CN110616158A - 一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本产品涉及一种利用维斯假丝酵母生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：种子培养阶段、发酵培养阶段与十二碳二元酸分离回收阶段，所述维斯假丝酵母的保藏号CCTCC No.2019076。其中，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。本发明方法生产的正十二碳二元酸具有令人满意的结晶形态，更容易满足欧洲、美国、日本无尘化、低粉尘产品出口要求；而且特别适合作为高级润滑油、高级尼龙树脂的原料加工利用。

Description

一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法及产品与菌种。
背景技术
长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。十二碳二元酸(DC12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。
DC12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。
国内外生产菌株的α、ω-氧化能力强较强，产酸可达200g/L，如中国专利CN1233658A、CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分别公开了通过硝基胍、亚硝酸和紫外线多次反复诱变，选育ω-氧化能力更强的热带假丝酵母突变株并以烷烃作为生长碳源公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法，该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化能力强的热带假丝酵母突变菌株，其部分解决长链二元酸发酵生产效率的低的问题：如专利CN1928100A中DC12生产率为1.3g/L·h，专利CN10225411A中混合二元酸的生产率仅为0.92g/L·h。中国专利CN104862348A、CN105755062A公开了使用维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法，通过分离耦合装置或氧化还原电位控制发酵过程部分提高了生产效率至1.78～2.0g/L·h，但上述方法操作步骤较为复杂，且并没有缩短整个发酵周期，占用生产设备时间较长，不能解决二元酸工业化难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法及产品与菌种，该方法是基于以下发现：通过在含烷烃(生产使用废弃石蜡油)废渣中以基因高通量筛选结合特定化学诱变方法，筛选出一株维斯假丝酵母(Candida viswanathiiws-1201，保藏号CCTCC No.2019076，保藏日期为2019年1月23日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心)，其一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力或略有提高，又极大地缩短了发酵生产DC12的发酵时间，使得维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的工业化成为可能。该菌株发酵并使用本发明的精制方法获得产品十二碳二元酸，形态为具有较为紧密结晶体的结构，大大减少了粉末程度的同时，减少了产品包装尺寸，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求的同时，更利于长途集装箱的运输并减少货柜装量。
维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的培养特征如下：
原料包括碳源的混合物，包含一种或多种选自糖、纤维素、烷烃、脂肪酸、三酰甘油、石蜡等或它们的组合的碳源。氮可自无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，脲或谷氨酸)供应。除合适的碳源和氮源外，培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素、金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)和其他组分。或使用酵母复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(YPD))或其他可商品化制备的(如酵母氮基料(DIFCO Laboratories,Detroit,Mich.)通用酵母培养基中培养维斯假丝酵母。在本发明的一个优选斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基。液体发酵培养基包括：碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L,钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法是以热带假丝酵母维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)为发酵菌种，在以正十二烷(nC12)为基质的发酵培养基中同步发酵，生产α，ω-正十二碳二元酸。
发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法的步骤为：
第一阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的种子培养，即将维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)接入发酵培养基，28～29℃220转/分的旋转摇床上培养40～24小时，菌株生长OD值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。
第二阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的发酵产酸阶段，即将培养成的种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中。所述混合液24～29℃转化48～52小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。更优选地，所述混合液在pH 6.0～7.5下24～29℃下转化52小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。更优选地，从24小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
优选地，本发明还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段：即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC12钠盐和DC12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC12白色结晶。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
用本发明的维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)菌株和发酵方法，可在工业化发酵罐，从nC12发酵生产DC12时，培养52h时产酸142g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.73g/h·L，转化率93.2％。DC12纯度达到99％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。此外，令人意外地，本发明的DC12生产产品具有令人满意的片层状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：
(1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段；
(2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段；
(3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段，其中，
所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的保藏号CCTCC No.2019076。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的种子培养阶段为：将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201接种至发酵培养基中生产菌体。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl 0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种子发酵罐中培养。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段获得的种子液在发酵罐中进行产酸培养，所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置，以及设置于发酵罐中部的烷烃输入装置，所述发酵罐中部包括自发酵罐顶部1/3处至下部1/3处的中间1/3处之间任意位置，可以设置一个或多个烷烃输入口，只要使得烷烃的流入速度保持在本发明实施例所需的特定速率即可；所述底部通气装置的通气量为1:0.5～1:0.7；所述搅拌装置的转速为100～150转/分钟。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中；所述混合液在pH值为5.5～9.0下、24～29℃转化48～52小时，并从发酵培养第24小时开始，每天补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中；所述混合液在pH 6.0～7.5下24～29℃下转化48～52小时，并从发酵培养第24小时开始，每天补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
