CN108474012B - 有机酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够高效地制造有机酸的新方法。一种有机酸的制造方法，其是使用丝状菌由培养基中的碳源制造有机酸的方法，其中，在含有碳源且将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的液体培养基中培养丝状菌，得到有机酸。

Description

有机酸的制造方法
技术领域
本发明涉及有机酸、特别是富马酸的制造方法。
背景技术
富马酸被用作为醇酸树脂等的塑料原料、食品添加物、入浴剂、转换成天冬氨酸等的基础化学品的中间原料等。工业上富马酸作为以苯、丁烷为原料的石油化学制品制造，但是，近年来，从化石资源的枯竭和地球温暖化等的环境方面考虑，要求使用可再生资源来制造富马酸。
作为使用可再生资源的富马酸的制造方法，例如，已知有利用德氏根霉(Rhizopusdelemar)等的丝状菌的培养由糖类生成富马酸的方法。
以往认为：在丝状菌的培养中，富马酸主要在从由碳源生成的丙酮酸开始的还原TCA回路中生成。另一方面，也存在从丙酮酸生成乙醇的通路，因此，在利用丝状菌的富马酸生成中，存在作为副产物生成乙醇的问题。因此，抑制乙醇的副产、且提高向富马酸的转变率是在提高富马酸制造效率时重要的问题。
以往，作为用于提高富马酸的生成率的技术，例如，报道了如下的方法：在利用含有碳源的培养介质中使根霉(Rhizopus)属的霉菌增殖来制造富马酸的发酵工序中，将在培养介质中溶解的氧的浓度在细胞增殖阶段中保持为饱和的约80～100％并且在酸产生阶段中保持为饱和的约30～80％的方法(专利文献1)。
(专利文献)
(专利文献1)日本特表平3－505396号公报
发明内容
本发明提供一种有机酸的制造方法，其是使用丝状菌由培养基中的碳源制造有机酸的方法，其中，在含有碳源且将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的液体培养基中培养丝状菌，得到有机酸。
具体实施方式
但是，本发明的发明人发现：在将上述专利文献1所述的在培养基中溶解的氧的浓度以在富马酸产生阶段中为饱和的约30～80％、即2.1～5.7ppm的范围的方式进行控制并进行丝状菌的培养工序时，有时会生成大量的乙醇，无法得到充分的富马酸的生成收率。
因此，本发明涉及提供一种能够高效地制造有机酸、特别是富马酸的新的方法。
本发明的发明人为了提高利用丝状菌的有机酸收率进行了研究，结果发现：通过在培养丝状菌时提高含有碳源的液体培养基的溶存氧浓度，并将其控制在规定的范围内，能够抑制由碳源的乙醇的副产，并能够提高向有机酸的转化率。
根据本发明，能够提高由碳源向有机酸的转化率，能够使用丝状菌以高收率制造有机酸。
本发明的有机酸的制造方法是：在含有碳源且将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的液体培养基中培养丝状菌，得到有机酸。
在本发明中的有机酸是指，利用丝状菌的培养过程由碳源产生的有机酸，例如，可以列举富马酸、乳酸、衣康酸、苹果酸、丙酮酸等，其中，优选为选自富马酸、丙酮酸、乳酸和苹果酸中的至少1种，进一步优选为富马酸、丙酮酸，进一步优选为富马酸。
(丝状菌)
作为本发明中所使用的丝状菌，可以列举属于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属的微生物等。例如，可以列举德氏根霉(Rhizopusdelemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、东北毛霉(Mucor mandshuricus)等。
其中，从有机酸的高生产性的观点考虑，优选根霉(Rhizopus)属菌，更优选德氏根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)。
在本发明中，可以将丝状菌以颗粒状、棉絮状、块状、固定化丝状菌的形态单独使用，也可以作为混合物使用。在这里，本说明书中“颗粒状”是指通过液体培养菌丝自发形成的数百μm～数mm的大小的菌丝块。另外，“棉絮状”是指菌丝以数十μm的大小松散地存在的丝状菌。“块状”是指菌丝彼此凝集并成长为数十mm以上的大小的菌丝块。“固定化丝状菌”是指保持于或包埋于载体的丝状菌。
其中，从有机酸的高生产性的观点和操作性的观点考虑，优选为丝状菌颗粒、固定化丝状菌，更优选为丝状菌颗粒。
这些可以使用从市场上购入的丝状菌。另外，例如，就丝状菌颗粒或固定化丝状菌而言，可以使用通过以下的工序制备的丝状菌。
(丝状菌颗粒的制备工序)
可以通过培养来制备丝状菌颗粒。
作为培养中所使用的培养基，只要是能够培育丝状菌的液体培养基即可，可以是合成培养基、天然培养基以及添加了天然成分的半合成培养基的任意形态。培养基中一般含有后述的碳源、氮源、无机盐等，对于各成分的组成可以适当选择。
作为培养条件，从丝状菌颗粒的培育的观点考虑，培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。另外，从丝状菌颗粒的培育的观点考虑，培养基在25℃的pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为6以下。
关于培养方法，可以采用公知的方法。例如，将丝状菌的孢子在液体培养基中接种之后，使孢子发芽形成菌丝，由该菌丝形成菌体使其颗粒化。该培养通常在好氧条件下进行。
将丝状菌的孢子在液体培养基中播种之后，从丝状菌颗粒的培育的观点考虑，培养时间优选为1日以上，更优选为3日以上，另外，优选为7日以内，更优选为6日以内。
