CN110684809A - 一种发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及十二碳二元酸产品及其制备方法,特别涉及发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法。一种发酵法生产的十二碳二元酸产品,其中十碳二元酸杂质含量低于300ppm。该十二碳二元酸产品的发酵生产方法,包括发酵过程,所述发酵过程包括发酵转化期,其中,在所述发酵转化期加入葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖和蔗糖溶液中的一种或多种。所披露的十二碳二元酸产品通过微生物发酵法制得,通过披露的制备方法,可得到纯度更高、杂质含量尤其是十碳二元酸杂质含量更低的十二碳二元酸产品。高纯度、低十碳二元酸杂质含量的十二碳二元酸产品满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求,所得的聚合物产品性能更加优异。
Description
技术领域
本发明涉及十二碳二元酸产品及其制备方法,特别涉及发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法。
背景技术
长链二元酸有着非常广泛的用途,以长链二元酸为原料可以合成特种聚酰胺、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长,反应需要高温高压,对催化剂要求比较苛刻,因此在工业规模上的长链二元酸品种较少,只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃或脂肪酸为底物,通过微生物转化得到。
自70年代起有许多关于微生物代谢烷烃的报道,烷烃及其代谢产物的降解依次发生在微粒体、过氧化物酶体和线粒体。首先,细胞摄取的烷烃进入微粒体,在细胞色素P450和
NADH-细胞色素P450还原酶CPR催化作用下生成脂肪醇,然后由长链脂肪醇脱氢酶和醛脱氢酶催化依次生成脂肪醛和脂肪酸,或通过ω-氧化最终生成二元酸。其次,微粒体内的一部分脂肪醇、脂肪酸和二元酸进入过氧化物酶体,经β-氧化酶系催化,最终降解为乙酰CoA或炳酰CoA,产生细胞生命活动所需能量。
β-氧化酶系包括4种酶:酯酰CoA氧化酶、烯酯酰CoA水合酶、3-羟基酯酰CoA脱氢酶和3-酮酯酰CoA硫解酶。其中3-酮酯酰CoA硫解酶是β-氧化最后一步的酶,其作用是将3-酮酯酰CoA裂解生成1个乙酰CoA和1个碳链较原来少2个碳原子的酯酰CoA,进而再进一步催化生成少2个碳原子的二元酸。如微生物发酵生产十二碳二元酸时,由于β-氧化会生成十碳二元酸。过量十碳二元酸会影响十二碳二元酸的产品纯度和质量,进而影响其下游聚合等的应用。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种发酵法生产的十二碳二元酸产品,该发酵法生产的十二碳二元酸产品中十碳二元酸杂质含量非常低,以解决目前发酵法生产的十二碳二元酸产品中十碳二元酸杂质含量高,影响后续应用的技术问题。
一种发酵法生产的十二碳二元酸产品,十碳二元酸杂质含量低于300ppm;优选地,低于250ppm;更优选地,低于200ppm,所述十碳二元酸杂质含量是十碳二元酸占发酵法生产的十二碳二元酸产品的质量比。
本发明的第二方面目的在于提供上述十二碳二元酸产品的发酵生产方法,该发酵生产方法的发酵过程能抑制十碳二元酸的生成,经分离纯化后能得到十碳二元酸杂质含量非常低的十二碳二元酸产品。
一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,包括发酵过程,所述发酵过程包括发酵转化期,其中,在所述发酵转化期加入含糖物质;所述含糖物质是葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖和蔗糖溶液中的一种或多种;
优选地,在所述发酵转化期加入含糖物质,所述含糖物质中糖的总量相对初始发酵体积为1%~10%(质量体积比)。
在前述技术方案基础上进一步,所述发酵转化期是发酵接种后10~20h起至发酵结束,或者是发酵接种后菌体培养至稀释30倍后OD620为0.5~1.0起至发酵结束。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述加入葡萄糖的方式是一次性添加或分批添加;或者所述加入葡萄糖溶液的方式是一次性添加、分批添加、恒速流加或变速流加;
优选地,所述所述葡萄糖溶液浓度为20%~70%(质量体积比)。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述发酵的温度为28~32℃;所述发酵的通风比为
0.3~0.7vvm;所述发酵的罐压为0.05~0.14MPa,所述罐压为表压;菌体生长期控制pH为3.5~6.5,所述发酵转化期控制pH为5.0~8.0;所述发酵的溶氧为10%以上,优选10%~
70%,更优选40%~70%;所述发酵的周期为120~180h。
在前述任一技术方案基础上进一步,底物包括或者是C12的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;
优选地,在接种前、接种后0h或所述发酵转化期开始时第一次批加所述底物,之后当发酵液中所述底物含量低于5%~8%(v/v)时再批加所述底物。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述发酵的培养基的组分包括:
优选地,所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种;
优选地,所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种;
