CN102115767B - 微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法 - Google Patents

微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物同步发酵正十一烷(nC11)高产十一碳二羧酸(DC11)的方法。所用微生物为一株热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1保藏号为CCTCC NO：M 209223。其特点是：在微生物菌种接入正烷烃为基质的培养基后，28小时内，pH控制在6.8以下，以菌体生长为主，也产生一定量的二元酸；28-60小时，pH控制在7.3以下，以产酸为主，也增长一定量的菌体；60小时以后，pH控制在8.0以下，迅速产生各种二元酸。当本方法用于发酵正十一烷(nC11)生产十一碳二羧酸(DC11)时，在210m3发酵罐内，发酵150小时，DC11产量高达156g/L，转化率达到86.7％，DC11纯度达到98.2％。

Description

微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法
技术领域：
本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是发酵正十一烷(以下简称nC11)高产α，ω-十一碳二羧酸(以下简称DC11)的方法。 
背景技术：
C10以上的长链二元酸是化工上合成高级香料、高级尼龙工程塑料、高档服装用尼龙热熔胶、高温电解质、高级涂料、润滑油和耐寒性增塑剂等的重要原料，尤其是十三碳二元酸(DC13)和十五碳二元酸(DC15)，它们分别是合成日用香料麝香-T和名贵香料麝香酮的重要原料。 
C10以上的长链二元酸，在自然界中不单独存在，只有少数几种二元酸可以从植物油中裂解制取，例如癸二酸(DC10)可从蓖麻籽油裂解制取；DC13可从菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生产；DC15可从蒜头果油中的脑神经酸裂解制取。但它们都受农田和气候的限制，远不能满足需要。除DC12以外，化工上至今也还没有经济可行的合成路线和方法。微生物学家应用生物工程技术，利用微生物发酵石油中的正构烷烃生产相应链长的二元酸，弥补了化工上的不足，开辟了长链二元酸的新来源。 
七十年代以前，各国科学家对微生物发酵生产二元酸的研究，只处于理论研究阶段，所产生和积累的二元酸也都是十个碳以下的短链二元酸，七十年代以后，进入应用研究阶段，通过大量的菌种诱变筛选，培育出一批新突变菌株，能从十个碳以上的正烷烃产生和积累与基质链长相同的长链二元酸，并通过不断的培育和代谢调控研究，使每升发酵液中二元酸的积累从开始时的几克、十几克、几十克，提高到目前的一百多克。八十年代以来，二元酸的研究进入小规模工业化生产阶段，并出现了几个有实际生产价值的文献。 
十一碳二元酸(DC11)是化工上合成尼龙工程塑料、润滑油和农药等的重要原料。至今国内外还没有经济可行的化工合成方法。用生物合成法合成生产DC11的报道不多。目前报道的最好的十一碳二元酸的发酵生产结果为：在200m3发酵罐中，发酵时间165小时，发酵液中DC11含量为120.4g/L，烷烃转化率为64.55％。 
发明内容：
本发明的目的在于提供一种新的微生物菌种，以及利用该微生物菌种同步发酵正烷烃生产C10-C18长链α，ω-二元酸的方法，尤其是同步发酵正十一烷烃，高产α，ω-十一碳二元酸的方法。 
本发明所提供的菌种为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母【参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980】为出发菌株，通过紫外线照射诱变、筛选培育出来的，具体步骤如下： 
接一接种环上述热带假丝酵母菌体，装于25ml麦芽汁液体培养15小时，分别取3ml种液放入灭过菌并带有一个玻璃磁转子的培养皿中，打开培养皿盖，在24W的紫外线灯下16cm处照射1min、2min、3min、4min，不同照射剂量的菌液稀释10-1，在黑暗处放置2小时，用生理盐水分别稀释菌液10-4-10-6，吸取稀释好的菌液0.1m涂布于10个巴林糖度的麦芽汁琼脂培养平板上，每个稀释度涂布3个平板。将涂好的平皿用黑纸包好，置于28℃的培养箱中培养2天，统计致死率。 
菌种筛选：以出发菌株为对照，对诱变后的菌株进行发酵产酸试验及产酸量检测，筛选出高产α，ω-十一碳二羧酸的菌株，即为热带假丝酵母(Candidatropicalis)ly-1，该菌种能以C10-C18的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十一烷为基质原料，发酵生产出相应的长链二羧酸。 
本发明热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1已于2009年10月14日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 209223。 
热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1的生理特性如下： 
糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。 
同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+， 
海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。 
生长素的需要：生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+， 维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。 
