CN105062981A - 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N315及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将米根霉的丙酮酸羧化酶的N315位点突变成了苯丙氨酸，得到的突变体酶活提高了18.6％。在敲除PDC1和ADH1的基础上敲除基因FUM1，同时过量表达丙酮酸羧化酶突变体N315F，发现延胡索酸产量提高了22.0％。同时通过减少装液量，增加溶氧，延胡索酸产量达到318±11.2mg/L，较装液量为100mL/250mL时(253±9.0mg/L)提高了25.7％。该发明有效强化了碳代谢流由丙酮酸进入延胡索酸的合成途径，为构建工程酵母高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景。

Description

一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N315F及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N315F及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(GeneralRegardedAsSafe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件下分批发酵会产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物的发酵来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可以减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失；在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧酸的进一步代谢，来构建目标羧酸的合成途径。

丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为“生物阀门”，如何强化丙酮酸羧化反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸的一个关键问题。已有研究表明细胞中丙酮酸羧化酶活性的高低对苹果酸、琥珀酸、谷氨酸的积累有着重要作用。任何以二元羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一个问题：如何强化丙酮酸羧化反应，促进碳流由丙酮酸流向目标羧酸的合成途径？如何提高丙酮酸羧化酶的活性？本发明所提供的方案，对于利用酿酒酵母生产羧酸的研究具有普遍的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸羧化酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，将第315位的天冬酰胺突变成为苯丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以同时缺失了丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如GeneID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如GeneID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如GeneID:855866所示。

本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二元羧酸的方法。

所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。

在本发明的一种实施方式中，所述二元羧酸是延胡索酸。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的装液量为16％。

在本发明的一种实施方式中，将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的种子液，接种至装液量为16％的发酵培养基中，于28-32℃、150-250rpm条件下进行培养。

在本发明的一种实施方式中，将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有：无氨基酵母氮源3.4g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖40g/L，亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，碳酸钙5g/L。

本发明还涉及所述突变体以及所述突变体得到的延胡索酸在食品、饲料、化工、药物制备等方面的应用。

本发明的突变体命名：是以SEQIDNO.1所示氨基酸序列为基准，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。比如N315F代表将位置315的氨基酸由亲本的天冬酰胺(Asn，N)替换为苯丙氨酸(Phe,F)。

本发明的有益效果：(1)对米根霉的丙酮酸羧化酶的N315位点进行饱和突变，得到了比酶活提高的丙酮酸羧化酶突变体N315F，其比酶活较亲本提高了18.6％；(2)构建了过表达丙酮酸羧化酶突变体的酿酒酵母，能够有效提高二元羧酸的产量，为高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景；在丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同时缺失的酵母菌中表达丙酮酸羧化酶N315F，延胡索酸产量提高了22.0％；(3)通过降低装液量提高溶氧，可使延胡索酸产量进一步提高到318mg/L，提高了25.7％。

附图说明

图1：RoPYC-GFP蛋白定位观察；

图2：丙酮酸羧化酶突变菌株的富马酸产量对比图；

图3：RoPYCN315位点定点突变对丙酮酸羧化酶活性的影响；

图4：不同装液量对表达RoPYC及RoPYCN315F的工程菌的延胡索酸积累的影响。

具体实施方式

乙醇、残糖含量及延胡索酸的测定方法：采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)检测乙醇和残糖含量，利用VWD(紫外检测器)检测延胡索酸含量，液相色谱方法如下：高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，型号为1515，色谱柱为AminexHPX-87Hcolumn(Bio-Rad)。柱温：35℃；流动相：0.0275％(v/v)稀硫酸，经0.22μm滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/min；检测时间：25min；进样量：20μL。

生物量的测定方法(Bio-Rid核酸仪)：用0.1MHCl稀释适当的倍数，设定波长为600nm，取200μL测定其吸光值。

种子培养基：葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。

发酵培养基：无氨基酵母氮源3.4g/L,硫酸铵5g/L,葡萄糖40g/L，按要求分别添加亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸钙5g/L，装液量先为100mL/250mL，后改为40mL/250mL。可添加0-128μg/L的生物素。

酵母转化方法(质粒)：(1)在3mLYPD液体培养基中接入平板活化的酿酒酵母单菌落，30℃、220rpm培养过夜；(2)倒满EP管菌液，在4000rpm条件下进行室温1min离心；(3)适量无菌水水洗，在4000rpm条件下进行室温1min离心；(4)依次加入1.0MLiAc36μL，10mg/mLssDNA10μL(ssDNA提前沸水浴5min，冰上放置5min)，质粒500ng，50％PEG240μL，温和混匀；(5)42℃热激30分钟；(6)在4000rpm条件下进行室温1min离心，加1mL无菌水水洗；(7)4000rpm离心1min，留适量水吹吸细胞，涂布选择性平板，30℃培养3-5d。

