CN101555511A - 一种纳他霉素半固体发酵及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纳他霉素(Natamycin)的半固体发酵方法，其采用多孔颗粒状物质作为发酵基质载体。本发明采用多孔颗粒状物质作为载体，吸附培养基物质，接种纳他霉素产生菌进行半固体发酵。发酵结束后发酵物料原位风干，经装柱浸泡、淋洗、脱溶、稀释沉淀和喷雾干燥得到纳他霉素粉。本发明纳他霉素生产技术所需设备简单，发酵单位高，物料利用率高，提取过程不用强酸、强碱，而且纳他霉素收得率高，基本无废水和废渣排放，符合节能减排环境保护的要求。

Description

一种纳他霉素半固体发酵及提取方法

技术领域

本发明涉及一种抗生素的发酵提取方法，具体地说，涉及一种新型食品、饮料、饲料防腐剂纳他霉素(Natamycin)的一种新的发酵和提取工艺。

背景技术

纳他霉素是一种广谱抗真菌的抗生素，1982年6月美国FDA批准其可以作为食品添加剂使用，1996年我国批准纳他霉素用于干酪、肉制品、糕点、果汁，也可以直接加入发酵酒、酸奶和色拉酱中。据有关专家称，纳他霉素是国际上唯一获得广泛认可的高效安全抗真菌的新型生物源防腐剂。

已知纳他霉素可由三种链霉菌发酵产生，它们是恰塔努加链霉菌(S.chattanovgensis)、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)和褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)。中国的纳他生产企业多数是以褐黄孢链霉菌的不同生产菌株进行生产。

从最早的Cyanamid(1960年)报导发酵生产纳他霉素的方法至今，国内外均采用液体深层通气培养方法发酵生产纳他霉素。由这一发酵工艺的特点所决定，纳他霉素的提取工艺路线都无一例外的要从体积庞大的发酵原液中分离出发酵产物纳他霉素。按目前的发酵水平，发酵液中的纳他霉素仅占1％，甚至不到1％。毫无疑问，这不仅使提取工艺十分困难而且会使用大量的酸和碱，产生大量的废水和废渣，造成环境污染，限制企业的发展，从而也限制了纳他霉素本身的大规模推广应用。

另外，纳他霉素高产菌株在深体深层通气发酵时菌丝都较细、较短。所产生的纳他霉素一般积累在菌丝内或吸附在菌丝的外壁，发酵滤液中含量较少。液体发酵结束后必须将菌体与水分离。由于上述原因，板框压滤有一定困难。板框压滤，废水产生量大约为发酵液体积的70％以上，甚至更多。而且此废水还属于高浓度有机废水，净化处理比较困难。

纳他霉素不溶于水和多种有机溶剂，仅在甲醇、低PH值的甲醇水溶液和高PH值的甲醇水中有较大的溶解度，这样提取工作必然会用到大量酸、碱和水。在较强的酸和碱性水溶液中，纳他霉素都不稳定，会发生甲酯化或皂化等化学反应，破坏其结构，降低纯度，影响其生物活性，从而导致提取收率降低。

目前，对发酵工业企业的环境污染问题，其中主要是废水和废渣问题已经非常重视，对发酵工业企业的污水排放，废渣处理提出许多限制性指标。因此，本发明人对纳他霉素的发酵生产工艺进行改进，研究了传统的半固体发酵方法应用于纳他霉素生产的可行性，及与半固体发酵有关的提取技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种设备投资相对较少，发酵效价相对较高，提取收得率相对较高，能耗低，无污水，废渣少的纳他霉素的半固体发酵及提取方法。

本发明提出了一种纳他霉素的发酵生产技术，将传统的半固体发酵工艺按照纳他霉素的发酵特点加以改变，使纳他霉素发酵效价达到7克/公斤湿料以上。根据本发明半固体发酵物料的特点，发明人还提出了一套简便易行的从固体发酵物料中提取纳他霉素的“五步法”提取工艺。

为了实现本发明目的，本发明的一种纳他霉素的半固体发酵方法，其采用多孔颗粒状物质作为发酵基质载体。

所述的多孔颗粒状物质包括珍珠岩颗粒，玉米芯颗粒、膨化的白碳黑颗粒等生物学惰性颗粒。最优选择为珍珠岩颗粒。

本发明的纳他霉素半固体发酵方法可采用褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)的任何产生纳他霉素的菌株和恰塔努加链霉菌(Strepotomyces chattanovgensis)以及纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)。

