CN1048754C - 微生物同步发酵生产长链α,ω-二羧酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微生物同步发酵生产长链αω-二羧酸的方法，特别是高产十二碳二元酸(DC₁₂)的方法。所用微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)优良生产突变株。其特点是，在微生物菌种接入含有C₁₁-C₁₈各种正烷烃为基质的培养基后体系pH控制在6.0-6.8之间，以菌体生长为主，也产生一定数量的二元酸，当菌体生长光密度OD(×30，620nm)达到0.6以后，体系pH控制在7.0-7.8之间，以产酸为主，生产出与基质链长相同的各种二元酸。本方法用于正十二烷(nC₁₂)发酸生产十二碳二元酸(DC₁₂)时，接种后40Hr，产酸量可达33.3g/L，以后转入发酵产酸为主，到130Hr，产酸量可达145g/L。

Description

微生物同步发酵生产长链α，ω-二羧酸的方法

本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸，尤其是发酵正十二烷(nC₁₂)，高产十二碳二元酸(DC₁₂)的方法。

长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂等的重要原料。DC₁₂是合成高级尼龙工程塑料尼龙12，尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶的重要原料。尼龙12是目前国际上开发出来碳链最长，质量最好，价格最高，年产量达到5万吨的高级尼龙工程塑料。尼经12是1966年由德国HüLs公司和瑞士Emser公司投产，后来法国、日本、美国也均有生产，他们多采用纯化学方法，以丁二烯为原料，在高温、高压，催化剂条件下，经过七个复杂的反应步骤生产的，步骤多，收率低，成本高，我国目前还不能生产。如果以DC₁₂为原料合成尼龙12，只需经过四个反应步骤，条件温和，步骤少，收率高，成本低，是竞争力最强的的合成方法。而DC₁₂自然界中不存在，化工上又难以合成，因此，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下转化石油中的正十二烷，生产DC₁₂，开辟DC₁₂的新来源，为尼龙12、尼龙1212和服装用高档热熔胶的工业生产提供物美价廉的重要原料。

在专利文献中，有从正十二烷发酵生产十二碳二元酸的实验例，但都是实验室水平。在US 4339536中，有生产DC₁₂的实验例，但只达到45g/L水平，在CN1071951A中，其实验例2是异步发酵生产DC₁₂，在3L自动控制罐内DC₁₂达到102g/L，转化率为75％。

本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH-2-48，是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980)为出发菌株，通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C₁₁-C₁₇的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十二烷，高产出地生产相应链长的二元酸。热带假丝酵母UH-2-48(以下简称UH-2-48)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.0239。

本发明的种子培养基：(1)10Be′糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)10Be′糖度的麦芽汁液体培养基；(3)烷烃种子培养基包含：KH₂PO₄6-12g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，玉米浆3-8g/L尿素3-6g/L，重蜡40-70ml/L，自来水配制，自然PH。

培养种子的过程为：取一接种环UH-2-48酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7ml培养基，灭菌后放成斜面)，于29-30℃培养40小时。取一支上述培养好的UH-2-48菌种全部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于29-30℃ 220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的UH-2-48菌种全部刮入装有500mL培养基的5000ml三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。

用本发明的UH-2-48菌株生产长链二元酸，特别是十二碳二元酸的具体方法是：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液接入PH5.5-9.0，最好是6.0-6.8的含有15-30％(V/V)的C₁₁-C₁₇正烷烃和85-70(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐6-14g/L，最好为7-10g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，酵母膏1-6g/L，最好为3-5g/L，玉米浆0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L，最好为1.0-2.0g/L，二甲基亚砜10-20ml/L，消泡剂400-1200PPm，重蜡或蔗糖15-30g/L及一些其他公知的营养源，在PH6.0-7.5下将上述混合物在25-34℃，最好在27-31℃通气发酵72-170小时。在40或48小时之内，体系PH控制在6.0-6.8，以菌体生长为主，同时产生一定数量的二元酸，48小时后，体系PH控制7.0-7.8之间，以发酵产酸为主。从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)。碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄，NaH₂PO₄，K₂HPO₄或Na₂HPO₄中选一种。

发酵结束后，加入适量的水，加碱至PH10-13，加热至80-95℃，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤，合并清液，加入适量活性炭在85-90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至70-80℃，加HCl或H₂SO₄至PH4-5进行酸化结晶，冷却至30℃，压滤，空气吹干，60-70℃烘干，得白色二元酸。

用本发明的UH-2-48菌株和发酵方法，可生产C₁₁-C₁₇的各种单-二元酸和混合二元酸。其中在3吨发酵罐内，从nC₁₂发酵生产DC₁₂时，发酵130小时，产酸量高达145g/L，转化率达到90％，后处理总收率达到80％以上，DC₁₂纯度达到95％以上。实例1.

(1)取一接种环UH-2-48菌种，涂布在Φ15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。

(2)取上述菌种一支，接入装有25ml烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃在200转/分的旋转摇床上培养46小时。烷烃种子培养基中KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3g/L，蔗糖5g/L，尿素3g/L，重蜡50m/L，自来水配制，PH5.0，110℃灭菌30分钟。

(3)在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5mL上述种子液，在200转/分的旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.5-8.0。发酵培养基中含KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏2g/L，玉米浆1g/L，Nacl 1g/L，尿素1.2g/L，重蜡30ml/L，nC₁₂200mL/L，自来水配制，pH7.3，在110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用6moLHcl调PH至3.用乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaoH溶液滴定，计算二元酸含量。结果DC₁₂产量为61.6g/L，DC₁₂纯度97.83％。实例2

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₁结果DC₁₁产量为46.5g/L，DC₁₁纯度为98.58％。实例3

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₄，不加重蜡，结果DC₁₄产量72.3g/L，纯度96.88％。实例4.

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₇，DC₁₇产量为54.1g/L，纯度为97.27％。实例5.

(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。

(2)把2000ml培养两天，OD(×30,620nm)为0.61，PH3.8，健壮，无杂菌的UH-2-48种液接入装有350L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的500L种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养48小时，作为发酵的种子。

(3)把(2)中培养的，健壮，无杂菌的350L种液接入装有1800L发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的3000L发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，开始时，nC₁₂ 240kg，40小时内，体系PH控制在6.0-6.8，菌体迅速生长，也产生33.3g/L DC₁₂，然后控制体系PH为7.0-7.8，继续发酵90小时，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)。发酵130小时，DC₁₂含量为145g/L，转化率90％。发酵结束后，总体积2000L，加入一定量自来水，加热至80℃调PH10，放入静置分层罐分层一天，回收上层残油70kg，下层菌层通过压滤除去菌体，滤清液与中层清液合并，加入0.7％活性炭，90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液打入结晶罐中，加热至70℃，加入浓HCl调PH至4，冷却至室温，板框压滤，空气吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC₁₂ 247kg，后处理总收率85％，纯度97.1％。

Claims (2)

1.一种利用微生物发酵生产α，ω-十二碳二羧酸的方法，其特征在于以正十二烷为基质的培养基中，用热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC 0239发酵，然后收回所形成的二元酸。

2.热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC 0239菌株。