CN105400770A - 一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法 - Google Patents
一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法,属于生物工程领域。本发明通过对光滑球拟酵母的Cgcrz1基因进行缺失或者过表达,相应降低或者提高了菌株的酸胁迫抗性。本发明还比较了缺失突变菌株Cgcrz1Δ在酸胁迫下细胞膜脂肪酸、甾醇成份及比例和通透性,结果发现Crz1p是光滑球拟酵母抵御酸胁迫的必需转录因子,过表达Crz1p可提高光滑球拟酵母酸胁迫抗性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法,属于生物工程领域。
背景技术
光滑球拟酵母(Candidaglabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外,C.glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程中,随着产物的积累,培养基pH迅速降低,导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近年来国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌体的酸耐受性和有机酸产量。对C.glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问题,但此机制尚不清楚。因此,进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要,这对提高有机酸产量具有指导意义。
目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展,蛋白质组学分析发现相对于高pH来说,光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发现光滑球拟酵母可通过CgYps1调节质子泵CgPma1的活性以适应酸胁迫环境。此外,研究者们对光滑球拟酵母转录因子进行的功能鉴定发现,Msn2p和Msn4p是抵御多种环境压力必不可少的转录因子,Yap1p、Skn7p和Slm7p通过抵御氧胁迫参与酸胁迫应答反应。
对光滑球拟酵母酸胁迫的耐受机制研究处于初步阶段,仍没有形成系统的转录调控网络,因此,从转录因子着手进行相关研究具有重要的意义。
发明内容
为了克服上述问题,本发明鉴定了一种调控光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子Crz1p的功能,发现光滑球拟酵母缺失CgCRZ1基因后,与野生型菌株相比,不能正常表达转录因子CgCrz1p,生长能力降低,且在酸胁迫条件下的细胞膜性能改变,胞内微环境发生变化,菌株的酸胁迫耐受性降低。
本发明提供一种改变光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法,是缺失突变CgCRZ1基因以降低菌株酸胁迫抗性,或者过表达CgCRZ1基因以提高菌株的酸胁迫抗性。
所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述光滑球拟酵母是CandidaglabrataATCC55。
在本发明的一种实施方式中,所述缺失突变具体是:将标记基因HIS3同基因CgCRZ1左臂和右臂连接起来,构建敲除框,将测序正确敲除框电击转化到光滑球拟酵母感受态细胞中,通过同源臂重组将基因CgCRZ1替换成标记基因HIS3,利用重组后的菌株含有基因CgHIS3而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgCRZ1基因的突变菌株,经基因组PCR和测序验证正确的突变菌株即为缺失突变CgCRZ1基因的菌株Cgcrz1Δ。
在本发明的一种实施方式中,所述过表达是将扩增CgCRZ1基因序列并克隆到质粒pY26上,由强启动子GPD1启动转录翻译,重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母。
在本发明的一种实施方式中,所述过表达是将CgCRZ1基因克隆到质粒pY26并在基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中过表达,利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株,验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1。
本发明还提供一种酸胁迫抗性降低的光滑球拟酵母,所述光滑球拟酵母缺失了CgCRZ1基因;所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。