所述的发酵基质包括蛋白胨、葡萄糖、玉米浆、酵母浸出物、麦芽提取物、氯化纳、氯化钾等水溶物质溶液，还包括豆饼粉，大豆蛋白粉、酵母粉、鱼粉、大米粉、淀粉、玉米粉等的水悬浮液。

本发明所用的半固体发酵容器包括：半固体发酵罐，通风曲床、浅盘、塑料筐、太空袋、玻璃瓶以及无秞陶罐、砂罐。

本发明纳他霉素半固体发酵采用的主要碳源有四种：葡萄糖、淀粉、大米粉和玉米粉，最优为葡萄糖。本发明的种子和发酵培养基中可以单用葡萄糖一种碳源，也可以葡萄糖为主要碳源，其余3种中的任意一种为辅助碳源，组合成复合碳源。

本发明中发酵采用的氮源有六种：豆饼粉(或豆粕粉)、大豆蛋白粉、酵母浸提物或酵母粉、鱼粉、玉米浆，蛋白胨(豆胨、鱼胨、肉胨)，最优为大豆蛋白粉。豆饼粉或大豆蛋白粉在种子和发酵培养基中为主要的氮源，同时还要与其余5种氮源中的1种或者2种组合形成二元或者三元的复合氮源。最优的氮源组合为大豆饼粉加酵母浸提物，二者优化的重量比为3.9∶0.9或4∶1(W/W)。

半固体发酵培养基中用水量的多少十分重要。在以珍珠岩颗粒为载体时，珍珠岩(干)的重量与水的体积之比(W/V)范围为10∶22～32，最优为10∶26(W/V)；以玉米芯颗粒为载体时其比例为10∶20～30(W/V)；以膨化的白碳黑颗粒为载体时其比例为10∶15～26(W/V)。

纳他霉素半固体发酵的种子为液体深层通气培养而得的种子液。种子液经过斜面菌种、一级种子罐培养、二级种子罐扩大培养而得。斜面菌种的培养基和种子培养基与公开发表的相关技术资料无明显区别，并且不同配方的培养液培养所得的种子对半固体发酵效价影响不大。

纳他霉素半固体发酵的种子为二级种子罐培养了16～48小时的生长旺盛的菌丝体，优选为24～36小时。接种量为100∶5～12(湿物料重量∶种子液体积)，优选为100∶7～9。

要获得高的发酵效价，在纳他霉素半固体发酵的过程中必须补加葡萄糖，在发酵结束前36小时的发酵过程中，发酵物料中的还原糖(葡萄糖)含量须维持在湿物料重量的1.0～5％，优选为2.0～4.0％，最优为2.5％。向半固体物料上补葡萄糖的方法为喷淋法。具体方法是在发酵床上安装翻曲机。在翻曲机与搅龙轴平行的方向上装两排喷嘴，一排在搅龙前，一排在搅龙后。边翻曲边喷加葡萄糖液。葡萄糖用水配制为10～60％溶液，视生产车间的通风量、物料湿度等因素决定。所加葡萄糖液必须是无菌的，除菌方法可用过滤法，也可以采用115℃湿热蒸汽灭菌15分钟的方法。翻曲补糖6～12小时一次。

补糖采用分批补糖的办法，生产中每6～12小时取样分析一次补前的物料中葡萄糖百分含量和纳他霉素效价，当糖的含量低于1.5％时即开始补糖，补进的葡萄糖加残糖之和不应超过上述的5％，最好为2.5％。

发酵过程中需要全程通风。所通入的空气必须是经过严格过滤除菌的空气。风量一般维持在每平方米物料每分钟通过0.02～1.0m³。为了有利于对产生菌氧气的供应，物料在发酵床上的厚度控制在10cm～60cm。

在29℃下，经过5天左右发酵，在效价升高速度明显变缓时停止补糖，其后再维持通气、恒温培养36～48小时，至残糖量降到0.5％以下时停止发酵，取样测定物料的发酵效价。

本发明采用珍珠岩、玉米芯等多孔颗粒状物质作为载体，吸附培养基物质，接种纳他霉素产生菌进行半固体发酵。

本发明采用半固体发酵方法可以避免大量用水，从而也可以避免废水产生。由于水很少，提取工作可省去板框压滤，调酸、调碱等工序，使提取过程简化，收得率提高。本发明纳他霉素发酵过程所需设备简单，发酵单位高，物料利用率高。

本发明采用半固体发酵方法获得的纳他霉素发酵物料，可采用“五步法”进行提取。

具体地说，“五步法”包括如下步骤：

1)发酵物料原位风干：

纳他霉素半固体发酵结束后，开启空气加热器，使进气风温达到32℃～37℃，待风温稳定后送入发酵床的风道。同时加大风量，至发酵时风量的2～3倍。在原位干燥的过程中，每两小时翻动物料一次，10～12小时物料风干至可提取程度。此时物料含水量＜12％。

