CN112752845A

CN112752845A - 来自生产增加量的活性crz1蛋白的酵母的增加的醇生产

Info

Publication number: CN112752845A
Application number: CN201980062667.5A
Authority: CN
Inventors: J·F·图米内洛; Q·Q·朱
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2021-05-04
Also published as: AR115868A1; US20210292734A1; EP3830282A1; WO2020023890A1; BR112021001577A2

Abstract

描述了组合物和方法，所述组合物和方法涉及经修饰的酵母，除天然内源性CRZ1外，所述酵母还生产参与钙调神经磷酸酶应激反应途径的经修饰的CRZ1转录激活因子。这种酵母非常适合用于燃料醇生产以提高产量。

Description

来自生产增加量的活性CRZ1蛋白的酵母的增加的醇生产

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月27日提交的美国临时专利申请序列号62/703,952的优先权，将其以其全文通过引用特此结合。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及经修饰的酵母，其生产参与钙调神经磷酸酶应激反应途径的增加量的活性变体-CRZ1转录激活因子。这种酵母非常适合用于燃料醇生产以提高产量。

背景技术

许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。

丁醇是一种重要的工业化学品和滴入式燃料(drop-in fuel)组分，其具有多种应用，包括用作可再生燃料添加剂、塑料工业中的原料化学品、以及食品和香料工业中的食品级提取剂。因此，对醇(例如丁醇和异丁醇)以及有效和环境友好的生产方法有很高的需求。

鉴于世界范围的大量的醇生产，即使发酵生物效率的微小提高也可产生可用醇量的巨大增加。因此，对更有效地生产醇的生物存在需求。

发明内容

描述了涉及经修饰的酵母的组合物和方法，相对于在其他方面相同的亲本酵母，所述经修饰的酵母生产变体CRZ1转录激活因子。所述组合物和方法的各方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述细胞与亲本细胞相比生产增加量的活性CRZ1多肽，其中在相同发酵条件下与亲本细胞生产的醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中生产增加量的醇。

2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在相同发酵条件下的天然CRZ1多肽相比，所述活性CRZ1多肽表现出减少的磷酸化。

3.在如段落1或2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的氨基酸残基。

4.在如段落3所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的丝氨酸残基。

5.在如段落1-4中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的天然CRZ1多肽的表达水平相比，经修饰的CRZ1突变多肽的表达的增加量是至少约500％、至少1,000％、至少1,500％、或甚至至少2,000％。

6.在如段落1-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。

7.在如段落6所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。

8.在如段落1-7中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

9.在一些实施例中，如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

10.在一些实施例中，如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备醇的备选途径。

11.在如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp)。

12.在如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述醇是乙醇。

13.在另一方面，提供了一种用于增加从生长于碳水化合物底物上的酵母细胞生产的醇的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中生产的量相比使活性CRZ1多肽的生产增加的遗传改变。

14.在如段落13所述的方法的一些实施例中，与在相同发酵条件下的天然CRZ1多肽相比，所述活性CRZ1多肽表现出减少的磷酸化。

15.在如段落13或14所述的方法的一些实施例中，与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的氨基酸残基。

16.在如段落15所述的方法的一些实施例中，与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的丝氨酸残基。

17.在如段落13-16中任一项所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变导致如段落1-11中任一项所述的变体酵母或其变体。

根据包括附图的说明书，本发明的组合物和方法的这些及其他方面和实施例将是清楚的。

附图说明

图1A-1C是Clustal W比对，所述比对将天然CRZ1基因(SEQ ID NO:3；底部)与遗传修饰的CRZ1变体基因(SEQ ID NO:4；顶部)进行了比较，所述变体基因在核苷酸位置39处含有沉默突变(这导致Spe I限制位点的缺失)并且进一步含有导致在位置68、69、77和78的丙氨酸残基代替丝氨酸残基的核苷酸变化。序列中的差异以粗体显示。