就培养中所使用的培养槽而言，可以适当采用现有公知的培养槽。具体而言，可以列举通气搅拌型培养槽、气泡塔型培养槽和流动床培养槽等，从丝状菌颗粒的培育的观点考虑，通气条件优选为0.1vvm以上，更优选为0.3vvm以上，另外，优选为4vvm以下，更优选为2vvm以下。
在培养之后，可以将丝状菌颗粒与培养液一起从培养槽取出，通过过滤、离心分离等简便的操作进行分离回收，并将丝状菌颗粒用于生成有机酸的培养工序；也可以在培养槽中使丝状菌颗粒残留，用同一培养槽进行培养工序。
另外，也可以将本工序进一步分成2个以上的工序来进行。
(固定化丝状菌的制备工序)
可以通过培养来制备固定化丝状菌。
关于培养方法，可以采用公知的方法。例如，将丝状菌的孢子在存在有丝状菌固定化载体的液体培养基中播种后，使孢子发芽形成菌丝，由捕捉到载体内的菌丝制备固定化丝状菌。作为固定化载体，能够利用聚氨酯类聚合物、烯烃类聚合物、二烯类聚合物、缩合类聚合物、硅酮类聚合物、或氟类聚合物等。
作为载体的形状，可以为平板状、多层板状、波浪板状、四面体状、球状、细绳状、网状、圆柱状、格子状、圆筒状等的任意形状。
另外，作为用于丝状菌的固定化的培养基和培养槽，能够使用与上述的丝状菌颗粒同样的培养基和培养槽，另外，关于培养条件，也能够采用与上述的丝状菌颗粒同样的条件。
另外，在培养后，对于固形化丝状菌而言，可以通过与丝状菌颗粒同样的操作而分离和回收，并用于生成有机酸的培养工序。也可以在培养槽残留固定化丝状菌，用同一培养槽进行培养工序。
另外，也可以将本工序进一步分成2个以上的工序来进行。
(含有碳源的液体培养基)
本发明中有机酸的生成中所使用的液体培养基中含有碳源。
液体培养基可以为合成培养基、天然培养基、或在合成培养基中添加了天然成分的半合成培养基中的任意形态。
作为碳源，例如，可以列举甘油、山梨糖醇、糖类。从有机酸的高生产性的观点考虑，优选为糖类。
作为糖类，可以列举葡萄糖、果糖、木糖等的单糖类，蔗糖、乳糖、麦芽糖等的二糖类。糖类可以为无水物或水合物。其中，从有机酸的高生产性的观点考虑，碳源优选为葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、山梨糖醇，更优选为葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖，进一步优选为葡萄糖。
从有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基中的碳源的浓度优选为1质量％以上，更优选为2质量％以上，进一步优选为3质量％以上，另外，优选为40质量％以下，更优选为30质量％以下，进一步优选为20质量％以下，更进一步优选为15质量％以下。
在液体培养基中，除了碳源以外，还可以含有氮源、无机盐类、其它必要的营养源等。另外，当使用的碳源中含有适合于培养的浓度的上述营养源时，也可以仅使用碳源。
作为氮源，可以列举硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等的含氮化合物。
从有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基中的氮浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.002质量％以上，进一步优选为0.004质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.08质量％以下，进一步优选为0.06质量％以下。
作为无机盐，可以列举硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的例子，可以列举硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠等。作为镁盐的例子，可以列举硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的例子，可以列举硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。
从有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基中的硫酸根离子的浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.005质量％以上，进一步优选为0.01质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.08质量％以下，进一步优选为0.04质量％以下。
另外，从有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基中的镁离子浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.002质量％以上，另外，优选为0.5质量％以下，更优选为0.2质量％以下，进一步优选为0.1质量％以下。
另外，从有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基中的锌离子浓度优选为0.00001质量％以上，更优选为0.00005质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.01质量％以下，进一步优选为0.005质量％以下。
从菌体的培育、有机酸的高生产性的观点考虑，液体培养基的pH(35℃)优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为6以下。