在本发明的一个实施例中，还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段：即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC12钠盐和DC12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC12白色结晶。
优选地，在本发明的一个实施例中，提供了上述方法获得的产品及上述方法使用的菌种维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖40g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在29℃，230～240r/min条件下振荡培养24小时，检测菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将种子液以20％的接种量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸80.2g/L，培养52h时产酸120g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.31g/h·L。
其中，DC12回收方法为有机溶剂回收法，发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC12白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC12纯度98.23％，其中一元酸含量0.030％。
实施例2：
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖35g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温1.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，250r/min条件下振荡培养24小时，将培养液以20％的接种量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将获得的种子液以20％的接种量接种于装35L发酵培养基的50L发酵罐中，初始pH7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸91.5g/L，培养52h时产酸136g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.62g/h·L，转化率92.1％。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC12产品。DC12纯度达到99.35％，其中一元酸的含量0.005％。
实施例3：
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖35g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温1.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，250r/min条件下振荡培养24小时，将培养液以20％的接种量接种于装3L发酵培养基的5L发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
将5L发酵罐中的3L种子液接种到装有1.5m3发酵液的2m3发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将获得的种子液以20％的接种量接种于装189L发酵培养基的50L发酵罐中，初始pH 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸94.3g/L，培养52h时产酸142g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.73g/h·L，转化率93.2％。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC12产品。DC12纯度达到98.75％，其中一元酸的含量0.010％。
对比例1：
该对比例使用热带假丝酵母UH-2-48，保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL95117436.3)，其他方法同实施例1即：
(1)、取一接种环热带假丝酵母UH-2-48菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。
(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有KH2PO4 8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，PH5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6N NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH2PO410g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nC12200ml/l，自来水配置，PH7.2。在110℃下灭菌30分钟。
发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC12白色粉末，用15ml中型乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC12含量为62.7g/l，纯度97.23％，其中一元酸的含量为大于1.2％。
通过比较发现本发明的实施例1获得产品晶体更大，产品体积更小，而对比例1获得产品基本为粉末状。相同质量产品本发明实施例1产品仅为对比例50％左右。
对比例2：
该对比例使用热带假丝酵母UH-2-48，保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL95117436.3)，其他方法同实施例2即：
(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
(2)把3000mL培养两天，OD(×30，620nm)为0.81pH 3.8，健壮，热带假丝酵母UH-2-48无杂菌种液接入装有700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm2，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700L种液接入装有6.5m3种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.7，培养40～24小时，作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液，接入装有33m3发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.5，开始时，nC12 4m3，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生20.1g/L DC12，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到108g/L，70小时后每天补加一定量nC12，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达133g/L，发酵到163小时结束，产酸量达143g/L。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH 3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色粉末状DC12产品。nC12转化率为88.8％，后处理总收率达到85％，DC12纯度达到96.35％，其中一元酸的含量大于1.5％。
通过比较发现本发明的实施例2的获得产品晶体更大，产品体积更小，而对比例2获得产品基本为粉末状。相同质量产品本发明实施例2产品包装体积仅为对比例50％左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：
(1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段；
(2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段；
(3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段，其中，
所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的保藏号CCTCC No.2019076。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1201的种子培养阶段为：将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201接种至发酵培养基中生产菌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl 0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种子发酵罐中培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1201发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段获得的种子液在发酵罐中进行产酸培养，所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置，以及设置于发酵罐中部的烷烃输入装置。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中；所述混合液在pH值为5.5～9.0下、24～29℃转化48～52小时，并从发酵培养第24小时开始，每天补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法获得的产品。
10.根据权利要求1～8任意一项所述的菌种维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201。
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