CN102115765B - 一种发酵转化正十七烷生产十七碳二元酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵转化正烷烃生产长链α，ω-二元羧酸的方法，特别是高产十七碳二羧酸的方法。把一株利用N⁺注入技术进行诱变，通过氧化酶活力筛选培育出来的热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变菌株ly-7培养成的种子液，接入正烷烃和发酵培养基的混合液中，在25-32℃发酵转化48-168小时，然后将产生的长链α，ω-二羧酸进行分离提纯。在5吨发酵罐中发酵转化正十七烷生产十七碳二元酸，144小时，十七碳二元酸的含量达到163g/l。

Description

一种发酵转化正十七烷生产十七碳二元酸的方法

技术领域：

本发明涉及用生物合成技术生产长链二羧酸的方法，具体的说是关于微生物发酵转化正烷烃生产长链α，ω-二羧酸的方法，特别是从正十七烷(nC₁₇)发酵转化高产十七碳二元酸(DC₁₇)的方法。 

技术背景：

长链二元酸是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，是包括C₁₁-C₁₈的一系列二元酸产品，它们有着极其广泛和重要的用途，是化学工业上制造高性能尼龙工程塑料、高级涂料、新兴医药、高档尼龙热熔胶高温介质、生物膜和农药等十几类产业，几十种高档产品的重要原材料。长链二元酸在自然界中不存在，化工方法只能合成十二碳二元酸(DC₁₂)，而且合成条件苛刻，成本高，环境污染严重。因此探索采用生物合成法生产长链二元酸就成为上世纪七十年代以来国内外科研工作者研究的热点课题和化学工业界关注的的焦点。1970年，已故的中科院微生物所副所长方心芳院士，首次开创了石油工业微生物这一新领域，开创了微生物发酵生产长链二元酸的新来源。方院上的接班人陈远童，从1986年以来，领导开展单一长链二元酸系列产品的应用开发研究，二十多年来，已取得7项专利授权证书，4项已形成工业化生产，其中，专利号为ZL89102548.0的发明专利公开的发酵生产DC₁₇，产酸水平达到133g/l，是国内外同类研究成果中产酸水平最高的，但从工业生产角度看，技术还不够成熟，未能实现工业生产。而DC₁₇是化工上生产灵猫香香料的重要原料，自然界中没有，至今国内外都没有经济可行的化工合成方法。本发明在该专利基础上，有了新的发展和提高，可以进行工业化生产。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的微生物菌种，以及利用该微生物菌种同步发酵正烷烃生产C₁₀-C₁₈长链α，ω-二元酸的方法，尤其是可以实施工业化生产的同步发酵正十七烷烃，高产α，ω-十七碳二元酸的方法。 

本发明所提供的微生物菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980)为出发菌株，经过亚硝酸2次处理和紫外线3次照射，以 一种氧化酶活力筛选指示培养基筛选，经过初筛和3次复筛培养出来，具有对nC₁₇ω-氧化酶活力提高30％，β-氧化酶活力降低25％，高产出的生产DC₁₇的优良菌株。 

具体筛选方法为：将出发菌株经过亚硝酸2次处理和紫外线3次照射，用生理盐水分别稀释为10^-1-10^-3，吸取0.1ml稀释好的菌液，涂布于8巴林糖度的麦芽汁琼脂培养平板上，每个稀释度涂布5个平板，用黑纸包好，置于29℃的培养箱中培养40小时，统计致死率。以原出发菌株为对照，对诱变后的菌株进行发酵生产DC₁₇的试验和产酸量检测，所得优选菌株，即为热带假丝酵母(Candidatropicalis)ly-7。 

本发明热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7已于2009年10月14日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 209225。 

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7的生理特性如下： 

糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。 

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。 

生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。 

其他：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。 

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。 

培养特征： 

在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。 

本发明所述的发酵转化正十七烷(nC₁₇)生产十七碳二元酸(DC₁₇)的方法是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7为发酵菌种，在以正十七烷为基质的培养基混合液中同步发酵，生产α，ω-十七碳二元酸。 

发酵生产二元酸过程中所使用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7的种子培养方法如下： 

种子培养基为：(1)10个巴林的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)液体种子培养基，包含KH₂PO₄6-10g/l，蔗糖20-30g/l，酵母膏3-6g/l，玉米浆3-5g/l，尿素2-5g/l，自来水配置，PH5.0。 