液体培养基的pH(35℃)优选为2～7，更优选为3～6。可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等的碱以及硫酸、盐酸等的酸来进行对pH的控制。
(培养方法)
通过在上述液体培养基中培养丝状菌来进行有机酸的生成。就培养的条件而言，按照通常的培养条件即可。例如，从菌体的培育、有机酸特别是富马酸的高生产性的观点考虑，培养温度优选为20℃以上，更优选为30℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为37℃以下。
关于培养中所使用的培养槽，可以适当采用现有公知的培养槽，从有机酸特别是富马酸的高生产性的观点考虑，优选为通气搅拌型培养槽、气泡塔型培养槽和流动床培养槽，可以以分批式、半分批式和连续式的任一种方式进行。
关于培养期间，可以进行适当的调整。
本发明中，有机酸特别是富马酸的生成是在将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的液体培养基中进行的。
从抑制乙醇的副产、以及提高有机酸特别是富马酸的收率的观点考虑，培养工序中液体培养基中的溶存氧浓度优选为8.5ppm以上，更优选为9ppm以上，进一步优选为12ppm以上，更进一步优选为15ppm以上，更进一步优选为28ppm以上，另外，优选为34ppm以下，进一步优选为33ppm以下。
液体培养基中的溶存氧浓度优选为8.5～34ppm，更优选为9～33ppm，进一步优选为12～33ppm，进一步优选为15～33ppm，进一步优选为28～33ppm。
另外，就液体培养基中的溶存氧浓度的控制而言，优选边经时监控溶存氧浓度边进行该控制，可以通过后述实施例中所述的方法来测定该溶存氧浓度。
液体培养基中的溶存氧浓度通过通气氧浓度、通气速度(通气量)、搅拌转速、压力等来进行控制。
在本发明中，“通气氧浓度”是指对培养基所供给的气体中的氧浓度，从将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的观点考虑，通气氧浓度为21％(体积比率，以下相同)以上，优选为35％以上，更优选为40％以上。作为上限，通气氧浓度优选为100％。可以根据培养举动来改变通气氧浓度。作为得到氧浓度为21％以上的气体的方法，可以列举例如深冷分离法、PSA法(吸附法)、膜分离法等。
通气速度(通气量)优选为0.1vvm以上，更优选为0.2vvm以上，另外，优选为2vvm以下，更优选为1vvm以下。
另外，就搅拌转速而言，优选为使对培养基供给的气体分散的条件，可以根据规模进行适当的调整。就压力而言，优选从常压到微加压的条件，加压时，优选0～0.1MPa的范围。
在有机酸特别是富马酸的生成中，由于生成的有机酸会使培养液中的pH降低，因此一般边使用中和剂边进行中和边进行培养。
关于pH调整中所使用的中和剂，例如可以列举碱金属或碱土金属的氢氧化物、碱金属或碱土金属的碳酸盐、铵化合物以及这些的混合物。其中，从有机酸、特别是富马酸的高生产性的观点考虑，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸镁、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵，更优选为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾，进一步优选为氢氧化钠。这些可以单独使用或组合2种以上使用。
另外，生成的有机酸可以与中和剂形成盐，以富马酸盐的形态存在。
通过这样的培养，在培养基中蓄积有机酸。
对于含有有机酸的培养液，优选在培养结束后通过适当的分离手段、例如离心分离、精密过滤等的膜处理，从培养物中除去微生物等的不溶物。这些可以在培养槽内进行，也可以暂时取出到槽外来进行。另一方面，对于从培养液分离得到的丝状菌而言，可以再利用于有机酸生产中。
根据本发明，能够抑制来自碳源的乙醇的副产，并且能够提高向有机酸的转化率。具体而言，能够以40％以上、更优选为50％以上的转化率由葡萄糖制造有机酸。
在这里，“有机酸转化率(％)”是指，培养后生成的有机酸浓度除以有机酸的培养生产中消耗的葡萄糖浓度得到的值。关于有机酸转化率的算出方法的详细内容，在实施例中记载。
对于所得到的含有有机酸的培养液，根据需要进行浓缩之后，通过晶析法、离子交换法、溶剂提取出法、或者将有机酸作为碱土金属盐析出之后使析出物酸分解的方法等的方法，可以从培养液分离并回收有机酸。
关于上述的实施方式，本发明进一步公开以下的制造方法。
＜1＞一种有机酸的制造方法，其是使用丝状菌由培养基中的碳源制造有机酸的方法，其中，在含有碳源且将溶存氧浓度控制为8ppm以上、35ppm以下的液体培养基中培养丝状菌，得到有机酸。
＜2＞如＜1＞所述的有机酸的制造方法，其中，丝状菌优选为属于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属的微生物，更优选为德氏根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、东北毛霉(Mucor mandshuricus)。
＜3＞如＜1＞所述的有机酸的制造方法，其中，丝状菌优选为根霉(Rhizopus)属菌，更优选为德氏根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)。
＜4＞如＜1＞～＜3＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，丝状菌优选为选自颗粒状、棉絮状、块状以及固定化丝状菌中的形态，更优选为选自丝状菌颗粒以及固定化丝状菌中的形态，进一步优选为丝状菌颗粒。