本发明还提供一种酸胁迫抗性提高的光滑球拟酵母,所述光滑球拟酵母过表达CgCRZ1基因;所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述过表达具体是:扩增CgCRZ1基因序列,通过T4连接酶将CgCRZ1基因经酶切位点BamHI和StuI克隆到高拷贝质粒pY26上,由强启动子GPD1启动转录翻译,重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中,利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株,将经过质粒PCR和质粒酶切验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1,编号保存。
本发明还要求保护所述光滑球拟酵母在生产有机酸方面的应用,以及在食品、化工、制备药物方面的应用。
本发明还提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜组成的方法,所述方法是过表达CgCRZ1基因。
本发明的有益效果:
本发明鉴定了光滑球拟酵母中转录因子CgCrz1p的功能,通过缺失突变CgCRZ1基因降低了菌株酸胁迫抗性,或者过表达CgCRZ1基因提高了菌株的酸胁迫抗性。
附图说明
图1基因缺失菌株的构建及验证,A敲除框的构建,B基因缺失菌株的验证;
图2光滑球拟酵母生长的测定,A不同pH下的平板生长实验,B不同pH下生长曲线测定;
图3细胞膜性能测定结果,A脂肪酸含量测定,B甾醇成份及含量测定,C细胞膜通透性测定;
图4过表达菌株的构建及验证,A表达基因的扩增,B基因过表达菌株的验证;
图5光滑球拟酵母生长的测定,A不同pH下生长曲线测定;B在pH=2.3酸胁迫下,生长后期胞外pH值测定。
具体实施方式
以下是光滑球拟酵母(Candidaglabrata)菌株构建及验证、生长性能分析及细胞膜性能测定的实施例。
实施例1:缺失突变菌的构建
以C.glabrataATCC2001(wt)基因组为模板,分别以P1/P2(序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示)、P3/P4(序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示)、P5/P6(序列分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示)为引物,扩增出待敲除基因的左臂(L)、组氨酸基因(M)和右臂(R),经融合PCR构建敲除框CgCRZ1-LMR(图1)。出发菌株C.glabrataATCC55因缺失组氨酸基因不能在MM筛选培养基上生长,而突变菌株经同源重组后,因标记基因组氨酸表达而在MM培养基上生长。对转化子进行PCR验证,如图1所示,提取转化子的基因组,发现以P7/P8(序列分别如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示)为引物时,野生型菌株wt产生3.0kb左右基因片段,而转化子获得1.7kb左右的基因CgHIS及基因CgCRZ1的左右臂。将验证正确的突变菌株命名为Cgcrz1Δ。
P1:CGGGATCCCGATTAGTAGCGATAACGAGTTGGAC
P2:ACCCTCTTAACAAACGCCATTGCTGAATATTGCAAAATCTTGT
P3:TACAAGATTTTGCAATATTCAGCAATGGCGTTTGTTAAGAGGGTT
P4:ATACTGGAGGTTTGTGTTAATCTATGCTAGGACACCCTTAGTGG
P5:CCACTAAGGGTGTCCTAGCATAGATTAACACAAACCTCCAGTATT
P6:GGAATTCCGCAACCCCTTATTTCCTTAGAT
P7:TGGCACATATGCCTCGATGTA
P8:TTGTCTTAAATGCGTTGGC
实施例2:缺失突变菌的生长性能测定
通过平板生长实验和细胞生长测定对CgCRZ1进行功能鉴定:
1)平板生长实验:
将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67%YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids,2%Glucose,pH5.7)液体培养基中,30℃摇床培养12h至对数生长期,测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD600=l.0,以此为初始浓度,进行5次10倍梯度稀释,依次将4μL菌液点种在待测固体培养基上,30℃培养2天,观察菌体的生长情况并拍照。
2)细胞生长测定:
将对数期的待测菌株接种于20mL的YNB(0.67%YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids,2%Glucose,pH5.7)液体培养基中,30℃摇床培养12h至对数生长期,接种至不同pHYNB培养基中,初始OD600=0.1,30℃摇床培养,每隔一定的时间取菌液,稀释适当倍数,600nm测定OD值。
平板生长实验和生长曲线分析不同pH对菌株wt、Cgcrz1Δ生长的影响,如图3A、3B。缺失菌株Cgcrz1Δ在不同pH培养基中的生长,发现突变菌株Cgcrz1Δ在pH8.0时生长不受影响,当pH2.6时生长开始受到抑制,在pH2.3时则生长缓慢,以上结果表明,基因CgCRZ1的缺失降低了C.glabrata的生长能力和对酸性环境的耐受能力。
实施例3:缺失突变菌的细胞膜性能测定
通过测定细胞膜脂肪酸、细胞膜通透性,对光滑球拟酵母细胞膜性能进行评价。
(1)细胞膜脂肪酸测定
细胞培养:收集YNB-5.7和YNB-2.3处理12h的酵母细胞,用PBS缓冲液洗涤三遍,然后冷冻干燥后备用。脂质提取及处理:称取冷冻干燥后的菌体30mg,置于试管中,加入1ml溶液Ⅰ,100℃进行水浴30min。进行冰浴来迅速冷却,之后加入2mL溶液Ⅱ,混匀后在80℃水浴中处理5min。迅速冷却,并加入1.25mL溶液Ⅲ。摇匀震荡5min,之后保留上层溶液。然后在上层溶液中加入3ml溶液Ⅳ和几滴饱和氯化钠溶液,震荡摇匀5min。静置,等溶液分层后,吸取上层液体于气相样品管中,进行检测。
脂肪酸提取液及配置
溶液Ⅰ:氢氧化钠45g,甲醇150mL和超纯水150mL;(皂化液)
溶液Ⅱ:325mL,6.0mol.L-1盐酸和275mL甲醇;(甲基化)
溶液Ⅲ:200mL己烷和200mL甲基三丁基乙醚;(提取)
溶液Ⅳ:10.08g氢氧化钠,900mL超纯水。(碱洗)
色谱分析条件:PEG毛细管填充柱;载气:氦气;柱压:63.4kPa;流速:29.6mL/min;进样口温度:260℃;柱流量:0.5mL/min;检测器温度:280℃:柱温升温程序:初始柱温温度为100℃,时间为1min,随后以4℃/min的速率升高到250℃并在250℃保持5min,“C9一C20”的脂肪酸成分均可按各自的保留时间和质谱范围在图库中进行查找,所得数据为三次独立样品制备与测定的平均值。
细胞膜甾醇成份测定
1)细胞培养:将WT和基因缺陷型菌株,30℃,200rpm培养至对数中期,转接至YNB-5.7和YNB-2.3,30℃,200rpm,培养12h,收集上述培养后的细胞。4℃,5000rpm,15min,用PBS缓冲液洗涤三遍,然后冷冻干燥后备用。
2)称取30mg(干重)酵母细胞,加入40ul,0.5mg/mL的胆固醇作为内标。
3)皂化:加入甲醇配制的1.5MKOH,准确沸水浴皂化反应30min。
4)提取:皂化后,加入1mL正己烷,充分涡旋震荡,1000rpm,离心5min,吸取上清约600μL氮吹,干燥。
5)衍生化:每个离心管中加入适量含有MSTFA+TMCS的无水吡啶,30℃温育30min。
6)氮吹仪吹干,吸取100ul正己烷复溶。
酵母甾醇分析方法:气相色谱—飞行时间质谱(TOF)联用仪(Waters,USA)。固定相:硅胶毛细管柱(30m×0.25mm,0.25umDB-5MSstationaryphase,J&WScientific,Folsom,CA)。
质谱条件如下:
1.电离方式为电子轰击,电子束能量70eV,离子化电流40μA。
2.扫描范围在m/z50-800。
3.离子源温度为250℃。
4.进样温度为280℃。
5.氦气用作载气,91Kpa恒压模式下操作。
6.柱温保持70℃2min,以15℃/min的速度升至250℃,保持250℃11min,然后以2℃/min的速度升到300℃,维持3min。
(2)细胞膜通透性测定
细胞培养:收集YNB-5.7和YNB-2.3处理24h的酵母细胞,测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD600=l.0,吸取500μLOD=1.0的细胞菌液,PBS缓冲液洗涤,加入5μLPI和500μLPBS缓冲液,立即避光反应5min。采用荧光显微镜观测。
结果显示,pH5.7与pH2.3时野生型菌株wt和突变菌株Cgcrz1Δ的细胞膜脂肪酸、甾醇成份及比例和细胞膜通透性如图3所示。在同一pHout,与wt相比,Cgcrz1Δ不饱和脂肪酸(TUFA)含量及不饱和与饱和脂肪酸的比例(U/S)下降,饱和脂肪酸(TSFA)则上升,CgCRZ1Δ中不饱和脂肪酸C18:1呈现出较大下降幅度(图3A);在pH2.3时,与wt相比,突变菌株Cgcrz1Δ总甾醇含量下降85%,主要细胞膜甾醇-麦角甾醇同样下降85%,某些中间甾醇-粪甾醇几乎消失,严重破坏了Cgcrz1Δ细胞膜结构成份,严重影响细胞膜流动性和通透性(图3B);在pH=2.3条件下培养24h,野生型菌株wt酸胁迫条件下仅有约15%酵母死亡,而突变菌株Cgcrz1Δ约有90%酵母死亡(图3C)。上述结果表明,突变菌株Cgcrz1Δ在pH2.3条件下细胞生长减弱的原因在于细胞膜结构成份被破坏,引起细胞膜流动性、通透性和完整性遭到破坏,进而造成细胞胞内微环境变化。