2)干料装柱用甲醇浸泡并淋洗：

将风干发酵料装入不锈钢浸提柱中，加甲醇浸泡过夜。所用甲醇体积为物料体积的1.1～1.5倍。为防止物料上浮，可用一不锈钢筛板压在物料上方，保证物料全部浸透。浸泡12小时之后，收集浸提液。用2.5倍至3.5倍柱体积的甲醇淋洗，淋洗速度约每2～3小时一个柱体积，取淋洗后的物料测其中残留的纳他霉素含量，计算本步骤提取收率。如果收得率≥98％即可不再淋洗。

3)浓缩脱溶：

将上步的浸液液和淋洗液合并，经过一个微孔滤膜(0.5μm)过滤去渣。

在真空蒸发釜中进行脱溶浓缩，回收甲醇。蒸发温度用35℃～45℃，真空度-0.1MPa。浓缩到原体积的1/8～1/10。

4)浓缩液稀释沉淀并脱色：

向上步骤所获得的浓缩液中分1～3次加入1～6倍体积的无菌蒸馏水，边加边搅拌。同时令温度降到4℃左右，静置过夜让沉淀析出。沉淀纳他霉素的同时脱去色素，用超滤膜滤除大部分水或者虹吸出部分上清。

5)喷雾干燥：

将上步骤的纳他霉素沉淀搅匀，形成悬浊液，在喷雾干燥塔中进行喷雾干燥。干粉含水量在8％为合格。

最后，精制与制剂化。

上述五个步骤获得的纳他霉素干粉为粗制品，其中纳他霉素的含量在80～90％折百总收得率≥70％。作为食品防腐剂还需要进一步精制和制剂化。其精制方法和制剂化方法可参考公知的方法进行，不属于本专利申请保护的技术范围。

本发明为了降低成本并减少废渣排放，本发明所用的多孔载体物质可重复使用。每批次浸提结束之后，用自来水淋洗柱床中的载体淋洗一次，用水约1.0～1.2倍体积。载体下柱，在干燥机中烘干至含水量低于6％，即可用于后面批次的发酵。发明人将一批载体最多反复使用6轮次，未发现载体重复使用对产品生产有不利的影响。

水也可重复使用，为减少污水排放和提高产品收得率，上述载体物质淋洗过程产生的废水要用于下一批次发酵的培养基配制中。上述稀释沉淀工序产生的少量含产品废水在下一批次的“稀释沉淀”工序当蒸馏水套用。

本发明采用以珍珠岩等多孔颗粒状物质为载体吸附葡萄糖、大豆蛋白粉、玉米浆、酵母粉等营养物质后接种纳他霉素生产菌种进行半固体发酵，发酵结束后物料原位干燥，装柱浸泡淋洗得到发酵产物的一整套简便工艺。

本发明纳他霉素生产技术所需设备简单，发酵单位高，物料利用率高，提取过程不用强酸、强碱，而且纳他霉素收得率高，基本无废水和废渣排放，符合节能减排环境保护的要求。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以褐黄链霉菌S.gilvosporeus的L-80菌株为生产菌种，以高氏1号培养基为斜面培养基，接种培养7天，至斜面表面的孢子堆由白转为灰黄色时进4℃冰箱。在冰箱冷藏一周后取出，用无菌蒸馏水制备孢子悬液。孢子悬液中的孢子以每毫升一亿个左右为宜。

斜面孢子经过二级扩大培养得到种子液。种子培养基配方为蛋白胨1.2％，氯化钾0.8％、葡萄糖1.8％。其中葡萄糖用115℃，20分钟单独灭菌。消毒前pH为7.2，消毒后以无菌操作方式加入葡萄糖，混匀后pH为6.9。一级种子用250ml三角瓶装25ml种子液，29℃，180rpm，大振幅摇床培养24小时。镜检无杂菌，转接二级种子瓶。二级种用500ml三角瓶装30ml种子液。用无菌10ml吸管吸取培养好的一级种子的下层(菌丝较多的部分)液10ml接入二级种子瓶。仍然在29℃，180rpm大振幅摇床上培养，30小时后转接半固体发酵瓶。

发酵瓶为1000ml三角瓶。发酵培养液为豆饼粉4％，酵母粉1％，葡萄糖4％，消毒前pH调为7.4，消毒完成后pH为7.0。含量为60％葡萄糖溶液单独消毒，方法为湿热蒸汽灭菌，115℃，20分钟。