＜5＞如＜1＞～＜4＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，碳源优选为选自甘油、山梨糖醇以及糖类中的至少1种，更优选为糖类，另外，更优选为选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖以及山梨糖醇中的至少1种，进一步优选为选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖以及麦芽糖中的至少1种，进一步优选为葡萄糖。
＜6＞如＜1＞～＜5＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的碳源的浓度优选为1质量％以上，更优选为2质量％以上，进一步优选为3质量％以上，另外，优选为40质量％以下，更优选为30质量％以下，进一步优选为20质量％以下，更进一步优选为15质量％以下，另外，优选为1～40质量％，更优选为2～30质量％，进一步优选为3～20质量％，进一步优选为3～20质量％。
＜7＞如＜1＞～＜6＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基优选还含有氮源和无机盐类。
＜8＞如＜1＞～＜7＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，氮源优选为硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾或硝酸钠，无机盐优选为硫酸盐、镁盐或锌盐，更优选为硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硝酸镁、氯化镁、硫酸锌、硝酸锌或氯化锌。
＜9＞如＜7＞或＜8＞所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的氮浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.002质量％以上，进一步优选为0.004质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.08质量％以下，进一步优选为0.06质量％以下，另外，优选为0.001～0.1质量％，更优选为0.002～0.08质量％，进一步优选为0.004～0.06质量％。
＜10＞如＜7＞或＜8＞所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的硫酸根离子浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.005质量％以上，进一步优选为0.01质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.08质量％以下，进一步优选为0.04质量％以下，优选为0.001～0.1质量％，更优选为0.005～0.08质量％，进一步优选为0.01～0.04质量％。
＜11＞如＜7＞或＜8＞所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的镁离子浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.002质量％以上，另外，优选为0.5质量％以下，更优选为0.2质量％以下，进一步优选为0.1质量％以下，另外，优选为0.001～0.5质量％，更优选为0.002～0.2质量％，进一步优选为0.002～0.1质量％。
＜12＞如＜7＞或＜8＞所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的锌离子浓度优选为0.00001质量％以上，更优选为0.00005质量％以上，另外，优选为0.1质量％以下，更优选为0.01质量％以下，进一步优选为0.005质量％以下，另外，优选为0.00001～0.1质量％，更优选为0.00005～0.01质量％，进一步优选为0.00005～0.005质量％。
＜13＞如＜1＞～＜12＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基的pH(35℃)优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为6以下，另外，优选为2～7，更优选为3～6。
＜14＞如＜1＞～＜13＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，培养温度优选为20℃以上，更优选为30℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为37℃以下，另外，优选为20～40℃，更优选为30～37℃。
＜15＞如＜1＞～＜14＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，液体培养基中的溶存氧浓度优选为8.5ppm以上，更优选为9ppm以上，进一步优选为12ppm以上，更进一步优选为15ppm以上，更进一步优选为28ppm以上，另外，优选为34ppm以下，进一步优选为33ppm以下，另外，优选为8.5～34ppm，更优选为9～33ppm，进一步优选为12～33ppm，进一步优选为15～33ppm，进一步优选为28～33ppm。
＜16＞如＜1＞～＜15＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，优选通过通气氧浓度、通气速度(通气量)、搅拌转速或压力来控制液体培养基中的溶存氧浓度。
