CN1046757A - 微生物发酵正烷烃生产长链α.ω-二羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是高产十七碳二羧酸的方法。把一株热带假丝酵母的突变株NP-260培养成的种子液接入pH值5.0-8.5的含有10-40％(V/V)12-20个碳原子的正烷烃和90-60％(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐5-14克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，酵母膏0.5-4克/升，玉米浆0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，维生素10-100毫克/升。上述混合物在24-32℃下维持48-170小时，然后将产生的α·ω-二羧酸进行分离提纯。
Description
本发明是关于微生物发酵从正烷烃生产长链α.ω-二羧酸，特别是从正十七烷发酵生产十七碳二羧酸的方法。
十七碳二羧酸是人工合成名贵香料灵猫的重要原料。由于用化学方法生产十二碳以上的长链二羧酸比较困难，因此采用微生物发酵生产长链二羧酸已成为人们的研究课题。众所周知，随着碳原子数的增加，长链正烷烃以及与其对应的二羧酸的溶解度会越来越小。在利用微生物发酵的方法中，由于作为底物的正十七烷和产物十七碳二羧酸在水中溶解度更小，因此比生产十二-十五碳的长链二羧酸难度更大。一般来讲微生物最容易氧化十六碳以上的正烷烃和二羧酸，因而要积累十六碳以上的二羧酸，提高其产量仍是有待于解决的难题。
在USP4339536和USP4624920中都公开了利用微生物发酵生产长链二羧酸的方法，其中前者是用热带假丝酵母同化直链烃生产长链二羧酸。从实例中可以看出，用该法生产的最高碳数的长链二羧酸为十三碳二羧酸，产量达45克/升。后者则是用Mycobacterium sp.KSM-B-33从6-22碳正烷烃、脂肪酸及其衍生物在40-50℃较高温以及通气条件下，在有氮源和碳源的培养介质中发酵制备6-22碳二羧酸的方法。在其实例中只提供了在50毫升或500毫升摇动试管中，用异丙基十六酸、甲基十六酸、正十六烷等作为碳源制10-16碳二羧酸的方法，其中十四碳二羧酸的最高产量为16毫克/升培养液，十六碳二羧酸的产量仅为3毫克/升培养液。
日本植村南海男用一株热带假丝酵母突变株M2030从各种单一烷烃生产相应链长的二羧酸，其中从正十七烷发酵生产十七碳二羧酸，在3升发酵罐上产量为70克/升，正十七烷投入量为30%（V/V），正十七烷转化率不
上海沈永强等人用热带假丝酵母N-15高浓度的静止细胞（菌浓15×10°/毫升）转化正十七烷成十七碳二羧酸时，达到101克/升，转化率63.1%（《植物生理学报》1980，Vol.6，No.1）。另外中科院微生物所曾用热带假丝酵母突变株U3-21以生长细胞和静止细胞从10-18碳各种正烷烃发酵和转化生成10-18碳二羧酸，其中十七碳二羧酸的产量分别为41.8克/升和52.5克/升。从以上已有技术可以看出，微生物发酵生成长链二羧酸特别是十七碳二羧酸的产量有待于进一步提高，才能适应工业化生产的需要。在本发明之前曾提交的申请号为87105445的，申请中提供了能够高产十六碳α.ω-二羧酸的发酵菌株和发酵方法，本发明的目的是提供更适于工业化生产的一种两端氧化长链正烷烃特别是正十七烷能力强而β-氧化能力弱的新的热带假丝酵母突变菌株和相应的发酵方法从而进一步提高了十七碳二羧酸的产量。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母突变株（Candida tropicalis mutant NP-260），是以一株两端氧化正烷烃生成长链二羧酸能力较强的热带假丝酵母（参见《微生物学报》20（1）：88-93，1980）为出发菌株，通过亚硝酸钠和紫外线的多次诱变获得的。本发明所用的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC No.0139。
本发明的种子培养基有：（1）10个巴林的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面;（2）烷烃种子培养基包含KH2PO46-10克/升，玉米浆2-4克/升，蔗糖2-5克/升，酵母膏3-6克/升，尿素2-5克/升，重蜡40-60毫升/升，自来水配制，PH值5左右。