优选地,所述无机盐包括或者是硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种;更优选地,包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种;
优选地,所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种;更优选地,所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种;
优选地,所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种;更优选地,所述生长因子包括或者是维生素B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述发酵培养基为水溶液培养基;
优选地,所述发酵培养基包含如下成分:葡萄糖20~50g/L、硝酸钾1~6g/L、磷酸二氢钾1~6g/L、硫酸铵1~3g/L以及硫酸镁1~3g/L。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述发酵的菌种是热带假丝酵母(Candidatropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。
在前述任一技术方案基础上进一步,所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,还包括分离纯化的过程,所述分离纯化的过程包括以下步骤:
将十二碳二元酸发酵液酸化,得固形物和发酵处理液,分离得所述固形物,再将所述固形物溶解在有机溶剂中,分离得清液,将所述清液结晶,得十二碳二元酸产品。
在上述技术方案基础上进一步,所述酸化的pH值为2.5~5,优选为3~4;
和/或,所述固形物包括长链二元酸颗粒;或者,所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体;
和/或,所述分离的方法为离心或过滤;
和/或,所述有机溶剂包括或者是醇、酸、酮和酯中的一种多种;其中,所述醇包括或者是甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种;所述酸包括或者是乙酸;所述酮包括或者是丙酮;所述酯包括或者是乙酸乙酯和/或乙酸丁酯;
和/或,所述固形物溶解在有机溶剂后,脱色,再分离得清液,所述脱色的方法优选活性炭脱色;所述活性炭的添加量为不超过溶液体积的5%;所述脱色的温度为85~100℃;所述脱色的时间为15~165min;
和/或,所述结晶为降温结晶;所述降温结晶包括以下步骤:降温至65~80℃,保温1~2小时后,再降温至25~35℃,结晶;
和/或,所述结晶后,分离出晶体,由此得到长链二元酸;所述分离的方法为离心分离。
本发明的第三方面提出了葡萄糖作为二元酸发酵生产中过氧化物酶体抑制剂或β氧化抑制剂的用途,优选地,作为十二碳二元酸发酵生产中过氧化物酶体抑制剂或β氧化抑制剂的用途。
本发明的第四方面提出了葡萄糖作为二元酸发酵生产中杂质二元酸抑制剂的用途,优选地,作为十二碳二元酸发酵生产中十碳二元酸杂质抑制剂的用途。
本发明的第五方面提出了一种十二碳二元酸发酵液,所述十二碳二元酸发酵液中十碳二元酸与十二碳二元酸的质量比低于0.3%;优选地,低于0.25%,更优选地,低于0.2%。因为十二碳二元酸发酵液中十碳二元酸含量低,分离纯化得到十二碳二元酸产品后,从母液中继续回收残余的十二碳二元酸,纯度会更高。
本发明的第六方面提出了将包含上文所述的发酵法生产的十二碳二元酸产品作为聚合单体的聚合物,优选为聚酰胺或聚酯。
进一步,所述聚合物为由所述发酵法生产的十二碳二元酸产品与C5~C12脂肪胺聚合所得的聚酰胺;所述脂肪胺优选为戊二胺、己二胺或癸二胺。
所披露的十二碳二元酸产品通过微生物发酵法制得,通过披露的制备方法,可得到纯度更高、杂质含量尤其是十碳二元酸杂质含量更低的十二碳二元酸产品。高纯度、低十碳二元酸杂质含量的十二碳二元酸产品满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求,所得的聚合物产品性能更加优异。而且,本发明提供的十二碳二元酸产品制备方法条件温和、环境友好、产品转化率高且品质好,可以替代化学法用于十碳二元酸的工业化规模生产。
具体实施方式
下面阐述本案的具体实施方式。
本案发明人发现,在十二碳二元酸发酵生产的发酵转化期加入葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖、蔗糖溶液中的一种或多种,能有效降低发酵液中十碳二元酸和十二碳二元酸的比例,进而有效降低十二碳二元酸产品中十碳二元酸杂质的含量,将成品十二碳二元酸产品中的十碳二元酸杂质含量控制在现有技术达不到的范围内。本案发明人推测,可能因为加入葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖、蔗糖溶液中的一种或多种后,会减少过氧化物酶体形成,故而形成的十碳二元酸减少。此外,发明人还发现,在所述发酵转化期加入葡萄糖,发酵周期也相应地缩短了。发明人推测,葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖、蔗糖溶液中的一种或多种的加入有利于转化期的菌体繁殖,如此有更多的菌体参与转化,发酵周期也就缩短了。
因此,本具体实施方式得到了一种发酵法生产的十二碳二元酸产品,十碳二元酸杂质含量低于300ppm;优选地,低于250ppm;更优选地,低于200ppm,所述十碳二元酸杂质含量是十碳二元酸占发酵法生产的十二碳二元酸产品的质量比。。