本实施例多孔颗粒载体采用珍珠岩。将市售珍珠岩用自来水冲洗一遍，去除其表面可能附有的泥土或其它杂物，烘干至含水量低于6％备用。

1000ml的发酵三角瓶中每瓶装烘干珍珠岩颗粒24克，再加上述发酵培养液54.4ml。以8层棉纱布包瓶口，并用一层牛皮纸再将纱布包住并用索线扎紧。121℃湿热蒸汽灭菌30分钟。灭菌完成并降温至50℃左右加事先灭好菌的60％含量的葡萄糖溶液5.6ml，搅拌均匀。用10ml无菌刻度吸管吸取培养好的二级种子液5.9ml，接种发酵瓶，搅拌均匀，用纱布扎好瓶口(去掉牛皮纸)。

在29℃恒温室中培养40小时，然后每隔12小时补葡萄糖一次，(无菌葡萄糖液制备同上)，一次3ml，搅拌均匀。从40小时计算起，到112小时，共补糖7次，此后停止补糖，继续发酵培养至160小时放瓶。放瓶时残糖平均为0.09％。湿料直接测定效价7828μg/g，风干后效价为22360μg/g。

本实施例共发酵20瓶，收获湿料1726克，湿料转入网盘中，在35℃±1℃暖风中风干过夜。湿料中纳他霉素总产量为13.5克，风干后纳他霉素产量为13.4克，风干过程中纳他霉素损失率0.74％，收得率达到99.26％。

将风干料598克装入一自制的不锈钢柱中，柱容积为5升，物料体积约4升(实测为3.96升)。加4升甲醇浸泡过夜。为防止物料浮起来，在物料上层压一片与柱等径的不锈钢孔板。第二天上午放出浸泡液并用甲醇淋洗，淋洗速度控制为每2小时一个床体积(4升)，共洗2.5倍床体积，即用甲醇10升。实际收获浸泡液和淋洗液12.6升(甲醇损失1.4升)，混匀后测得其中纳他霉素含量为1056.032μg/ml，即通过浸泡和淋洗获得纳他霉素13.306克，本步骤收得率为99.30％。

将上述纳他霉素浸泡提液11.6升在真空蒸发器中进行浓缩，浓缩温度为40℃，真空度为-0.1Mpa，得到纳他霉素悬液0.55升，回收甲醇10.24升。向盛0.55升纳他霉素悬液的容器中加入无菌蒸馏水0.55升，边加边搅拌。同时令温度降到4℃左右，静置过夜让沉淀析出。沉淀纳他霉素的同时脱去色素。取样测得1.05升悬浮液中纳他霉素的含量为12026μg/ml。本步骤收得纳他霉素12.627克，收率为94.9％。

将加水后的纳他霉素悬液经过超滤膜去水，体积由1.05升浓缩为0.45升，用实验室的微型喷雾干燥机将其喷雾干燥，得到纳他霉素粉末，其折百重量为10.34克，纯度为91.6％，颜色近白色，本步骤收得率为75.01％。

由于本实施例中样品量较少，喷雾干燥过程中固形物逃逸、粘附损失较大，故提炼全过程的收得率偏低，仅为70.16％。

实施例2

以褐黄孢链霉菌S.gilvosporeus的Y-42菌株为生产菌种。其斜面培养基为葡萄糖1.2％，酵母抽提取物0.4％，麦芽抽提物0.3％，蛋白胨0.5％，琼脂2.0％，葡萄糖单独灭菌，方法同上。消毒前pH值7.2，用Y42菌株的孢子接种之后在28℃恒温条件下培养7天，进4℃冰箱中冷藏7天后用无菌蒸馏水做孢子悬液。

种子扩大培养仍采用二级种子扩培，种子培养基配方葡萄糖2.0％，蛋白胨0.6％，玉米浆0.6％，KCL0.8％，pH7.0。葡萄糖单独灭菌，方法同上。一级种子在50L种子罐进行培养，投料30L，28℃～29℃，通气量1∶0.6(V/V)搅拌220rpm，培养24小时。二级种子在250L种子罐进行，投料150升，将一级种子液全部移入二级种子罐中(二级种子培养基同一级种子的培养基，另加0.3‰泡敌。28℃～29℃培养，通气量1∶1(V/V)，搅拌转速220rpm。在二级种子罐中培养18小时。

