CN114369628A - 一种生物发酵生产长链二元酸的方法 - Google Patents

一种生物发酵生产长链二元酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种生物发酵生产长链二元酸的方法，其采用热带假丝酵母或维斯假丝酵母作为发酵微生物，包括下述步骤：1)采用两级种子罐对微生物进行培养，其中一级种子罐培养后菌体生长密度(OD620)大于0.5；2)二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵，发酵期间pH控制在6.8‑7.1范围内。本发明的新方法发酵周期短，烷烃添加量大，产酸高，转化率高，符合节能减排、降低成本的生产要求。

Description

一种生物发酵生产长链二元酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生物发酵生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸(Long chain dicarboxy acids)是指碳链中含有9个及以上碳原子的脂肪族二元酸(简称DCn)，包括饱和以及不饱和二元酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能工程塑料、高温电介质、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料等的重要原料。
一般而言，长链二元酸可以用化学合成法或生物发酵法生产得到。化学合成方法合成路线长，反应条件严格，需要在高温高压条件下进行，并且对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上，以化学法合成的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。生物发酵法以长链烷烃为底物，通过微生物发酵转化得到长链二元酸；其生产过程在常温、常压条件下进行，并且可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。因此，长链二元酸的生物发酵法生产相较于化学合成法而言，其优势是不言而喻的。
目前，针对生物发酵法生产长链二元酸已经有一定的研究基础。但现有的生产工艺中微生物接种培养过程产生的菌体密度较低，无法向发酵过程提供充足的活性菌体，并且在发酵过程中需要根据情况不断地调节pH，pH经历酸性-中性-碱性的变化。
对于行业上现有的生产工艺普遍存在发酵周期长(一般在180-190小时)，产酸率低，转化率较低等问题。
发明内容
为了解决现有技术中生物法生产长链二元酸的工艺生产发酵时间长，效率不够高且产酸率较低的问题，本发明提供一种生物发酵生产长链二元酸的新方法。本发明的新方法发酵周期短，烷烃添加量大，产酸高，转化率高，符合节能减排、降低成本的生产要求。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，其采用热带假丝酵母或维斯假丝酵母作为发酵微生物，包括下述步骤：
1)采用两级种子罐对微生物进行培养，其中一级种子罐培养后菌体生长密度(OD620)大于0.5；
2)二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵，发酵期间pH控制在6.0-8.8范围，优选6.8-7.1范围内。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选所述一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内；温度118-130℃，优选121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选一级培养工序如下控制：(1)前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；(2)当菌体生长密度(OD620)大于0.5，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选所述二级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内；温度118-130℃，温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选二级培养工序如下控制：(1)前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；(2)菌液溶氧、PH反弹，二级培养结束。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选底料水和碳源连消，氮源实消，消后压入发酵罐。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选发酵过程中采用流加方式补加二次碳源，补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.9，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选所述二次碳源为葡萄糖或蔗糖。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选发酵后期根据菌体活力考虑烷烃添加量，发酵结束时控制pH降至5.5-7.5，优选6.5。
本发明从微生物培养和发酵工艺层面进行技术革新，本发明采用特殊的微生物培养工艺，增大菌体量，增强菌体活力，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5，发酵过程pH控制在中性环境(pH6.8-7.1)，获得了非常显著的优异效果：将发酵周期由原180-190小时缩短至150-160小时，烷烃添加量由28t提升至36-37t，产酸率与转化率均大幅提高。
具体实施方式
本发明旨在提供一种发酵周期短，烷烃添加量大，产酸高，转化率高的生物发酵生产长链二元酸的方法。
为了高产率的获得长链二元酸，微生物培养工艺中得到大的菌体量、强的菌体活力非常重要，本发明通过采用两级种子罐对微生物进行培养，并且控制一级种子罐培养后菌体生长密度(OD620)大于0.5，相对于现有技术，在菌体量和菌体活力方面取得了明显的改善。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。
在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)大于0.5，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。
二级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。
在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、pH反弹，二级培养结束。
二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵。发酵过程中菌液的pH是菌体在一定环境条件下代谢活动的综合指标，对菌体生长和产品积累有很大的影响。现有发酵工艺中，在发酵过程中需要根据情况不断地调节pH，pH经历酸性-中性-碱性的变化，本发明人经过大量试验发现，为达到高生长速率和最佳产物形成，使pH在很窄的范围内保持恒定更有利于获得高产率的长链二元酸。本发明控制发酵期间pH恒定在6.8-7.1范围内，优选pH为6.9。
本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，在发酵过程中可以采用流加方式补加葡萄糖或蔗糖等二次碳源，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.8-7.1，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。
本发明提供一种生物发酵生产长链二元酸(优选C9到C18的长链二元酸)的新方法，通过对发酵工艺的改进，烷烃添加量可以由目前的28t左右提升至36-37t，产酸率与转化率也均大幅提高。
为了更好地说明本发明，下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：
(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：将玉米浆干粉(5kg)、酵母膏(11.5kg)、石蜡油(45kg)、尿素(6.5kg)、磷酸二氢钾(15.5kg)、消泡剂(1kg)、白砂糖(40kg)等成分组成的培养基打入一级罐，消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时采用热带假丝酵母接种、培养。
在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)为0.540，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。