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵的菌种是热带假丝酵母(Candidatropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。本具体实施方式采用的热带假丝酵母和清酒假丝酵母均保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),并且在本申请前已在专利公报中公布,具体情况如下:
在一个优选的具体实施方式中,所述十二碳二元酸产品的发酵生产方法包括以下过程:
1、获得活化菌种:
在一个优选的具体实施方式中,获得活化菌种的过程包括取假丝酵母(热带假丝酵母CAT N145,下同)的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中,pH自然,28~32℃下,200~250rpm、振幅26~50mm摇床培养1~2天;
YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨。pH7.0
2、获得种子液:
在一个优选的具体实施方式中,获得种子液的过程包括取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0~6.8,28~32℃下,通风比0.3~0.7vvm,罐压0.05~0.14MPa,保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,优选10%~70%,更优选40%~70%,培养15~30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.5~1.0。
在一个优选的具体实施方式中,种子培养基包括:10-30g/L蔗糖,1.5-10g/L玉米浆液,1-10g/L酵母提取液,4-12g/L KH2PO4,0.5-5g/L脲,0-30mL/L底物。所述培养基用水制备,并在121℃下灭菌20min。脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合,作为种子培养基使用。
3、发酵:
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵过程包括将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,所述发酵过程控制温度28~32℃,通风比为0.3~0.7vvm,罐压为0.05~0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,优选为10%~70%,更优选为40%~70%,菌体生长期控制pH为3.5~6.5,所述发酵转化期控制pH为5.0~8.0;在接种前、接种后0h或所述发酵转化期开始时第一次批加底物,之后当发酵液中底物含量低于5~8%(v/v)时再批加底物,发酵转化期加入葡萄糖和/或葡萄糖溶液。总发酵周期120-180h。
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵转化期所加入的葡萄糖的总量或加入的葡萄糖溶液中葡萄糖的总量相对初始发酵体积为1%~10%(质量体积比)。
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵转化期是发酵接种后10~20h起至发酵结束,或者是发酵接种后菌体培养至OD620(稀释30倍后)为0.5~1.0起至发酵结束。
在一个优选的具体实施方式中,所述加入葡萄糖的方式是一次性添加或分批添加;或者所述加入葡萄糖溶液的方式是一次性添加、分批添加、恒速流加或变速流加;
优选地,所述葡萄糖溶液浓度为20%~70%(质量体积比)。
在一个优选的具体实施方式中,底物包括或者是C12的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵培养基包括:碳源,10~50g/L;氮源,每种氮源的浓度为1~10g/L;无机盐,每种无机盐的浓度为1~10g/L;微量金属元素源,每种所述微量元素源的浓度为0~50ppm;生长因子,每种所述生长因子的浓度均为0~1ppm。
在一个优选的具体实施方式中,所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述无机盐包括或者是硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种;优选包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种;优选地,所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种;优选地,所述生长因子包括或者是维生素B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中,所述发酵培养基为水溶液培养基;优选地,所述发酵培养基包含如下成分:葡萄糖20~50g/L、硝酸钾1~6g/L、磷酸二氢钾1~6g/L、硫酸铵1~3g/L以及硫酸镁1~3g/L。
4、分离纯化:
所述分离纯化的过程包括以下步骤:
将十二碳二元酸发酵液酸化,得固形物和发酵处理液,分离得所述固形物,再将固形物溶解在有机溶剂中,分离得清液,将所述清液结晶,得十二碳二元酸产品;
优选地,所述酸化的pH值为2.5~5,优选为3~4;
和/或,所述固形物包括长链二元酸颗粒;或者,所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体;
和/或,所述分离的方法为离心或过滤;
和/或,所述有机溶剂包括或者是醇、酸、酮和酯中的一种多种;其中,所述醇包括或者是甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种;所述酸包括或者是乙酸;所述酮包括或者是丙酮;所述酯包括或者是乙酸乙酯和/或乙酸丁酯;