实施例1RoPYC(米根霉来源的丙酮酸羧化酶)在酿酒酵母中的定位

1、TEF1promoter和RoPYC基因ORF克隆到pGFP33载体

按照同源重组试剂盒原理，设计两端带有15个碱基以上与载体同源的引物，如表1，小写字母为同源臂，大写字母为PCR引物。

表1扩增RoPYC基因的引物

以pY15TEF1-RoPYC为模板(Xuetal.FumaricacidproductioninSaccharomycescerevisiaebyinsilicoaidedmetabolicengineering,2012)，RoPYC-F、RoPYC-R(序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示)为引物扩增出TEF1p以及RoPYC的ORF框(得到的PCR产物含有编码氨基酸序列SEQIDNO.1的核苷酸序列)，将扩增产物连接到pGFP33载体，转化大肠感受态细胞，涂布添加有氨苄青霉素的LB平板。菌落PCR验证长出的转化子以及提质粒酶切验证，将正确的转化子进行保菌并测序，质粒名称命名为pGFP33-RoPYC。

2、RoPYC在酿酒酵母中的表达

构建三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1(构建方法可参考申请号为201410340560.1的专利申请)，将上述构建的重组质粒pGFP33-RoPYC转化到三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1，转化方法见具体实施方式，以期在该菌中过表达氨基酸序列为SEQIDNO.1的RoPYC，进而研究其定位。

3、RoPYC定位研究

从SD-Ura平板上取活化的基因工程菌菌落接种于3mLSD-Ura液体培养基中，30℃，220rpm培养过夜。取菌液500μL接入新的4.5mLSD-Ura液体培养基中。培养4h，使细胞处于对数生长期。取1mL菌液倒入1.5mLEP管中，加入1μLDAPI染液，充分混匀，冰上避光染色10min。4000rpm离心1min，弃掉部分上清。取适量细胞制片，滴上松柏油，用Nikon80i荧光显微镜观察。放大100倍，增益值为2.0，曝光时间1s，进行荧光检测，拍下DIC和绿色荧光、蓝色荧光激发下的照片。每个菌株随机选取3个转化子，用荧光显微镜100×物镜观察DIC视野、绿光及蓝光下的细胞形态，结果如图1所示，结果表明该酶定位在酿酒酵母细胞的胞质中。

实施例2RoPYC定点突变及表达

用PCR方法进行定点突变，对RoPYC的N315位点进行饱和突变，将第315位点的天冬酰胺突变成其他19个氨基酸。以pY15TEF1-RoPYC质粒为模板、含有突变位点的F和R为引物、Takara公司高保真酶PrimeSTARGXL进行PCR扩增出整个质粒。酶切体系包含1μLPCR产物以及1μLDpnI酶，总体积20μL，37℃酶切过夜。酶切产物进行片段纯化。取纯化产物5μL转化30μL感受态细胞Trans1-T1，涂布LA平板，长出的转化子接种LA培养基，提质粒送去上海生工测序。

其中，用于N315F突变的引物F(Phe)、R(Phe)(序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示)，如表2所示。

表2定点突变引物

注：斜体加下划线的为突变碱基，它们对应的氨基酸在右侧。

选择测序正确的突变体，在三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1中过表达该突变体，得到了一系列基因工程菌。将基因工程菌菌株，在同条件下，进行了发酵实验，比较了来源于米根霉中PYC的N315位点的氨基酸饱和突变对酿酒酵母产延胡索酸的影响，结果如图2所示，结果显示发酵生产延胡索酸的产量可达200mg/L以上，其中表达N315F的工程菌产量达到了244±9.0mg/L，比表达亲本RoPYC的工程菌的200±8.6mg/L提高了22％。

实施例3突变体N315F的表达及延胡索酸的生产

比较了丙酮酸羧化酶突变体N315F及亲本酶的比酶活，以及不同装液量加对表达N315F的基因工程菌的延胡索酸积累的影响，结果如图3和图4所示。

培养条件：将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。

由图3可以看出，突变体N315F的酶活增加，分别比亲本增加了18.6％。

由图4可以看出，减少装液量，增加溶氧有利于延胡索酸的积累，当装液量为40mL/250mL时，延胡索酸产量达到318±11.2mg/L，较装液量为100mL/250mL时(253±9.0mg/L)提高了25.7％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，将第315位的天冬酰胺突变成为苯丙氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或基因工程菌。

4.权利要求2所述的载体或基因工程菌在二元羧酸相关的食品、饲料、化工、药物制备方面的应用。

5.应用权利要求1所述突变体生产二元羧酸的方法。

6.一种利用权利要求1所述突变体促进延胡索酸积累的方法，其特征在于，在编码丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1的基因同时缺失的酵母菌中，过表达所述丙酮酸羧化酶突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如GeneID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如GeneID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如GeneID:855866所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在发酵培养过程中通过减少装液量来增加溶氧。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的种子液，接种至发酵培养基，于28-32℃、150-250rpm条件下进行培养。