发酵种子培养过程为：取一接种环热带假丝酵母ly-7酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15X180试管，每支装液量6-7ml，放成斜面)，于28-30℃培养40-48小时。取2支上述培养好的热带假丝酵母ly-7菌体，全部刮入装有250ml种子培养基的1000ml三角瓶中，共8瓶，于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时，作为一级种子罐种子。再把培养好的一级种子2000ml接入装有600L种子培养基的1000L种子罐中，于28-30℃，搅拌速度350转/分，罐压1KG，通气量1∶1，培养40-48小时，菌株生长光密度OD达到0.7，作为发酵种子。 

发酵转化生产二元酸的方法如下： 

发酵培养基的主要组成为：碱金属磷酸盐4-12g/l，最好7-10g/l，NaCl0.5-2.0g/l，酵母膏0.8-5g/l，最好为2-4g/l，玉米浆0.5-3g/l，尿素0.8-2.2，最好为1-2g/l，蔗糖5-30g/l，最好为15-25g/l，NaAC5-20g/l，最好为10-15g/l，丙烯酸0.2-3ml/l，最好为1-2ml/l，维生素10-100mg/l，最好为30-60ml/l，以及一些公知的营养源。碱金属磷酸盐可以从K₂HPO₄，K₂HPO₄，NaH₂PO₄和Na₂HPO₄之中选一种，维生素可选用维生素A或B。 

发酵混合液中，含有10-40％(v/v)正十七烷烃和90-60％(v/v)发酵培养基，最好是含有10-20％(v/v)正十七烷烃和80-90％(v/v)发酵培养基。 

具体发酵过程如下： 

将前述制备的发酵种子，按发酵培养基量的15-25％(V/V)的用量，接入PH 5.0-8.5，最好是PH 6.5-8.0的含有10-40％(v/v)正十七烷烃和90-60％(v/v)发酵培养基，最好是含有10-20％(v/v)正十七烷烃和80-90％(v/v)发酵培养基的混合液中，将上述混合液在24-32℃，最适宜温度为28-30℃下，通气发酵48-168小时；发酵60小时以内，PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120-168小时，PH控制在8.5以下；发酵到60、90、120小时，分别补加nC₁₇，使发酵液中nC₁₇的浓度≥5％。 

发酵结束后，将发酵液加热加减破乳，加热至80-90℃，加碱至PH10左右，压入静置分层罐分层。残余正烷烃回收再用，膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC17钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC₁₇钠盐和DC₁₇，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC₁₇白色结晶。 

用本发明的菌种和方法，在5m³发酵罐中发酵生产DC₁₇，发酵6天，DC₁₇产量达到163g/l，nC₁₇转化率为75.8％，后处理收率为92％，DC₁₇纯度为98.5％，与陈远童ZL89102548.0专利比较，发酵罐规模从16L到5000L，放大了312.5倍，产酸水平从133g/l提高到163g/l，提高了22.6％，nC₁₇转化率从61.8％提高到75.8％，提高了22.7％，后处理收率从77.6％提高到92％，提高了18.6％，DC₁₇纯度从95.4％提高到98.5％。 

应用本发明所述的热带假丝酵母ly-7菌种和发酵方法，在以C₁₀-C₁₈的单一或混合正烷烃为基质的培养基中同步发酵，可生产相应的C₁₀-C₁₈α，ω-二元酸。 

具体实施方式

实施例1 

(1)、取一接种环热带假丝酵母ly-7菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。 

(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有KH₂PO₄8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，PH5.0。 

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6N NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH₂PO₄10g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nC₁₇200ml/l，自来水配置，PH7.2。在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC₁₇白色结晶，用15ml中型乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC₁₇含量为85.8g/l，DC₁₇的纯度为95.8％。 

实施例2 

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃使用癸烷(nC₁₀)，结果DC₁₀产量为35g/l，纯度为96.2％。 

实施例3 

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃使用正十三烷(nC₁₃)，结果DC₁₃的产量为70g/l，纯度为97.8％ 

实施例4 

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃使用nC₁₆，结果DC₁₆产量为75g/l，纯度为96.2％。 

实施例5 

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃使用nC₁₈，结果DC₁₈的产量为54.3g/l，纯度为90.5％ 

实施例6 

(1)取一接种环热带假丝酵母ly-7菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，共16支，在28℃培养2天，作为三角瓶种子。 

(2)、把(1)中培养好的2支斜面种子，全部刮入装有250ml种子培养基的1000ml三角瓶中，共8瓶，于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时，作为一级种子罐的种子共2000ml。液体种子培养基含KH₂PO₄ 8g/l，酵母膏4g/l，玉米浆3.5g/l，蔗糖30g/l，尿素3.5g/l，自来水配置，PH5.0。在110℃下灭菌30分钟。 