其他：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。 
热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。 
培养特征： 
在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。 
本发明所述同步发酵生产长链二羧酸，特别是十一碳二羧酸的方法是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1为发酵菌种，在以正十一烷为基质的培养基中同步发酵，生产α，ω-十一碳二元酸。 
同步发酵生产二元酸过程中所使用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1的种子培养方法如下： 
种子培养基和发酵培养基： 
(1).10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面； 
(2).10个巴林的麦芽汁液体培养基； 
(3).混合液体种子培养基包含：KH2PO4 6-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖13-38g/L，尿素3-6g/L，自来水配制，自然PH。 
培养种子的过程为：取一接种环热带假丝酵母ly-1菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7mL培养基，放成斜面)，于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的热带假丝酵母ly-1菌种刮入装有25mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的热带假丝酵母ly-1菌种全部刮入装有500mL混合液体种子培养基的5000mL三角瓶中，于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时，菌株生长光密度OD达到0.6，作为一级种子罐的种子。 
同步发酵生产二元酸的方法如下： 
发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐6-14g/L(最好为7-10g/L)、氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L(最好为3-5g/L)、玉米浆3-5g/L、尿素0.5-2.5g/L(最好为1.0-2.0g/L)、硝酸盐5-10g/L(最好为6-8g/L)、蔗糖10-30g/L(最好为10-20g/L)、消泡剂400-1200ppm以及一些其他公知的营养源。 
上述碱金属磷酸盐可从KH2PO4、NaH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4中选一种，硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。 
发酵基质正十一烷烃和发酵培养基在混合发酵液中的用量比例为：10-45％(V/V)的正十一烷烃(nC11)和55-90％(V/V)发酵培养基；，最好为10-20％的正十一烷烃(nC11)和80-90％的发酵培养基。 
具体发酵过程如下： 
将前述制备的发酵种子，按发酵培养基量的15-25％(V/V)的用量，接入PH 5.5-9.0，最好为6.5-8.0的含有15-45％(V/V)正十一烷烃(nC11)，最好为10-20％正十一烷烃(nC11)的发酵培养基混合液中，将上述混合物在25-32℃，最好在28-30℃，通气发酵48-160小时。28小时内，PH控制在6.8以下，以菌体生长为主，产酸为副，此时菌株生长光密度OD达到0.4以上，产酸达到18-25g/L，在28-60小时，PH控制在7.3以下，产酸为主，菌体生长为副，此时OD达至0.8左右，产酸达到45-65g/L，从60小时以后，每隔4-6小时用NaOH溶液调一次PH至7.5-8.0，菌体量不再增加，而产酸量继续迅速增加，发酵完成后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时，混合液中正烷烃含量最好为10-20％(V/V)，以后在适当时间补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5％(V/V)为准。 
发酵结束后，加碱至PH10-12，加热至85-90℃，进行破乳分层，上层为残油，回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤或离心，合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃，脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至60-70℃，加HCL或H2SO4至PH3-4进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，用空气吹干，60℃烘干，得白色十一碳二羧酸结晶。 
其中在210m3发酵罐中，发酵nC11生产DC11时，发酵150小时，产酸量达到156g/L，nC11转化率86.7％，后处理总收率达到92％，DC11纯度为98.2％。与现有技术所报道的结果相比较，发酵时间少15小时，DC11的产酸水平却高30％，nC11的转化率高34.3％。 
应用本发明所述的热带假丝酵母ly-1菌种和发酵方法，在以C10-C18的单一或混合正烷烃为基质的培养基中同步发酵，可生产相应的C10-C18α，ω-二元酸。 
具体实施方式：
实施例1. 