和/或,所述固形物溶解在有机溶剂后,脱色,再分离得清液,所述脱色的方法优选活性炭脱色;所述活性炭的添加量为不超过溶液体积的5%;所述脱色的温度为85~100℃;所述脱色的时间为15~165min;
和/或,所述结晶为降温结晶;所述降温结晶包括以下步骤:降温至65~80℃,保温1~2小时后,再降温至25~35℃,结晶;
和/或,所述结晶后,分离出晶体,由此得到长链二元酸;所述分离的方法为离心分离。
下面通过实施例对本发明进行详细说明,以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出,实施例用于理解本发明的构思,本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
如没有特别说明,本发明所述的浓度均为质量百分比浓度。
本发明中测定发酵液中的二元酸浓度,可以采用本领域技术人员熟知的技术,例如气相色谱检测法,分别检测十二碳二元酸和十碳二元酸,详情如下:
发酵液经常规前处理方法处理后,气相色谱检测(内标法),色谱条件:色谱柱:Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。气相色谱仪(Shimadzu,GC-2014)。
方法:初温100℃,15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气,进样口温度280℃,FID温度280℃,进样量4μL。
根据产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行产物浓度计算,根据产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。
最终获得的十二碳二元酸产品中十二碳二元酸和十碳二元酸的含量的测定,也可以采用本领域技术人员熟知的技术,例如气相色谱检测法,具体步骤如下:
样品经常规前处理方法处理后,气相色谱检测(归一法),色谱条件:色谱柱:Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。气相色谱仪(Shimadzu,GC-2014)。
方法:初温100℃,15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气,进样口温度280℃,FID温度280℃,进样量4μL。根据产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。
实施例1
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,29℃下,220rpm、振幅26mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.5;种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液,8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合。
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾10g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸铵1g/L,硫酸镁1g/L;发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,随着菌体生长pH降低至4.5,然后控制pH为4.5直至发酵12h,发酵12h直至发酵结束控制pH为8.0;发酵12h时第一次批加底物正十二烷烃(本实施例使用的底物正十二烷烃,正十二烷烃含量在99%以上,且无法检出正十碳烷烃,以下实施例同),之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,发酵12h一次性加入相对发酵起始体积2.5%的葡萄糖;总发酵周期180h,发酵液中十二碳二元酸浓度为150g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸的质量比例为0.15%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3,进行酸化,得固形物和发酵处理液,离心分离得固形物,其中,固形物中绝大多数为长链二元酸颗粒;再将固形物溶解在醋酸中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在90℃条件下脱色60min,过滤分离得清液,将清液降温至80℃保温1.5h,再降温至30℃,结晶;离心分离得长链二元酸产品,经检测其中十碳二元酸含量为100ppm。
实施例2
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,28℃下,200rpm、振幅50mm摇床培养2天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.8,28℃下,通风比0.7vvm,罐压0.14MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养15h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为1.0;种子培养基包括:30g/L蔗糖,10g/L玉米浆液,10g/L酵母提取液,12g/L KH2PO4,0.5g/L脲,0mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合。