图2是Clustal W比对，所述比对将天然CRZ1多肽(SEQ ID NO:1)与遗传修饰的CRZ1变体多肽(SEQ ID NO:2)进行了比较。在位置68、69、77和78处的丝氨酸至丙氨酸取代以粗体显示。

具体实施方式

I.概述

本发明的组合物和方法涉及经修饰的酵母，其生产参与钙调神经磷酸酶应激反应途径的变体CRZ1转录激活因子。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的天然CRZ1基因被组成性转录、翻译并折叠成蛋白(Crz1p)，所述蛋白是转录因子的锌指家族的成员。Crz1p含有在非应激条件下被磷酸化的富含丝氨酸的区域(SRR)。在非应激的环境条件下，磷酸化的Crz1p被定位到细胞质。当细胞经历环境应激(例如缺乏营养素、热的、化学的或渗透的应激等)时，Crz1p被诱导的钙调神经磷酸酶复合物去磷酸化，并且钙调神经磷酸酶应激反应途径被激活。去磷酸化的Crz1p被易位到细胞核中，在细胞核中，它影响在细胞应激反应中起作用的基因。以这种方式，去磷酸化的Crz1p被认为是分子的活性形式。

尽管在细胞核中，Crz1p的磷酸化状态迅速改变，其中激酶使SRR中的丝氨酸残基重新磷酸化，导致Crz1p从细胞核快速输出。从动力学上说，输出优于输入，并且去磷酸化状态下的Crz1p的存在转瞬即逝。

尽管已知醇的存在会诱导钙调神经磷酸酶应激反应途径，但是迄今为止还不知道除天然内源性CRZ1外，经修饰的CRZ1蛋白的表达还会导致醇耐受性的提高。此观察结果表明，酵母中的钙调神经磷酸酶应激反应途径没有被针对醇生产的应激而自然地优化，即使在针对此目的专门选择的商业酵母中亦如此。本文详细描述了本发明的组合物和方法的各个方面和实施例。

II.定义

在详细地描述经修饰的细胞和使用方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。

如本文所使用的，“酵母细胞”“酵母菌株”或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物体以及用于生产可饮用醇的生物体，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。

如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白被认为是“相关的蛋白”。此类蛋白可以来源于不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性或功能确定的同源物。

如本文所使用的，术语“同源蛋白”或“同源物”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、类似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以生产具有一种或多种所需活性的酶。

序列之间的同源性程度可使用本领域已知的任何适合方法来确定(参见例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学电脑集团(Genetics ComputerGroup),威斯康星州麦迪逊)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA；和Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。

例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用的算法的另一个实例是由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人,(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M′5、N′-4、以及两条链的比较作为默认值。

如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上类似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人,(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格性的范围内)彼此杂交。

如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。

如本文所使用的，“表达多肽”和类似术语是指使用细胞的翻译机制(例如，核糖体)生产多肽的细胞过程。

如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型细胞”所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。

如本文所使用的，“表达盒”是指包含启动子、氨基酸编码序列、终止子以及允许在细胞中生产所编码的多肽所需的其他核酸序列的DNA片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。

如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白或菌株。

如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白可以是酶、因子、辅因子、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。