(1).取一接种环热带假丝酵母ly-1菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。 
(2).取(1)中培养好的菌种一支，接入装有25mL混合液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、220rpm的旋转摇床上培养48小时。混合液体种子培养基中，KH2PO4 8g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3g/L，蔗糖25g/L，尿素3g/L，自来水配制，PH 5.0。 
(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL(2)中培养好的种子液，在220rpm的旋转摇床上，30℃发酵4天，每24小时用NaOH调一次PH至7.8。发酵培养基含KH2PO4 8g/L，NaCL 1g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3.5g/L，尿素1.5g/L，KNO3 7g/L，泡敌400ppm，及正十一烷(nC11)200mL/L，自来水配制，PH 7.1，110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用HCL调PH至3，用120mL乙醚提取，除去乙醚，得白色DC11结晶，加入20mL中性乙醇溶解DC11，用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸量。结果DC11产量为78.5g/L，DC11纯度为97.5％。 
实施例2. 
按照实施例1的方法，只是其中发酵基质nC11用nC13替代，所得的DC13产量为53.6g/L，纯度96.8％。 
实施例3. 
按照实施例1的方法，只是其中发酵基质nC11用nC15替代，所得的DC15产量为58.5g/L，纯度97.2％。 
实施例4. 
按照实施例1的方法，只是其中发酵基质nC11用nC17替代，所得的DC17产量为66.2g/L，纯度96.3％。 
实施例5. 
(1).取一接种环的热带假丝酵母ly-1突变株的菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养2天，总共16支。 
(2).取2支(1)中培养好的ly-1斜面菌种，接入装有250mL 10个波林糖度的麦芽汁液体的1000mL三角瓶中，共8瓶，放于220rpm的旋转摇床上， 28℃培养40小时，镜检无杂菌，合并后共2000mL，作为一级种子罐种子。 
(3).把(2)中培养好的2000mL麦芽汁种液，接入装有1400L混合液体种子培养基的2000L种子罐中，于29±1℃，培养罐转速为250rpm，罐压为1kg，通气量1∶1，培养40小时。镜检无杂菌后作为二级种子罐的种子。混合液体种子培养基中含有：KH2PO4 8g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3.5g/L，蔗糖40g/L，尿素3.5g/L，自来水配制，PH5.0左右。 
(4).把(3)中培养好的1.4m3的种子液，接入装有22m3混合液体种子培养基【同(3)】的30m3二级种子罐中，于29±1℃，转速170rpm，罐压1kg，通气量1∶0.8，培养40小时，镜检无杂菌，作为发酵种子。 
(5).把(4)中培养好的22m3种子液，接入装有120m3发酵培养基的210m3发酵罐中。发酵培养基含有：KH2PO4 8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3.5g/L，氯化钠1g/L，KNO3 7g/L，尿素1.5g/L，泡敌400ppm，NaAC 5g/L，加水至100m3，在121℃灭菌，降温至30℃，加入30％浓度工业烧碱，调PH至6.9，加入灭过菌的nC11 18m3，开始发酵，温度控制29±1℃，搅拌速度135rpm，罐压1kg，通气量1∶0.7。发酵过程中，40小时以内，PH控制在7.3以下，40-70小时，PH控制在7.7以下，70-120小时，PH控制在8.0以下，120小时后到发酵结束，PH控制在8.5以下，并于发酵60、90和120小时分别补加nC116m3和定量的营养液。发酵150小时。发酵清液含DC11为156g/L，nC11转化率为86.7％。 
发酵结束后，加热加碱破乳分层，通过膜分离方法，除去菌体，回收nC110.2m3，清液用活性炭脱色，压滤去除活性炭，滤清液加热至70℃，加浓H2SO4连续酸化，冷却结晶，板框压滤、洗涤、吹干、烘干、精制，成为白色结晶固体粉末。收获DC11总量21.54T，后处理总收率为92％，DC11纯度为98.2％。 

Claims (6)

1.一种热带假丝酵母ly-1菌种(Candida tropicalis)，所述菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209223。
2.一种微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1为发酵种子，在以正十一烷为基质的培养基中同步发酵，生产α，ω-十一碳二元酸。
