为具有两个独特的翻译起始位点的mRNA，所述mRNA产生两种不同形式的功能性富马酸还原酶，其中一个定位到ER上，而另一个定位到线粒体上。如本文所详述的，任何形式的富马酸还原酶的增加都可能导致酵母中发酵速率的增加。而富马酸还原酶的形式似乎很关键，优选短的形式的过表达。
在本发明的组合物和方法的特定实施例中，在经修饰的酵母细胞中被过表达的富马酸还原酶多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、或其短的形式(标识为SEQ ID NO:3中加下划线的部分(下文))具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或者甚至至少约99％的同一性。
经修饰的细胞的发酵速率的增加与相同条件下生长的亲本细胞的发酵速率(如在进入发酵(即，发酵开始后)24小时所测量的)相比可以增加至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5.0％、或者更多。
由经修饰的细胞所生产的富马酸还原酶的量的增加与相同条件下生长的亲本细胞产生的富马酸还原酶的量相比可以增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％、至少1000％、或者更多。可替代地或另外地，由经修饰的细胞产生的富马酸还原酶的量的增加与相同条件下生长的亲本细胞产生的富马酸还原酶的量相比可以增加至少10倍、至少20倍、至少30倍、并且甚至至少50倍、或者更多。
用于控制由经修饰的细胞产生的富马酸还原酶的表达的启动子的强度基于产生的mRNA的量，与控制富马酸还原酶表达的天然启动子的强度相比增加至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少60倍、或者甚至至少80倍、或者更多。
可以理解，相对启动子强度不是一个精确的标量值。它极大地取决于培养基、发酵时间、温度和其它条件。最优选的是从工业化培养基发酵过程中收集的RNAseq数据中获得的值，然而，在不同培养条件下获得的实验和/或文献数据也可以用于重组启动子选择。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了富马酸还原酶表达增加，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及向酵母细胞中引入能够指导富马酸还原酶多肽过表达或表达增加的核酸。特定的方法包括但不限于(i)将用于产生所述多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地还有内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)修饰内源表达盒的启动子以增加表达，(iv)增加用于富马酸还原酶多肽过表达的相同或不同盒的拷贝数，和/或(v)修饰宿主细胞的任何方面以增长所述多肽在宿主细胞中的半衰期。
在一些实施例中，已经被修饰的亲本细胞包括增加乙醇生产的工程化的目的途径(诸如PKL途径)，或增加醇生产的任何其他途径。在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码选择性标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
应当理解，通过过表达富马酸还原酶观测到乙醇生产的速率增加不是因为木糖的代谢。在所附的实例中，使用的发酵培养基中不存在木糖。因此，从基本上不含、或者完全没有木糖的碳水化合物底物中观察到发酵速率增加，所述发酵速率增加绝不能归因于木糖的代谢。
III.经修饰的酵母细胞过表达富马酸还原酶且具有外源PKL途径
富马酸还原酶表达增加可与所述PKL途径的基因的表达组合以进一步增加酵母细胞中乙醇的生产速率，和/或最大化生产水平。
WO 2015148272中先前已经描述了具有异源PKL途径的工程化酵母细胞(Miasnikov等人)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)，任选地具有其他酶，以使通道碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，此类经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。
IV.富马酸还原酶的过表达与其它影响乙醇生产或其副产物的突变组合
在一些实施例中，除了过表达富马酸还原酶之外，任选地与外源PKL途径的存在组合，本发明的经修饰的酵母细胞包括影响乙醇生产或其副产物的额外的修饰。
本发明的经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径和/或再利用甘油途径的弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。Methods to enhance the reuse glycerol pathway by over expression of glyceroldehydrogenase(GCY1)and dihydroxyacetone kinase(DAK1)to convert glycerol todihydroxyacetone phosphate[通过过表达甘油脱氢酶(GCY1)和二羟基丙酮激酶(DAK1)将甘油转化为磷酸二羟基丙酮以增强再利用甘油途径的方法](Zhang等人(2013)；J IndMicrobiol Biotechnol[工业微生物与生物技术杂志]40:1153-1160)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为Ac-CoA。这部分地降低了乙酸对酵母细胞生长的不希望的影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(AADH)活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因(PFL)。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(STL1)多肽以增加甘油的摄入(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol Biol Cell[细胞分子生物学]16:2068-76；