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖50g/L、硝酸钾6g/L、磷酸二氢钾10g/L、硫酸铵2g/L,硫酸镁10.0g/L;发酵过程控制温度28℃,通风比为0.7vvm,罐压为0.05MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.5,随着菌体生长pH降低至5.0,,控制pH为5.0直至发酵20h,发酵20h直至发酵结束控制pH为5.0;发酵20时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于8%时再批加底物,分别在发酵18h、36h、60h时加入相对发酵起始体积1%的葡萄糖;总发酵周期140h,发酵液中十二碳二元酸浓度为162g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸的质量比例为0.2%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3.5,进行酸化,得固形物和发酵处理液,离心分离得固形物,其中,固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体;再将固形物溶解在乙醇中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在95℃条件下脱色75min,过滤分离得清液,将清液降温至80℃保温1h,再降温至35℃,结晶;离心分离得十二碳二元酸产品经检测其中十碳二元酸含量为150ppm。
实施例3
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,32℃下,250rpm、振幅50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.2,32℃下,通风比0.3vvm,罐压0.05MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.8;种子培养基包括:10g/L蔗糖,1.5g/L玉米浆液,1.0g/L酵母提取液,4g/L KH2PO4,5g/L脲,30mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖20g/L、硝酸钾1g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸铵10g/L,硫酸镁3g/L;发酵过程控制温度32℃,通风比为0.3vvm,罐压为0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为5.5,随着菌体生长,pH下降至3.5,控制pH为3.5直至发酵10,发酵10h直至发酵结束控制pH为7.5;发酵10h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,在发酵10h时开始至发酵80h流加70%的葡萄糖溶液,流加总量为相对发酵起始体积5%的葡萄糖;总发酵周期150h,发酵液中十二碳二元酸浓度为176g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸的质量比例为0.12%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3.2,进行酸化,得固形物和发酵处理液,过滤得固形物,其中,固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体;再将固形物溶解在醋酸中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在85℃条件下脱色70min,过滤分离得清液,将清液降温至65℃保温1h,再降温至35℃,结晶;离心分离得十二碳二元酸产品,经检测其中十碳二元酸含量为90ppm。
实施例4
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,32℃下,250rpm、振幅50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.2,32℃下,通风比0.3vvm,罐压0.05MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.6;种子培养基包括:10g/L蔗糖,1.5g/L玉米浆液,1.0g/L酵母提取液,4g/L KH2PO4,5g/L脲,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾4g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L,硫酸镁3g/L;发酵过程控制温度32℃,通风比为0.3vvm,罐压为0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为5.5,随着菌体生长,pH下降至3.5,控制pH为3.5直至菌体培养至稀释30倍后OD620为0.5以上,调pH至6直至发酵结束;发酵0h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,在转化期开始时至发酵100h流加20%的葡萄糖溶液,流加总量为相对发酵起始体积10%的葡萄糖;总发酵周期120h,发酵液中十二碳二元酸浓度为180g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸的质量比例为0.15%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3.2,进行酸化,得固形物和发酵处理液,过滤得固形物,其中,固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体;再将固形物溶解在醋酸中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在85℃条件下脱色70min,过滤分离得清液,将清液降温至65℃保温1h,再降温至35℃,结晶;离心分离得十二碳二元酸产品,经检测其中十碳二元酸含量为110ppm。