如本文所使用的，术语“天然”与野生型同义并且是非遗传修饰的。

如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。

如本文所使用的，“活性多肽/蛋白”具有限定的活性。

如本文所使用的，“遗传修饰的”，特别是关于CRZ1基因，转录的mRNA或活性修饰的CRZ1蛋白，是指已经通过人为干预进行遗传操纵的基因、mRNA或蛋白的形式。

如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。

如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。

如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

℃ 摄氏度

AA α-淀粉酶

bp 碱基对

DNA 脱氧核糖核酸

DP 聚合度

ds或DS 干固体

EtOH 乙醇

g或gm 克

g/L 克/升

GA 葡糖淀粉酶

GAU/g ds 葡糖淀粉酶单元/克干固体

H₂O 水

HPLC 高效液相色谱

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔

mg 毫克

mL或ml 毫升

ml/min 毫升/分钟

mM 毫摩尔

N 正常

nm 纳米

PCR 聚合酶链式反应

ppm 份/百万份

RNA 核糖核酸

Δ 与缺失有关

μg 微克

μL和μl 微升

μM 微摩尔

III.具有经修饰的CRZ1表达的经修饰的酵母细胞

在一方面，提供了经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞具有与在其他方面相同的亲本细胞相比，导致除天然内源性CRZ1多肽外还生产经经修饰的CRZ1多肽的遗传改变。示例性活性酿酒酵母S288c CRZ1多肽(即，EMBL登录号NP_014371)的氨基酸序列如以下SEQID NO:1所示。下划线标出了所附文本文件中提到的野生型丝氨酸残基：

示例性遗传修饰的酿酒酵母S288c CRZ1多肽的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示。下划线标出了所附文本文件中提到的丙氨酸取代：

遗传修饰的基因包括在核苷酸位置39处的沉默突变(这导致Spe I限制位点的缺失)并且进一步包括导致在位置68、69、77和78处的丝氨酸残基被替换为丙氨酸残基的核苷酸变化。核苷酸修饰显示在图1的Clustal W比对中。天然和遗传修饰的多肽之间的差异显示在图2的Clustal W比对中。不受理论的束缚，据信丝氨酸残基被丙氨酸取代会去除磷酸化位点，从而模拟天然CRZ1多肽的去磷酸化，导致核定位和增强的应激反应。推测其他能被磷酸化的残基，尤其是SRR中的残基，也可能被取代，替代所例举的那些，或与所例举的那些一起，具有类似的效果。

在一些实施例中，与天然CRZ1多肽组合，并且除天然CRZ1多肽外，表达遗传修饰的CRZ1多肽。在一些实施例中，代替天然CRZ1多肽，即不存在天然CRZ1多肽，表达遗传修饰的CRZ1多肽。在一些实施例中，与天然多肽相比，经修饰的CRZ1多肽是过量表达的。在一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的天然多肽的表达水平相比，CRZ1突变多肽的表达的增加是至少约500％、至少1,000％、至少1,500％、或甚至至少2,000％、或更多。

在一些实施例中，经修饰的细胞的醇生产的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞生产的醇的量相比，至少0.3％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少1.1％、至少1.2％、至少1.3％、至少1.4％、至少1.5％、至少1.6％、至少1.7％、至少1.8％、至少1.9％、至少2.0％或更多的增加。

优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了经修饰的CRZ1生产，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。使用设计的筛选技术，通过经典的演化也可以实现经修饰的CRZ1生产。

在一些实施例中，已经被修饰的亲本细胞包括目的基因，例如编码选择性标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。

IV.经修饰的CRZ1生产与外源PKL途径的基因的组合

经修饰的CRZ1的表达可与PKL途径中的基因表达组合以增加乙醇生产。WO2015148272中先前已经描述了具有异源PKL途径的工程化酵母细胞(Miasnikov等人)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)，任选地具有其他酶，以使通道碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，此类经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。

V.经修饰的CRZ1生产与影响醇生产和/或甘油减少的其他突变的组合

在一些实施例中，除表达经修饰的CRZ1多肽外，本发明的经修饰的酵母细胞包括影响乙醇生产的另外的修饰。

本发明的经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径和/或再利用甘油途径的弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。Methods to enhance the reuse glycerol pathway by over expression of glyceroldehydrogenase(GCY1)and dihydroxyacetone kinase(DAK1)to convert glycerol todihydroxyacetone phosphate[通过过表达甘油脱氢酶(GCY1)和二羟基丙酮激酶(DAK1)将甘油转化为磷酸二羟基丙酮以增强再利用甘油途径的方法](Zhang等人(2013)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物与生物技术杂志]40:1153-60)。