Figure BDA0002902732350000141
等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59以及WO 2015023989 A1)。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
V.富马酸还原酶过表达与其他有益突变组合
在一些实施例中，除富马酸还原酶的过表达之外，任选地与有益于醇生产或减少副产物的其他基因修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数量的编码目的蛋白质的额外目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入额外的目的基因，所述遗传操作导致富马酸还原酶多肽的过表达。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
VI.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
本发明的经修饰的菌株和其使用方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品，无论使用粗淀粉水解、同时糖化和发酵、或其他常规乙醇生产的标准变化。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。
VII.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Lachancea属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需特征，例如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
VII.底物和产物
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。
实例
以下实例旨在进一步说明但不限制所描述的组合物和方法。
实例1.材料与方法
除非另有说明，否则采用以下方案。
液化物制备：
液化物(玉米醪浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds变体里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶以及1.46SSCU/g ds白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶、调节至pH 4.8来制备。
微量滴定板测定：
对工厂液化物(玉米醪浆料)进行离心，并将上清液通过0.45μm(灭菌的)过滤器过滤。将调整至干固体含量为29％的澄清液化物(相应于原液化物约34％的干固体含量)用以下补充：5ml/L的10mg/ml的麦角固醇在吐温80中的溶液、以及600mg/L尿素、0.124SAPU/gds酸性真菌蛋白酶(即FERMGENTM)、1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，并冷冻保存直至使用。在发酵开始前立即添加0.33GAU/g ds里氏木霉葡糖淀粉酶变体。
对于发酵测定，在深的96孔MTP(Simport T110-10)的每孔中放置800μl澄清液化物，并使用10μl接种物开始发酵。接种物在含有酵母氮碱(0.67％)、葡萄糖(6％)和尿素(0.2％)的SC6％合成培养基中生长约24小时过夜。深孔板用穿孔
Figure BDA0002902732350000171
盖进行封闭。所述盖通过下述方式进行修改：使用(6-8mm)软(肖氏硬度10)硅橡胶板代替原橡胶密封垫，所述软硅橡胶板在96孔的每孔上用26号皮下注射针刺孔。这种修饰最小化了乙醇的蒸发，同时允许CO2逸出。在32℃下伴随搅拌进行发酵长达66h。
HPLC分析：
在发酵最后，通过离心(在3,900rpm。10min)从培养物中分离酵母，并使用康宁公司(Corning)FILTREXTM CLS3505 96孔板过滤上清液的等分试样。使用菲罗门公司(PHENOMENEX)REZEXTM RFQ快速酸H+柱(串联50x7.8mm和100x7.8mm)，在60℃下以0.6ml/min等度流速在5mM H2SO4中进行HPLC分析。使用具有折射率检测的安捷伦G1312A液相色谱。除非另有说明，所有值以g/L报告。
实例2.酵母中OSM1的过表达
为过表达基因OSM1(其同时编码酿酒酵母富马酸还原酶短和长的形式)，构建了两个盒。第一个盒包括OSM1完整的编码区，并被称为OSM1-长或OSM1-L，第二个盒开始于OSM1的密码子-32，并被称为OSM1-短或OSM1-S。
OSM1-L的编码区如下SEQ ID NO:1所示。OSM1-S的编码区如SEQ ID NO:1中加下划线的部分所示。相应的起始密码子以粗体显示。
Figure BDA0002902732350000181
为过表达OSM1-L和OSM1-S，将EFB1启动子(如下SEQ ID NO:2所示)可操作地连接到上述富马酸还原酶编码序列。
Figure BDA0002902732350000191
与野生型启动子相比，EFB1启动子提供的OSM1-L和OSM1-S mRNA表达增加约80倍(数据未示出)。
通过翻译OSM1-L多核苷酸产生的富马酸还原酶多肽的长形式如下SEQ ID NO:3所示。通过翻译OSM1-S多核苷酸产生的富马酸还原酶多肽的短形式(也可能从OSM1-L多核苷酸的内部翻译起始位点达到一定水平)如下SEQ ID NO:3中加下划线的部分所示。起始甲硫氨酸以粗体显示。
Figure BDA0002902732350000192