实施例5
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,32℃下,250rpm、振幅50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.2,32℃下,通风比0.3vvm,罐压0.05MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.5;种子培养基包括:10g/L蔗糖,1.5g/L玉米浆液,1.0g/L酵母提取液,4g/L KH2PO4,5g/L脲,30mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸铵2g/L,硫酸镁2g/L;发酵过程控制温度32℃,通风比为0.3vvm,罐压为0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为5.5,随着菌体生长,pH下降至3.5,控制pH为3.5直至菌体培养至稀释30倍后OD620为1.0,调pH至6.4直至发酵结束;发酵接种前第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,在转化期开始时至发酵100h流加20%的葡萄糖溶液,流加总量为相对发酵起始体积3%的葡萄糖;总发酵周期133h,发酵液中十二碳二元酸浓度为164g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸的质量比例为0.18%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3.2,进行酸化,得固形物和发酵处理液,过滤得固形物,其中,固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体;再将固形物溶解在醋酸中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在85℃条件下脱色70min,过滤分离得清液,将清液降温至65℃保温1h,再降温至35℃,结晶;离心分离得十二碳二元酸产品,经检测其中十碳二元酸含量为150ppm。
对比例1
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH自然,32℃下,250rpm、振幅50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.2,32℃下,通风比0.3vvm,罐压0.05MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.8;种子培养基包括:10g/L蔗糖,1.5g/L玉米浆液,1.0g/L酵母提取液,4g/L KH2PO4,5g/L脲,30mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合。
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖40g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾02g/L、硫酸铵3g/L,硫酸镁3g/L;发酵过程控制温度32℃,通风比为0.3vvm,罐压为0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为5.5,随着菌体的生长pH降至3.5,控制pH为3.5直至发酵16h,发酵16h直至发酵结束控制pH为7.5;发酵16h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物。总发酵周期152h,发酵液中十二碳二元酸浓度为132g/L,十碳二元酸占十二碳二元酸质量比例为0.45%。
4、分离纯化:
将十二碳二元酸发酵液用硫酸调节pH至pH3.2,进行酸化,得固形物和发酵处理液,过滤得固形物,其中,固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体;再将固形物溶解在醋酸中,加入不超过清液体积5%的活性炭,在85℃条件下脱色70min,过滤分离得清液,将清液降温至65℃保温1h,再降温至35℃,结晶;离心分离得十二碳二元酸产品,经检测其中十碳二元酸含量为400ppm。
Claims (16)
1.一种发酵法生产的十二碳二元酸产品,其特征在于,十碳二元酸杂质含量低于300ppm;优选地,低于250ppm;更优选地,低于200ppm,所述十碳二元酸杂质含量是十碳二元酸占发酵法生产的十二碳二元酸产品的质量比。
2.一种如权利要求1所述的十二碳二元酸产品的发酵生产方法,包括发酵过程,所述发酵过程包括发酵转化期,其特征在于,在所述发酵转化期加入含糖物质;所述含糖物质是葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖和蔗糖溶液中的一种或多种;
优选地,在所述发酵转化期加入含糖物质,所述含糖物质中糖的总量相对初始发酵体积为1%~10%(质量体积比)。
3.如权利要求2所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述发酵转化期是发酵接种后10~20h起至发酵结束,或者是发酵接种后菌体培养至稀释30倍后OD620为0.5~1.0起至发酵结束。