经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸生产(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaeta concilii)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。

在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD⁺依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达糖转运体样(STL1)多肽(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol Biol Cell[细胞分子生物学]16:2068-76；

等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59以及WO 2015023989 A1)，从而增加乙醇生产并且减少乙酸。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达聚腺苷酸结合蛋白，例如PAB1，从而增加醇生产并且减少乙酸生产。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。

VI.经修饰的CRZ1生产与其他有益突变的组合

在一些实施例中，除表达经修饰的CRZ1多肽外，任选地与有益于醇生产的其他基因修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数量的编码目的蛋白质的另外目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，所述遗传操作导致经修饰的CRZ1多肽的生产增加。

目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。

VII.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途

本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇生产和/或减少甘油生产的方法。此类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。

VIII.适合修饰的酵母细胞

酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、克鲁维酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购获得的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，诸如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以生产异源酶，例如葡糖淀粉酶或a-淀粉酶。

IX.底物和产物

从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。

醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。

鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述组合物和方法。

实例

实例1.材料和方法

液化物制备

液化物(磨细的玉米浆料)通过添加600ppm尿素、0.124 SAPU/g ds FERMGEN^TM2.5X(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds变体木霉(Trichoderma)葡糖淀粉酶(TrGA)以及1.46SSCU/g ds曲霉(Aspergillus)α-淀粉酶、调整至pH 4.8来制备。

AnKom测定

将300μL浓缩的酵母过夜培养物添加到填充有30g制备的液化物的多个ANKOM瓶中的每个，以达到0.3的最终OD。然后将所述瓶在振荡(150RPM)下在32℃孵育55小时。

HPLC分析

通过在14,000RPM下离心12分钟在Eppendorf管中采集来自血清瓶和AnKom实验的样品。将上清液用0.2μM PTFE过滤器过滤，并且然后在以下条件下用于HPLC(AgilentTechnologies 1200系列)分析：Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，运行温度为55℃。0.6ml/min等度流速，0.01N H₂SO₄，2.5μL注射体积。使用校准标准物用于定量乙酸、乙醇、甘油、和葡萄糖。通过在14,000RPM下离心15分钟在Eppendorf管中采集来自摇瓶实验的样品。使用5mMH₂SO₄并在95℃下孵育5min来将上清液稀释11倍。在冷却之后，将样品用0.2μM CorningFiltrEX CLS3505过滤器过滤，并且然后用于HPLC分析。将10μl注入配备有折射率检测器的Agilent 1200系列HPLC中。所使用的分离柱是Phenomenex Rezex-RFQ Fast Acid H+(8％)柱。流动相为5mM H₂SO₄，并且在85℃下流速为1.0mL/min。使用来自Bion Analytical的HPLC校准标准混合物用于定量乙酸、乙醇、甘油、和葡萄糖。除非另外指明，所有值以g/L表达。

实例2.经修饰的“活性”CRZ1基因的产生

来自酿酒酵母S288c的CRZ1编码序列是通过以下以遗传修饰的形式合成的：在位置39处，用丙氨酸核苷酸改变胸腺嘧啶核苷酸，导致缺失SpeI限制位点的沉默突变，并且在位置202、205、229和232处，将胸腺嘧啶核苷酸改变为鸟嘌呤核苷酸，导致在SRR中丙氨酸残基替换丝氨酸残基。将经修饰的CRZ1基因命名为CRZ1.1.2。显示两个基因之间差异的天然核酸序列比对和多肽序列比对分别示于图1和2中。遗传修饰的基因由SEQ ID NO:4表示，如下所示，其中突变带有下划线：