(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：将葡萄糖(500kg)、玉米浆干粉(50kg)、酵母膏(140kg)、尿素(75kg)、磷酸二氢钾(286kg)、白砂糖(15kg)、消泡剂(7kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。
在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、pH反弹，二级培养结束。
(3)发酵罐发酵：将玉米浆(700kg)、玉米浆干粉(60kg)、酵母膏(420kg)、尿素(250kg)、磷酸二氢钾(700kg)、精制盐(140kg)、氮钾复合肥(750kg)、消泡剂(50kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，底料水和碳源葡萄糖连消，消后50±5t，氮源(氮源可以为尿素、玉米浆、酵母膏、酵母浸粉、酵素等)实消，消后压入发酵罐。
补料控制参数：需要添加二次碳源，二次碳源采用流加方式，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料(C12直链烷烃)前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至7.1，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。
发酵周期158小时，产C12二元酸20.8％，C12烷烃添加量36.1t，C12烷烃对C12二元酸的重量转化率81.18％。
实施例2
本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：
(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：将玉米浆干粉(5kg)、酵母膏(11.5kg)、石蜡油(45kg)、尿素(6.5kg)、磷酸二氢钾(15.5kg)、消泡剂(1kg)、白砂糖(40kg)等成分组成的培养基打入一级罐，消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时采用维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1101)接种、培养。
在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)为0.817，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。
(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：将葡萄糖(500kg)、玉米浆干粉(50kg)、酵母膏(140kg)、尿素(75kg)、磷酸二氢钾(286kg)、白砂糖(15kg)、消泡剂(7kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。
在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、pH反弹，二级培养结束。
(3)发酵罐发酵：将玉米浆(700kg)、玉米浆干粉(60kg)、酵母膏(420kg)、尿素(250kg)、磷酸二氢钾(700kg)、精制盐(140kg)、氮钾复合肥(750kg)、消泡剂(50kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，底料水和碳源葡萄糖连消，消后50±5t，氮源(可以为尿素、玉米浆、酵母膏、酵母浸粉、酵素等)实消，消后压入发酵罐。
补料控制参数：需要添加二次碳源，二次碳源采用流加方式，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料(C11烷烃)前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.9，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。
发酵周期156小时，产C11二元酸24.2％，C11烷烃添加量36.6t，C11烷烃对C11二元酸的重量转化率91.96％。
对比例1
对比例1的生物发酵生产长链二元酸的方法中，仅采用一级种子罐对热带假丝酵母接种、培养，当菌体生长密度(OD620)为0.498，菌液溶氧、pH反弹，培养结束，进行发酵罐发酵；除此以外，与实施例1同样地制备C12长链二元酸。
发酵周期192小时，产C12二元酸17.2％，C12烷烃添加量27.2t，C12烷烃对C12二元酸的重量转化率68.39％。
对比例2
对比例2的生物发酵生产长链二元酸的方法中，发酵过程中，补加二次碳源结束后，调节pH至7.5；除此以外，与实施例2同样地制备C12长链二元酸。
发酵周期185小时，产C12二元酸18.5％，C12烷烃添加量27.6t，C12烷烃对C12二元酸的重量转化率73.64％。
下表示出实施例和对比例的各参数：
发酵周期(hr) 产酸率(％) 烷烃添加量(t) 烷烃转化率(％)
实施例1 158 20.8％ 36.1 81.18％
实施例2 156 24.2％ 36.6 91.96％
对比例1 192 17.2％ 27.2 68.39％
对比例2 185 18.5％ 27.6 73.64％
通过前述实施例1和2的二元酸制备方法，可以将发酵周期由现有的180-190小时缩短至150-160小时，极大地减少能耗，降低生产成本；产酸率由现有的10％左右提高到20％以上，烷烃对二元酸的重量转化率由现有的60-70％提高到80％以上，特别是实施例2的制备方法转化率高达91％，极大地增加了经济效益。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种生物发酵生产长链二元酸的方法，其采用热带假丝酵母或维斯假丝酵母作为发酵微生物，包括下述步骤：
1)采用两级种子罐对微生物进行培养，其中一级种子罐培养后菌体生长密度(OD620)大于0.5；
2)二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵，发酵期间pH控制在6.8-7.1范围内。
2.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中所述一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内；温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。
3.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中一级培养工序如下控制：(1)前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；(2)当菌体生长密度(OD620)大于0.5，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。
4.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中所述二级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内，温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养；其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。
5.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中二级培养工序如下控制：(1)前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；(2)菌液溶氧、pH反弹，二级培养结束。
6.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中底料水和碳源连消，氮源实消，消后压入发酵罐。
7.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中发酵过程中采用流加方式补加二次碳源，补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.9，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。
8.根据权利要求7所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中所述二次碳源为葡萄糖或蔗糖。
9.根据权利要求1所述的生物发酵生产长链二元酸的方法，其中发酵后期根据菌体活力考虑烷烃添加量，发酵结束时控制pH降至6.5。
10.由前述权利要求1-9任意一项所述的方法生产的长链二元酸。
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