培养种子的过程为：取一接种环NP-260酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上（15×180试管，每支装液量6-7毫升，放成斜面）于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的NP-260菌种全部刮入30ml/250ml三角瓶的烷烃种子培养基中，于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养36-44小时，作为一级种子，再把培养好的一级种子20-25毫升接入300ml/3000ml三角瓶或500ml/5000ml三角瓶的烷烃种子培养基中，在28-30℃180转/分旋转摇床上培养2天，作为发酵罐的发酵种子。
用本发明的突变菌株热带假丝酵母NP-260生产长链α.ω-二羧酸，特别是十七碳二羧酸的具体方法是：把发酵种子接入PH5.0-8.5最好为7.0-7.6的含有10-40%（V/V）12-20个碳原子的正烷烃和90-60%（V/V）发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐5-14克/升，最好为6-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，最好为0.8-1.3克/升，酵母膏0.5-4克/升，最好为2-3克/升，玉米浆0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，最好为0.5-2毫升/升，维生素10-100毫克/升，最好为30-60毫克/升，以及其它一些公知的营养源。将上述混合物在24-32℃，更适宜的温度为28-30℃下维持48-170小时，然后将产生的α.ω-二羧酸进行分离提纯。在发酵开始时混合液中正烷烃的含量为10-20%（V/V），然后在适当时间补加正烷烃，以发酵液的正烷烃浓度始终≥5%（V/V）为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4NaH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4之中选择一种。维生素可以选用维生素A或B。
发酵结束后，将发酵液加热至85℃左右，加入NaOH调节PH值至10左右，趁热除去菌体。清液放置冷却后析出大量十七碳二羧酸钠盐结晶，倾出结晶母液（在16-18℃，十七碳二羧酸含量在1%左右）。钠盐结晶用少量自来水清洗，抽干。结晶母液减压浓缩后用同法处理收集十七碳二羧酸钠盐，将以上所得钠盐溶于沸水中，调节PH值为10-12进行脱色，抽滤;滤液加水稀释后加热至90-100℃，加入硫酸酸化，PH值为2-3，静置冷却结晶过夜，然后抽滤水洗，烘干，得到白色片状十七碳二羧酸结晶。
用本发明的热带假丝酵母突变株NP-260和发酵方法，可得到产量较高的12-20碳α.ω-二羧酸，特别是十七碳α.ω-二羧酸。用本方法发酵6天，十七碳二羧酸产量最高可达133克/升，转化率60%以上。
实例一
（1）取一接种环的NP-260，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天;
（2）取上述菌种一支，接入装有30毫升烷烃种子培养基的250毫升三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。烷烃种子培养基中KH2PO48克/升，酵母膏5克/升，玉米浆3克/升，蔗糖3克/升，尿素3克/升，重蜡50毫升/升，自来水配制，PH值5.0。
（3）在装有15毫升发酵培养基的500毫升三角瓶中，接入4毫升上述种子液，在200转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用氢氧化钠调一次PH值至7.5-8.0。发酵培养基含NaH2PO410克/升，酵母膏1.5克/升，玉米浆1克/升，氯化钠1克/升，尿素1克/升，正十七烷150毫升/升，自来水配制，调节PH值为7.2。在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后，用盐酸调节PH值至2-3，用100毫升乙醚提取后蒸去乙醚，得到十七碳二羧酸白色结晶。用标准氢氧化钠溶液滴定，计算出发酵液中十七碳二羧酸含量为83.3克/升。
实例二
种子培养基成分和培养方法同实例1。发酵培养基中KH2PO48克/升，氯化钠1克/升，酵母膏2克/升，玉米浆1克/升，尿素1克/升，正十七烷200毫升/升。接入4毫升种子液，发酵4天。每24小时调一次PH值为7.5-8.0。发酵结束，用盐酸调节PH值至3，用100毫升乙醚提取然后蒸去乙醚得到十七碳二羧酸白色结晶。用标准氢氧化钠溶液滴定，计算出发酵液中十七碳二羧酸含量为87.7克/升。
实例三