通过PCR扩增包含连接到OSM1-L或OSM1-S的EFB1启动子的DNA片段。所述序列的侧翼是50nt长的序列，所述序列与酿酒酵母染色体中的PAM1基因座(YDR251W)的染色体基因座上游同源。
将所述PCR产物与质粒pQM004一起分别转移到亲本细胞中，即(i)FERMAXTM Gold(玛翠公司(Martrex,Inc.)，明尼苏达州，美国；下文中缩写为“FG”)，用于谷物乙醇工业的众所周知的发酵酵母，或(ii)FG-PKL(或简写为PKL)，具有涉及磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)表达的异源磷酸转酮酶(PKL)途径的工程化的FG酵母，如WO 2015148272(Miasnikov等人，同上)所述。暂时存在于酵母转化体中的质粒pMQ004编码RNA指导的DNA核酸内切酶Cas9和gRNA(AGTCTCGAGAATGGCAAGCA；SEQ ID NO:4)，所述gRNA对前述PAM1的靶位点上游具有特异性。然后将两种PCR产物在细胞中进行缺口修复，以形成完整的EFB1启动子-OSM1-L或EFB1启动子-OSM1-S盒。PAM1基因座上游。
使经修饰的酵母菌株在非选择性培养基中生长，以固化用于选择转化体的卡那霉素抗性基因的酵母，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。含有新启动子和FG中PAM1位点的OSM1编码区的盒与FG的PKL衍生物的整合通过集落PCR进行确认，阳性菌株用于进一步研究。
实例3：通过过表达OSM1的酵母的乙醇生产
在32℃下在液化物中测定过表达OSM1基因的酵母菌株(即FG-OSM1-L和FG-OSM1-S)与所述FG亲本酵母(OSM1基因的野生型)相比生产乙醇的能力。具有33.5％DS的液化物如实例1中一般描述的制备。将50g液化物称入100ml容器中，并用来自经修饰的菌株或对照FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在32℃下孵育。离心25和55hr后收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(在0.01N H2SO4洗脱液中以0.6ml/min的等度流速通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析葡萄糖和乙醇含量。分析结果如表1所示。报道了相对于FG菌株的乙醇生产。
表1.用过表达OSM1的酵母发酵后发酵液的分析
Figure BDA0002902732350000211
在24hr时，过表达OSM1基因的酵母与参考菌株相比产生明显更多的乙醇，即从3.6％至4.5％。在55hr时间点时观察到很小差异，说明过表达OSM1增加细胞中乙醇生产的速率，但不增加细胞中乙醇生产的最大水平。
实例4.通过具有替代性乙醇生产途径和过表达OSM1的酵母的乙醇生产
在32℃下在液化物中额外测试过表达OSM1基因且进一步具有异源PKL途径的酵母菌株(即菌株PKL-OSM1-L和PKL-OSM1-S)与所述亲本菌株相比生产乙醇的能力。具有33.5％DS的液化物通常如实例1中所述制备。如实例3进行接种、发酵和分析。表2报道了相对于PKL菌株报道的乙醇生产。
表2.酵母过表达OSM1和具有异源PKL途径发酵后发酵液的分析
Figure BDA0002902732350000212
在24hr时，过表达OSM1基因的酵母与FG-PKL参考菌株相比产生明显更多的乙醇，即约1.8％至2.4％。在55hr时间点时观察到很小差异，再次说明过表达OSM1增加细胞中乙醇生产的速率，但不增加细胞中乙醇生产的最大水平。
Figure IDA0002902732380000011
Figure IDA0002902732380000021
Figure IDA0002902732380000031
Figure IDA0002902732380000041

Claims (15)

1.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产速率的方法，所述方法包括：在亲本酵母细胞中引入遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的富马酸还原酶，其中在等同发酵条件下，所述经修饰的细胞与亲本细胞的发酵速率相比，发酵速率增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传改变包括将核酸引入亲本细胞中，所述核酸能够指导富马酸还原酶以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传改变包括引入用于表达富马酸还原酶的表达盒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富马酸还原酶是长的或短的形式。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述富马酸还原酶是短的形式。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在进入发酵24小时时测量乙醇生产。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乙醇生产的速率增加不是因为木糖的代谢。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物底物基本上不含木糖。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于OSM1mRNA表达，富马酸还原酶表达的增加量是等同条件下生长的亲本细胞的表达水平的约80倍。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含用于制备乙醇的替代性途径。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞属于酵母菌属(Saccharomyces spp)物种。
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