＜17＞如＜16＞所述的有机酸的制造方法，其中，通气氧浓度优选为21％(体积比率，以下相同)以上，更优选为35％以上，更优选为40％以上，另外，优选为100％以下，另外，优选为21～100％，更优选为35～100％，进一步优选为40～100％。
＜18＞如＜16＞或＜17＞所述的有机酸的制造方法，其中，通气速度(通气量)优选为0.1vvm以上，更优选为0.2vvm以上，另外，优选为2vvm以下，更优选为1vvm以下，另外，优选为0.1～2vvm，更优选为0.2～1vvm。
＜19＞如＜16＞～＜18＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，压力优选为从常压到微加压的条件，加压时优选为0～0.1MPa的范围。
＜20＞如＜1＞～＜19＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，优选以40％以上、更优选以50％以上的转化率由葡萄糖制造有机酸。
＜21＞如＜1＞～＜20＞中的任一项所述的有机酸的制造方法，其中，有机酸优选为选自富马酸、乳酸、衣康酸、苹果酸以及丙酮酸中的至少1种，更优选为选自富马酸、丙酮酸、乳酸以及苹果酸中的至少1种，进一步优选为选自富马酸以及丙酮酸中的至少1种，进一步优选为富马酸。
实施例
＜分析方法＞
[利用高效液相色谱(HPLC)的各种成分的测定]
用0.0085当量硫酸水溶液适当稀释培养液，使用孔径为0.22μm的乙酸纤维素制过滤膜(ADVANTEC公司制)进行过滤，作为HPLC分析用样品。HPLC的分析条件如下所述。
·柱：ICSep ICE－ION－300
·洗脱液：0.0085当量硫酸、0.4mL/min
·检测法i：RI(HITACHI、L－2490)
·检测法ii：UV(HITACHI、L－2455、测定波长250nm)
·柱温度：40℃
·注入液量：20μL
·保持时间：40min
该分析系统中的各成分的保持时间如下所述。
·丙酮酸：15min
·葡萄糖：16min
·富马酸：26min
·乙醇：34min
[溶存氧浓度的测定]
使用METTLER TOLEDO公司制的DO传感器(O24100e)，进行培养液中的溶存氧浓度的测定。
＜丝状菌颗粒的制备＞
〔孢子悬浊液的制备〕
菌株使用从独立行政法人产品评价技术基础机构(NITE：National Institute ofTechnology and Evaluation)购入的丝状菌德氏根霉(Rhizopus delemar)JCM5557和NBRC5441。对于丝状菌，分别在形成于各个试管内的斜面状琼脂培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(Difco Potato Dextrose Agar)、Becton，Dickinson and Company)上划线/涂布菌体，在30℃静置培养，定期进行传代。菌体使用时，在菌体增殖了的试验管中添加10mL的灭菌蒸馏水后，使用振荡混合器搅拌4分钟，由此回收孢子，再添加无菌的蒸馏水进行稀释，由此，形成调整为1×106孢子/毫升(spores/mL)的孢子悬浊液。
〔丝状菌的颗粒化〕
按照以下的2阶段培养来进行丝状菌颗粒的制备。
第一阶段的培养为：将装入有200mL的PDB培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(DifcoPotato Dextrose Broth)、Becton，Dickinsonand Company)的500mL容量的带有导流板的三角烧瓶灭菌，将用上述方法制备的孢子悬浊液以成为1×104个－孢子/mL的方式进行播种，在pH为3～6的范围，以27℃、170r/m(PRECI公司、PRXYg－98R)的培养条件，进行3天的培养。
第二阶段的培养为：将装入有颗粒形成培养基(葡萄糖(和光纯药工业公司制)10质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％、磷酸二氢钾0.06质量％)500mL的1L容量的通气搅拌槽灭菌，播种第一阶段的培养液500mL分量的菌体，以27℃、搅拌速度500r/min、以通气速度0.3vvm供给空气的条件，进行2天的培养。关于pH，适当地添加7N氢氧化钠溶液，维持于pH(27℃)4.0。
〔颗粒的回收〕
将在上述各阶段中得到的丝状菌颗粒培养液用尼龙网格过滤器过滤数十秒直至滤液的滴落停止，得到潮湿状态的丝状菌颗粒。将在第二阶段得到的颗粒迅速地供给给下述培养工序。
＜有机酸的制造＞
〔培养方法〕
实施例1
将液体培养基(组成：葡萄糖(和光纯药工业公司制)10质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％)500mL添加到灭过菌的1L容量的通气搅拌槽中，接着添加上述所制备的JCM5557丝状菌颗粒的全部量(潮湿状态)。此后立即进行培养第0小时的取样，之后，边使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)流通氧浓度为100％的气体，并以温度35℃、搅拌转速500r/min、通气速度0.3vvm的条件，边进行经时取样，边进行2天搅拌培养。
在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为32ppm。另外，在培养期间，对于培养液的pH，通过适当添加7N氢氧化钠溶液，维持为pH(35℃)4.0。培养结束后，通过对培养液进行过滤以除去菌体，得到含有富马酸的培养液。
实施例2