(3)把(2)培养好的2000ml种子液，接入装有600L种子培养基的1000L种子培养罐中，于28-30℃，罐压1Kg，搅拌速度350转/分，通气量1∶1，培养48小时，作为发酵罐发酵种子。OD达到0.8，镜检无杂菌。 

(4)把(3)中培养的600L种子液，接入装有3m³发酵培养基的5m³发酵罐中，于28-30℃，搅拌速度250转/分，罐压为1Kg，通气量1∶1，开始发酵。发酵培养基的组成为：KH₂PO₄8g/l，NaCl 1g/l，酵母膏3g/l，玉米浆4g/l，蔗糖20g/l，NaAC 15g/l，丙烯酸1.5g/l，VB₂ 100μg/l，自来水配置，121℃灭菌40分钟。发酵开始时，PH调至7.1，加入15％(v/v)的nC₁₇，发酵60小时以内，PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120-144小时。PH控制在8.5以下；发酵到60、90、120小时，分别补加nC₁₇，使发酵液中nC₁₇的浓度≥5％。发酵144小时，DC₁₇产量达到163g/l，nC₁₇转化率为75.8％。 

发酵结束后，将发酵液加热到80-90℃，加NaOH调至10左右，压入静置分层罐分层，残烃回收再用。用膜分离除去菌体，清液用水稀释后，加热至65℃，加入浓H₂SO₄，进行酸化结晶。经过板框压滤，洗涤，吹干，烘干，得到白色DC₁₇产品。后处理回收率为92％，DC₁₇纯度为98.5％ 

Claims (4)

1.一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7菌种，所述菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日2009年10月14日，保藏号为：CCTCC NO：M209225。

2.一种微生物发酵转化正十七烷生产十七碳二元酸的方法，其特征在于以权利要求1所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-7为发酵种子，在以正十七烷为发酵基质的培养基混合液中发酵转化，生产α，ω-十七碳二元酸；所述方法为：

取一接种环所述热带假丝酵母ly-7菌株，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面培养基上，共16支，在28℃培养2天，作为三角瓶种子；

把培养好的2支所述三角瓶种子，全部刮入装有250ml种子培养基的1000ml三角瓶中，共8瓶，于28-30℃在220转/分的旋转摇床培养48小时，作为一级种子罐种子共2000ml，所述种子培养基含KH₂PO₄8g/l，酵母膏4g/l，玉米浆3.5g/l，蔗糖30g/l，尿素3.5g/l，自来水配制，pH5.0，在110℃下灭菌30分钟；

把培养好的2000ml所述一级种子罐种子液，接入装有600L所述种子培养基的1000L种子培养罐中，于28-30℃，罐压1Kg，搅拌速度350转/分，通气量1:1，培养48小时，作为发酵罐种子，OD达到0.8，镜检无杂菌；

把培养好的所述600L发酵罐种子液，接入装有3m³发酵培养基的5m³发酵罐中，于28-30℃，搅拌速度250转/分，罐压1Kg，通气量1:1条件下发酵；所述发酵培养基组成为：KH₂PO₄8g/l，NaCl1g/l，酵母膏3g/l，玉米浆4g/l，蔗糖20g/l，NaAC15g/l，丙烯酸1.5g/l，VB₂100μg/l，自来水配制，121℃灭菌40分钟；

发酵开始时，pH调至7.1，加入15％v/v正十七烷，发酵60小时以内，pH控制在7.5以下，60-120小时，pH控制在8.0以下，120-144小时，pH控制在8.5以下，发酵到60、90、120小时，分别补加正十七烷，使发酵液中正十七烷的浓度≥5％v/v，发酵144小时。

3.如权利要求2所述微生物发酵转化正十七烷生产十七碳二元酸的方法，其特征在于，所说的发酵转化结束后，将所述发酵液加热至80-90℃，加NaOH至pH10，压入静置分层罐分层；残烃回收再用，膜分离除去菌体，清液用水稀释后，加热至65℃，加入浓H₂SO₄，酸化结晶，经板框压滤，洗涤，吹干，烘干，得到白色DC₁₇产品。

4.一种微生物同步发酵转化C₁₀-C₁₈的单一正烷烃生产单一的二元酸的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的热带假丝酵母ly-7菌种，在以C₁₀-C₁₈的单一正烷烃为基质的培养基中进行同步发酵，生产相应的C₁₀-C₁₈α，ω-二元酸。