实例2.经修饰的CRZ1表达盒的产生

天然酿酒酵母S288c CRZ1基因是从基因组DNA制备物中PCR扩增得到的，其中上游引物含有5′-SpeI位点以及单核苷酸交换(用来使如前所述的CRZ1内部SpeI位点缺失)的，并且下游引物含有3′-NotI位点。将扩增产物与质粒pJT801一起用SpeI和NotI消化。在DNA连接酶存在下，将消化的PCR产物与消化的质粒pJT801一起孵育后，先前克隆的GOI被内部SpeI缺失的CRZ1替换，称为CRZ 1.1。新的质粒构建体pJT852含有DAL80启动子::CRZ1.1::FBA1终止子盒。

通过gBlock双链DNA合成，将CRZ1的SRR中的前述修饰(即，丝氨酸至丙氨酸取代)引入新质粒。将经修饰的序列合成为分别具有上游和下游SpeI和PstI位点，并且用于替换质粒pJT852的SpeI和PstI片段，从而构建含有DAL80启动子::CRZ 1.1.2::FBA1终止子表达盒的质粒pJT860，称为CRZ 1.2。

实例3.表达经修饰的CRZ1的酵母的产生

将来自实例2的质粒pJT860用作模板，使用与酿酒酵母AAP1基因座具有同源性的适当侧翼引物，PCR扩增CRZ1.1.2表达盒。将扩增的DNA片段用作供体DNA，用于在三种亲本菌株中，在AAP1基因座处的CRISPR介导的整合：(i)FG是FERMAX^TM Gold Label(玛翠公司(Martrex,Inc.)，明尼苏达州，美国；本文中缩写为“FG”)，(ii)FG-PKL是具有涉及磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)表达的异源磷酸转酮酶(PKL)途径的工程化的FG酵母，如WO 2015148272(Miasnikov等人)所述，以及(iii)FG-PKL-GA是经过进一步工程化以表达外源性葡糖淀粉酶(GA)的FG-PKL菌株。所有酵母表达的外源性GA是木霉葡糖淀粉酶的相同变体。通过PCR确认表达盒的整合。

实例4.经修饰的CRZ1表达对乙醇生产的影响

相对于仅表达天然CRZ1的对照菌株，通过在Ankom烧瓶中在玉米液化物培养基中进行厌氧生长，针对乙醇生产筛选了表达整合的CRZ1.1.2的每种菌株的两个克隆。在55小时发酵结束时分析乙醇生产。注意到，以下每对数据均表示独立控制的实验，并且不应相互比较。

表2.变体的乙醇生产

在经修饰的CRZ1情况下观察到乙醇生产增加多达超过1.0％。

Claims

1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述细胞与所述亲本细胞相比生产增加量的活性CRZ1多肽，其中在相同发酵条件下与所述亲本细胞生产的醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中生产增加量的醇。

2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中与在相同发酵条件下的天然CRZ1多肽相比，所述活性CRZ1多肽表现出减少的磷酸化。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的细胞，其中与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的氨基酸残基。

4.如权利要求3所述的经修饰的细胞，其中与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的丝氨酸残基。

5.如权利要求1-4中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的所述亲本细胞中的天然CRZ1多肽的表达水平相比，所述经修饰的CRZ1突变多肽的表达的增加量是至少约500％、至少1,000％、至少1,500％、或甚至至少2,000％。

6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含所述磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。

7.如权利要求6所述的经修饰的细胞，其中所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。

8.如权利要求1-7中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

10.如权利要求1-9中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含用于制备醇的备选途径。

11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属物种。

12.如权利要求1-11中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述醇是乙醇。

13.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的醇生产的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中生产的量相比使活性CRZ1多肽的生产增加的遗传改变。

14.如权利要求13所述的方法，其中与在相同发酵条件下的天然CRZ1多肽相比，所述活性CRZ1多肽表现出减少的磷酸化。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的氨基酸残基。

16.如权利要求15所述的方法，其中与天然CRZ1多肽中的氨基酸残基相比，所述活性CRZ1多肽包括减少数量的能够磷酸化的丝氨酸残基。

17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述遗传改变导致如权利要求1-11中任一项所述的变体酵母或其变体。