将使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)生成的气体与空气混合，使通气氧浓度成为50％，除此以外，按照与实施例1同样地进行培养，得到含有富马酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为9.5ppm。
实施例3
将使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)生成的气体与空气混合，使通气氧浓度成为35％，除此以外，按照与实施例1同样地进行培养，得到含有富马酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为8.0ppm。
比较例1
除了使流通的气体为空气(通气氧浓度21％)以外，按照与实施例1同样地进行培养，得到含有富马酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为5.4ppm。
实施例4
将液体培养基(组成：葡萄糖(和光纯药工业公司制)3质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％)500mL添加到灭过菌的1L容量的通气搅拌槽中，接着添加上述所制备的NBRC5441丝状菌颗粒的全部量(潮湿状态)。此后立即进行培养第0小时的取样，之后，边使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)流通氧浓度为100％的气体，并以温度35℃、搅拌转速500r/min、通气速度0.3vvm的条件，边进行经时取样，边进行2天搅拌培养。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为28ppm。另外，在培养期间，对于培养液的pH，通过适当添加7N氢氧化钠溶液，维持为pH(35℃)3.0。培养结束后，通过对培养液进行过滤以除去菌体，得到含有有机酸的培养液。
比较例2
除了使流通的气体为空气(通气氧浓度21％)以外，按照与实施例4同样地进行培养，得到含有有机酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为5.0ppm。
实施例5
将液体培养基(组成：葡萄糖(和光纯药工业公司制)3质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％)500mL添加到灭过菌的1L容量的通气搅拌槽中，接着添加上述所制备的NBRC5441丝状菌颗粒的全部量(潮湿状态)。此后立即进行培养第0小时的取样，之后，边使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)流通氧浓度为100％的气体，以温度35℃、搅拌转速500r/min、通气速度0.3vvm的条件，边进行经时取样，边进行2天搅拌培养。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为28ppm。另外，在培养期间，对于培养液的pH，通过适当添加7N氢氧化钠溶液，维持为pH(35℃)7.0。培养结束后，通过对培养液进行过滤以除去菌体，得到含有有机酸的培养液。
比较例3
将使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)生成的气体与空气混合，使通气氧浓度成为21％，除此以外，按照与实施例5同样地进行培养，得到含有有机酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为5.0ppm。
实施例6
将液体培养基(组成：混合糖(葡萄糖：果糖：蔗糖：木糖：乳糖：麦芽糖＝5：5：2：1：1：1混合比)5质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％)500mL添加到灭过菌的1L容量的通气搅拌槽中，接着添加上述所制备的JCM5557丝状菌颗粒的全部量(潮湿状态)。此后立即进行培养第0小时的取样，之后，边使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)流通氧浓度为100％的气体，并以温度35℃、搅拌转速500r/min、通气速度0.3vvm的条件，边进行经时取样，边进行2天搅拌培养。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为30ppm。另外，在培养期间，对于培养液的pH，通过适当添加7N氢氧化钠溶液，维持为pH(35℃)4.0。培养结束后，通过对培养液进行过滤以除去菌体，得到含有有机酸的培养液。
比较例4
将使用氧发生装置(AIR SEP公司，NEWLIFE J)生成的气体与空气混合，使通气氧浓度成为21％，除此以外，按照与实施例6同样地进行培养，得到含有有机酸的培养液。在培养期间，培养液中的溶存氧浓度为5.0ppm。
〔评价方法〕
根据培养液的分析值，以下述(1)～(6)的项目为评价轴。在表1和式(1)～(6)中表示各项目的计算式。
[表1]
Figure BDA0001701047950000151
(1)由糖向富马酸的转化率
P1[％]＝(F－F0)/(G0－G)×100 (1)
(2)由糖向乙醇的转化率
Q[％]＝(E－E0)/(G0－G)×100 (2)
(3)向上述乙醇的转化中产生的二氧化碳的转化率
R[％]＝Q×(CO2分子量/EtOH分子量)×100 (3)
(4)由糖向丙酮酸的转化率
S1[％]＝(Py－Py0)/(G0－G)×100 (4)
(5)由混合糖向富马酸的转化率
P2[％]＝(F－F0)/(M0－M)×100 (5)
(6)由混合糖向丙酮酸的转化率