4.如权利要求2或3所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述加入葡萄糖的方式是一次性添加或分批添加;或者
所述加入葡萄糖溶液的方式是一次性添加、分批添加、恒速流加或变速流加;
优选地,所述葡萄糖溶液浓度为20%~70%(质量体积比)。
5.如权利要求2-4任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述发酵的温度为28~32℃;所述发酵的通风比为0.3~0.7vvm;所述发酵的罐压为0.05~0.14MPa,所述罐压为表压;菌体生长期控制pH为3.5~6.5,所述发酵转化期控制pH为5.0~8.0;所述发酵的溶氧为10%以上,优选10%~70%,更优选40%~70%;所述发酵的周期为120~180h。
6.如权利要求2-5任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,底物包括或者是C12的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;
优选地,在接种前、接种后0h至所述发酵转化期开始时第一次批加所述底物,之后当发酵液中所述底物含量低于5%~8%(v/v)时再批加所述底物。
7.如权利要求2-6任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述发酵的培养基的组分包括:
优选地,所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种;
优选地,所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种;
优选地,所述无机盐包括或者是硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种;更优选地,包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种;
优选地,所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种;更优选地,所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种;
优选地,所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种;更优选地,所述生长因子包括或者是维生素B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。
8.如权利要求2-6任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述发酵培养基为水溶液培养基;
优选地,所述发酵培养基包含如下成分:葡萄糖20~50g/L、硝酸钾1~6g/L、磷酸二氢钾1~6g/L、硫酸铵1~3g/L以及硫酸镁1~3g/L。
9.如权利要求2-8任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,所述发酵的菌种是热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。
10.如权利要求2-9任一项所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其中,还包括分离纯化的过程,所述分离纯化的过程包括以下步骤:
将十二碳二元酸发酵液酸化,得固形物和发酵处理液,分离得所述固形物,再将所述固形物溶解在有机溶剂中,分离得清液,将所述清液结晶,得十二碳二元酸产品。
11.根据权利要求10所述的十二碳二元酸产品的发酵生产方法,其特征在于,所述酸化的pH值为2.5~5,优选为3~4;
和/或,所述固形物包括长链二元酸颗粒;或者,所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体;
和/或,所述分离的方法为离心或过滤;
和/或,所述有机溶剂包括或者是醇、酸、酮和酯中的一种多种;其中,所述醇包括或者是甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种;所述酸包括或者是乙酸;所述酮包括或者是丙酮;所述酯包括或者是乙酸乙酯和/或乙酸丁酯;
和/或,所述固形物溶解在有机溶剂后,脱色,再分离得清液,所述脱色的方法优选活性炭脱色;所述活性炭的添加量为不超过溶液体积的5%;所述脱色的温度为85~100℃;所述脱色的时间为15~165min;
和/或,所述结晶为降温结晶;所述降温结晶包括以下步骤:降温至65~80℃,保温1~2小时后,再降温至25~35℃,结晶;
和/或,所述结晶后,分离出晶体,由此得到长链二元酸;所述分离的方法为离心分离。
12.葡萄糖作为二元酸发酵生产中过氧化物酶体抑制剂或β氧化抑制剂的用途,优选地,作为十二碳二元酸发酵生产中过氧化物酶体抑制剂或β氧化抑制剂的用途。
13.葡萄糖作为二元酸发酵生产中杂质二元酸抑制剂的用途,优选地,作为十二碳二元酸发酵生产中十碳二元酸杂质抑制剂的用途。
14.一种十二碳二元酸发酵液,其特征在于,所述十二碳二元酸发酵液中十碳二元酸与十二碳二元酸的质量比低于0.3%;优选地,低于0.25%,更优选地,低于0.2%。
15.一种包含权利要求1所述的发酵法生产的十二碳二元酸产品作为聚合单体的聚合物,优选为聚酰胺或聚酯。
16.根据权利要求15所述的聚合物,其特征在于,所述聚合物为由所述发酵法生产的十二碳二元酸产品与C5~C12脂肪胺聚合所得的聚酰胺;所述脂肪胺优选为戊二胺、己二胺或癸二胺。
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