（1）取一接种环NP-260菌体，涂布在15×180的大试管麦芽汁固体斜面上，共6支，28℃培养2天;（2）把上述培养2天的一支大斜面菌种接入装有30毫升麦芽汁培养基的250毫升三角瓶中，共6瓶，在28℃下220转/分的旋转摇床上培养2天;（3）把（2）中培养的麦芽汁种液1瓶接入装有210毫升烷烃种子培养基的3000毫升三角瓶中，（种子培养基成分：KH2PO46克/升，酵母膏3克/升，玉米浆3克/升，蔗糖3克/升，重蜡50克/升，尿素3克/升），共6瓶在28℃，180转/分的旋转摇床上培养40小时左右;（4）把（3）中培养的种液接入一个装有8升发酵培养基的16立升自动控制罐中，其中含有KH2PO464克，氯化钠8克，酵母膏16克，玉米浆8克，丙烯酸8毫升，维生素B12150毫克，尿素8克，消泡剂8克，溶于5升自来水中，用氢氧化钠调节PH值至7.5，以及1.2升正十七烷，在121℃灭菌30分钟后，29-30℃时接种;（5）接种后，在30℃搅拌速度500-700转/分，通气量1∶1-1∶1.5，罐压10-15磅/厘米2的条件下发酵140小时，其中在第三、四、五天各补加入400毫升正十七烷。发酵24小时后用氢氧化钠调PH值至7.6。从48小时起，PH值自动控制在7.5直至发酵结束。（6）发酵结束后加入12升水加热，升温至80℃，加入氢氧化钠调节PH值至12以后，离心分出残余正十七烷和菌体，清液浓缩，冷却结晶，过滤，收集十七碳二羧酸的钠盐结晶，然后精制得到白色十七碳二羧酸的钠盐结晶。测得十七碳二羧酸为133克/升，转化率61.8%，精制总收率77.6%。
用气相色谱法对十七碳二羧酸进行定性分析（仪器型号：日本岛津GC7A），如图1，表1、图2所示。图1中1-6分别为已知十一-十六碳二羧酸的峰，根据该谱图作出表1以及表示碳数规律的图2，由此可判断图1中7为十七碳二羧酸。图3为十七碳二羧酸纯度分析色谱图（仪器型号同上），测得其纯度为95.4%。
表1
| 标准二羧酸甲酯组分及未知样 | C11 | C12 | C13 | C14 | C15 | C16 | C未知 |
| 各组分保留时间Vt（分） | 1.50 | 1.88 | 2.39 | 3.09 | 4.12 | 5.34 | 7.10 |
| Vt-Vo(分） | 1.20 | 1.58 | 2.09 | 2.79 | 3.82 | 5.04 | 6.80 |
| LgVt-Vo | 0.08 | 0.20 | 0.32 | 0.45 | 0.58 | 0.70 | 0.83 |
注：死时间Vo是0.30分
Claims (8)
1、一种利用微生物发酵生产长链α.ω-二羧酸的方法，包括菌种筛选，种子液的培养，发酵转化，产物分离提纯等步骤，其特征在于：
(1)把用热带假丝酵母突变株NP-260(Candida tropicalis mutant NP-260CGMCC NO. 0139)培养成的种子液接入PH值为5.0-8.5含有10-40%(V/V)12-20个碳原子的正烷烃和90-60%(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐5-14克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，酵母膏0.5-4克/升，玉米浆0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，维生素10-100毫克/升。
(2)上述混合物在24-32℃下维持48-170小时。
(3)将产生的α.ω-二羧酸进行分离提纯。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于开始发酵时混合液中正烷烃的含量为10-20%（V/V），然后在发酵过程中补加正烷烃，使发酵液的正烷烃浓度始终≥5%（V/V）。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基的组成中：碱金属磷酸盐6-10克/升，尿素0.8-1.3克/升，酵母膏2-3克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，维生素30-60毫克/升。
4、根据权利要求1，2的方法，其特征在于所说的正烷烃含有15-17个碳原子。
5、根据权利要求1，2的方法，其特征在于正烷烃含有17个碳原子。
6、根据权利要求1，3所述的方法，其中碱金属磷酸盐是KH2PO4或NaH2PO4或K2HPO4或Na2HPO4。
7、根据权利要求1，3所述的方法，其中的维生素最好是维生素A或维生素B。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征是发酵的温度控制在28-30℃，发酵液的PH值控制在7.0-7.6。
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