S2[％]＝(Py－Py0)/(M0－M)×100 (6)
(式中，G0、M0、F0、E0和Py0表示培养0小时的葡萄糖浓度、混合糖浓度、富马酸浓度、乙醇浓度、丙酮酸浓度，G、M、F、E和Py表示培养后的葡萄糖浓度、混合糖浓度、富马酸浓度、乙醇浓度、丙酮酸浓度。)
在表2～表4中表示各实施例、比较例的条件和结果。
[表2]
实施例1 实施例2 实施例3 比较例1
溶存氧浓度 32ppm 9.5ppm 8.0ppm 5.4ppm
培养液的pH 4.0 4.0 4.0 4.0
富马酸转化率 65.7％ 50.7％ 42.4％ 36.9％
乙醇转化率 9.9％ 17.2％ 16.1％ 20.6％
CO<sub>2</sub>转化率 9.4％ 16.5％ 15.4％ 19.7％
[表3]
实施例4 比较例2 实施例5 比较例3
溶存氧浓度 28ppm 5.0ppm 30ppm 5.0ppm
培养液的pH 3.0 3.0 7.0 7.0
富马酸转化率 51.0％ 30.0％ 58.2％ 41.4％
丙酮酸转化率 42.5％ 9.5％ 4.1％ 0.1％
乙醇转化率 2.2％ 19.2％ 0.0％ 12.9％
CO<sub>2</sub>转化率 2.1％ 18.4％ 0.0％ 12.3％
[表4]
实施例6 比较例4
溶存氧浓度 30ppm 5.0ppm
培养液的pH 4.0 4.0
富马酸转化率 39.0％ 30.0％
丙酮酸转化率 21.2％ 4.5％
乙醇转化率 2.8％ 11.4％
CO<sub>2</sub>转化率 2.7％ 10.9％
如表2～表4所示，确认到：通过在丝状菌的培养工序中将培养液中的溶存氧浓度控制在本发明的范围内，由葡萄糖或混合糖向富马酸、丙酮酸的转化得到了促进，另一方面，降低了乙醇的副产，能够高收率得到有机酸。
在供给通常的空气的比较例1～4中，副产有大量的乙醇，有机酸的收率是低的。

Claims (21)

1.一种富马酸的制造方法，其特征在于：
其是使用丝状菌由培养基中的碳源制造有机酸的方法，其中，
在含有碳源且将溶存氧浓度控制为9ppm以上、35ppm以下的液体培养基中培养丝状菌，得到富马酸，
所述丝状菌为根霉属菌，所述碳源为糖类。
2.如权利要求1所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
丝状菌为德氏根霉或米根霉。
3.如权利要求1所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
丝状菌为丝状菌颗粒或固定化丝状菌的形态。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
所述液体培养基是将溶存氧浓度控制为12ppm以上、35ppm以下的液体培养基。
5.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
所述液体培养基是将溶存氧浓度控制为9ppm以上、34ppm以下的液体培养基。
6.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
所述液体培养基是将溶存氧浓度控制为9ppm以上、33ppm以下的液体培养基。
7.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
所述液体培养基是将溶存氧浓度控制为12ppm以上、33ppm以下的液体培养基。
8.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
向液体培养基通气氧浓度为21％以上、100％以下的气体。
9.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
向液体培养基通气氧浓度为35％以上、100％以下的气体。
10.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
向液体培养基通气氧浓度为40％以上、100％以下的气体。
11.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
通气量为0.1vvm以上、2vvm以下。
12.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
碳源为葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖。
13.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
碳源含有葡萄糖。
14.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
液体培养基中的碳源的浓度为1质量％以上、40质量％以下。
15.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
液体培养基中的碳源的浓度为2质量％以上、30质量％以下。
16.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
液体培养基中的碳源的浓度为3质量％以上、20质量％以下。
17.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
培养工序中的液体培养基在35℃的pH为2以上、7以下。
18.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
培养工序中的液体培养基在35℃的pH为3以上、6以下。