3.如权利要求2所述微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸的方法，其特征在于所说的发酵种子是由热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1菌株经固体斜面培养、麦芽汁液体培养基培养，获得一级种子罐的种子或经固体斜面培养、混合液体种子培养基培养获得一级种子罐的种子；所述固体斜面培养基为10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成；所述麦芽汁液体培养基为10个巴林的麦芽汁液体培养基；所述的混合液体种子培养基包含：KH2PO46-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖13-38g/L，尿素3-6g/L，自来水配制，自然pH。
4.如权利要求2所述微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸的方法，其特征在于，所述方法为：
(1).取一接种环热带假丝酵母ly-1菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天；(2).取(1)中培养好的菌种一支，接入装有25mL混合液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、220rpm的旋转摇床上培养48小时，混合液体种子培养基中，KH2PO48g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3g/L，蔗糖25g/L，尿素3g/L，自来水配制，pH 5.0；(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL(2)中培养好的种子液，在220rpm的旋转摇床上，30℃发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.8；发酵培养基含KH2PO48g/L，NaCl1g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3.5g/L，尿素1.5g/L，KNO3 7g/L，泡敌400ppm，及正十一烷200mL/L，自来水配制，pH 7.1，110℃灭菌30分钟;发酵结束后，用HCl调pH至3，用120mL乙醚提取，除去乙醚，得白色DC11结晶。
5.如权利要求2所述微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸的方法，其特征在于,所述的方法如下：
(1).取一接种环的热带假丝酵母ly-1突变株的菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养2天，总共16支；
(2).取2支(1)中培养好的ly-1斜面菌种，接入装有250mL 10个巴林糖度的麦芽汁液体的1000mL三角瓶中，共8瓶，放于220rpm的旋转摇床上，28℃培养40小时，镜检无杂菌，合并后共2000mL，作为一级种子罐种子；
(3).把(2)中培养好的2000mL麦芽汁种液，接入装有1400L混合液体种子培养基的2000L种子罐中，于29±1℃，培养罐转速为250rpm，罐压为1kg，通气量1∶1，培养40小时，镜检无杂菌后作为二级种子罐的种子，混合液体种子培养基中含有：KH2PO4 8g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3.5g/L，蔗糖40g/L，尿素3.5g/L，自来水配制，pH5.0；
(4).把(3)中培养好的1.4m3的种子液，接入装有22m3混合液体种子培养基的30m3二级种子罐中，于29±1℃，转速170rpm，罐压1kg，通气量1∶0.8，培养40小时，镜检无杂菌，作为发酵种子；
(5).把(4)中培养好的22m3种子液，接入装有120m3发酵培养基的210m3发酵罐中。发酵培养基含有：KH2PO4 8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3.5g/L，氯化钠1g/L，KNO3 7g/L，尿素1.5g/L，泡敌400ppm，NaAC 5g/L，加水至100m3，在121℃灭菌，降温至30℃，加入30％浓度工业烧碱，调pH至6.9，加入灭过菌的nC11 18m3，开始发酵，温度控制29±1℃，搅拌速度135rpm，罐压1kg，通气量1∶0.7；发酵过程中，40小时以内，pH控制在7.3以下，40-70小时，pH控制在7.7以下，70-120小时，pH控制在8.0以下，120小时后到发酵结束，pH控制在8.5以下，并于发酵60、90和120小时分别补加nC116m3和定量的营养液；发酵150小时；发酵清液含DC11为156g/L，nC11转化率为86.7％；
发酵结束后，加热加碱破乳分层，通过膜分离方法，除去菌体，回收nC110.2m3，清液用活性炭脱色，压滤去除活性炭，滤清液加热至70℃，加浓H2SO4连续酸化，冷却结晶，板框压滤、洗涤、吹干、烘干、精制，成为白色结晶固体粉末。
6.一种微生物同步发酵单一或混合二元酸的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的热带假丝酵母，在以C10-C18的单一或混合正烷烃为基质的培养基中同步发酵，生产相应的C10-C18α，ω-二元酸。
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