实施例4:过表达菌株的构建
以P9/P10(序列分别如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示)将扩增出的带有酶切位点BamHI和StuI的片段CgCRZ1(图4,1.9kb)经双酶切消化后连接到高拷贝质粒pY26上,由强启动子GPD1启动转录翻译,构建质粒pY26-Cgcrz1。突变菌株Cgcrz1Δ因缺失尿嘧啶基因不能在MM筛选培养基上生长,而质粒pY26上的尿嘧啶基因可使过表达菌株获得这一生长能力。菌落PCR筛选验证发现,作为对照的突变菌株Cgcrz1Δ无条带产生,而转化子扩增得到特异性片段(图4,1.9kb),将此菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1。
P9:CGCGGATCCATGGGCGATAACGAAGAGG
P10:AAAAGGCCTTTCCAAAGTAACACCCATCTCAG
实施例5:过表达菌株的生长性能测定
通过平板生长实验和细胞生长测定对CgCRZ1进行功能鉴定:
1)细胞生长测定:
将对数期的待测菌株接种于20mL的YNB(0.67%YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids,2%Glucose,pH5.7)液体培养基中,30℃摇床培养12h至对数生长期,接种至不同pHYNB培养基中,初始OD600=0.1,30℃摇床培养,每隔一定的时间取菌液,稀释适当倍数,600nm测定OD值。
2)pH=2.3培养条件下胞外pH值测定
将接种至pH=2.3的YNB培养基的wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1菌株培养至平台期后期,测定wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1菌株胞外pH即YNB培养基pH。
生长曲线分析不同pH对菌株wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1生长的影响,如图5A、5B,对于过表达菌株Cgcrz1Δ/CgCRZ1,在pH=5.7正常培养条件下,菌浓比wt多6个OD,当在pH2.3时,生长不受影响,菌浓比wt多4个OD;在pH=2.3条件下培养至平台期后期,菌株wt、Cgcrz1Δ胞外pH即YNB培养基pH在2.2左右,而过表达菌株Cgcrz1Δ/CgCRZ1胞外pH即YNB培养基pH在2.0左右,以上结果表明,基因CgCRZ1的过表达提高了C.glabrata的生长能力和对酸性环境的耐受能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种改变光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法,其特征在于,所述方法是缺失突变CgCRZ1基因以降低菌株酸胁迫抗性,或者过表达CgCRZ1基因以提高菌株的酸胁迫抗性。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述光滑球拟酵母是CandidaglabrataATCC55。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述缺失突变具体是:将标记基因HIS3同基因CgCRZ1左臂和右臂连接起来,构建敲除框,将测序正确敲除框电击转化到光滑球拟酵母感受态细胞中,通过同源臂重组将基因CgCRZ1替换成标记基因HIS3,利用重组后的菌株含有基因CgHIS3而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgCRZ1基因的突变菌株,经基因组PCR和测序验证正确的突变菌株即为缺失突变CgCRZ1基因的菌株Cgcrz1Δ。
5.一种酸胁迫抗性降低的光滑球拟酵母,其特征在于,所述光滑球拟酵母缺失了CgCRZ1基因。
6.一种酸胁迫抗性提高的光滑球拟酵母,其特征在于,所述光滑球拟酵母过表达CgCRZ1基因。
7.根据权利要求6所述的光滑球拟酵母,其特征在于,所述过表达具体是将CgCRZ1基因连接到质粒pY26上,由强启动子GPD1启动转录翻译,得到重组质粒pY26-Cgcrz1,然后将重组质粒转化到光滑球拟酵母中。
8.权利要求6或7所述光滑球拟酵母在生产有机酸方面的应用。
9.权利要求6或7所述光滑球拟酵母在食品、化工、制备药物方面的应用。
10.一种改变光滑球拟酵母细胞膜组成的方法,其特征在于,所述方法是过表达CgCRZ1基因。
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