19.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
使用碱金属或碱土金属的氢氧化物、碱金属或碱土金属的碳酸盐调整培养工序中液体培养基的pH。
20.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
使用碱金属的氢氧化物或碱金属的碳酸盐调整培养工序中液体培养基的pH。
21.如权利要求1～3中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
使用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾调整培养工序中液体培养基的pH。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111876446B (zh) * 2020-08-11 2023-10-13 新拓洋生物工程有限公司 利用米曲霉发酵制备l-苹果酸的工艺

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06153970A (ja) * 1992-11-16 1994-06-03 Suntory Ltd 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
CN1254016A (zh) * 1998-07-24 2000-05-24 株式会社武藏野化学研究所 耐氨性的l(+)－产乳酸菌及生产l(+)－乳酸的方法
CN101255450A (zh) * 2008-01-31 2008-09-03 南京工业大学 利用米根霉发酵产l-苹果酸的工艺
CN102016002A (zh) * 2008-03-13 2011-04-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对能够发酵混合底物的生物的选择
CN102286387A (zh) * 2011-06-21 2011-12-21 江南大学 一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用
CN102286551A (zh) * 2011-07-01 2011-12-21 南京工业大学 一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法
CN105062981A (zh) * 2015-09-06 2015-11-18 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877731A (en) 1988-06-27 1989-10-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fermentation process for carboxylic acids

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06153970A (ja) * 1992-11-16 1994-06-03 Suntory Ltd 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
CN1254016A (zh) * 1998-07-24 2000-05-24 株式会社武藏野化学研究所 耐氨性的l(+)－产乳酸菌及生产l(+)－乳酸的方法
CN101255450A (zh) * 2008-01-31 2008-09-03 南京工业大学 利用米根霉发酵产l-苹果酸的工艺
CN102016002A (zh) * 2008-03-13 2011-04-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对能够发酵混合底物的生物的选择
CN102286387A (zh) * 2011-06-21 2011-12-21 江南大学 一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用
CN102286551A (zh) * 2011-07-01 2011-12-21 南京工业大学 一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法
CN105062981A (zh) * 2015-09-06 2015-11-18 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effect of aeration intensity on the production of organic acids and ethanol by Rhizopus javanicus;YONEYA,Takefumi等;《Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan》;19791231;第53卷(第11期);第363-367页 *
Enhancement of fumaric acid production by rhizopus oryzae using a two-stage dissolved oxygen control strategy;Yong-Qian Fu等;《Appl Biochem Biotechnol》;20101121;第162卷;摘要，第1032-1033页材料与方法部分，第1035页第1-2段，表1 *

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