本实施例发酵在李优虎教授设计的固体发酵罐中进行。半固体发酵载体仍采用珍珠岩颗粒。珍珠岩在使用前的处理方法同实施例1。半固体发酵培养液配方为葡萄糖4.0％。酵母粉0.5％，玉米浆0.2％，豆粕粉1.5％，大豆蛋白粉1.5％，玉米粉(100目)1.0％，消毒前pH为7.5。葡萄糖单独灭菌，方法同上。本实施使用处理好的珍珠岩颗粒200公斤，用发酵培养液500升(含葡萄糖液的体积)。灭菌物料中加入葡萄糖液，拌匀后再按7％V/W的接种量接种。用去二级种子液49升。接种后的发酵培养基装不锈钢网盘，每盘55公斤左右湿料，每台固体发酵罐装7盘，每罐装法相同，半固体罐的容积为5M³。发酵条件为28℃～29℃，间歇通气，罐压周期变化，每10分钟罐压由0.01MPa上升至0.15MPa，然后在十秒钟左右急速排气至0.01MPa，再进气升压，再迅速排气，周而复始。发酵至36小时后将罐压降至0MPa，用特制的长管喷雾器将无菌葡萄糖水喷到各物料网盘上，每网盘喷入葡萄糖1.5公斤，水3公斤(即为33.3％的无菌葡萄糖水4.5公斤)。以后每隔12小时补糖1次，共补糖7次。每次补糖后都按上述间歇通气，罐压周期变化的方法发酵。118小时后不再补糖，继续发酵到148小时出罐。

本实施两罐共收获湿物料804公斤，取样检测效价，结果为10769μg/g。以37℃风在原位风干发酵料，收得干物料273公斤，风干物料的效价为31688μg/g，原位干燥步骤纳他霉素收得率为99.91％，测得干物料含水量为9.1％。

将所得到的273公斤干料平均分配装入两根容积为1.3M³的不锈钢层析柱中，加甲醇浸泡过夜，然后以甲醇缓慢淋洗。共用去6.8千升甲醇，收获6.3千升甲醇浸提液。混匀浸提液和淋洗液之后，取样测溶液中纳他霉素的效价为1.330克/升。本提取步骤的收得率为96.77％。

将上述6.3千升甲醇浸提液在1M³的真空蒸发釜中逐次浓缩并回收甲醇。温度39～42℃，真空度-0.1Mpa。经浓缩后，回收甲醇5.7千升，得浓缩液228升。缓慢向盛装228升浓缩液的容器中加无菌无离子水0.4吨，降温至4～6℃，静置过夜。用超滤膜滤去水0.428吨后再加无菌无离子水0.4吨，再用超滤膜浓缩纳他霉素的水悬浮液至99升。取样测得该浓缩液中纳他霉素含量为7.8846％，本步骤收得率为93.15％。

用小型的离心式喷雾干燥塔将99升纳他霉素水悬浮喷雾干燥，得到折百纳他霉素白色干粉6.869公斤。本步收得率为88.00％。

本实施例提取工艺过程总收得率为79.34％。

实施例3

本实施例在半固体发酵床上进行。所用生产菌种为褐黄链霉菌S.gilvosporeus的L-333菌株。其斜面菌种的培养与孢子悬液液的制备同实施例2。

种子扩大培养采用三级扩培方式。种子培养基配方为：淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，豆饼粉(热榨)1.5％，玉米浆0.2％，酵母粉0.5％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙0.8％。消毒前pH7.2。葡萄糖单独灭菌，灭后与其它物质混匀。

一级种子培养用500ml三角瓶。瓶中装种子培养基50ml，接种L-333菌株的孢子悬液5ml。29℃，200rpm大振幅摇床培养16小时。二级种子培养在2000ml三角瓶中进行，每瓶装种子培养基180ml。让一瓶一级种子液沉淀30分钟左右之后用20ml无菌吸管吸取其下部菌丝较多的种子液20ml，转接一个二级种子瓶。共接二级种子12瓶。在29℃，200rpm大振幅摇床培养14小时，下摇床并在无菌室内合瓶。共得到二级种子液2400ml，用作第三级种子扩培的菌种。第三级种子培养在通用式发酵罐中进行。种子培养基不变。种子罐容积250L，装料量120L，培养温度29℃，搅拌转速200rpm，通气量1∶1.2(V/V)。培养时间28小时。

本实施例的半固体发酵载体为玉米芯颗粒。此种颗粒是将玉米芯打碎过筛而得，颗粒直径为1-2毫米。半固体发酵培养基的配方同实施例2。60％的葡萄糖溶液用一种子罐单独灭菌备用。先将玉米芯200公斤，发酵培养基(水悬浮液)360公斤在配料池中混匀。然后装入2M³转锅中高压蒸汽消毒121℃，40分钟，在温度降至40℃时，通过无菌管道加入60％的无菌葡萄糖溶液26.7公斤。此处预计蒸汽冷凝水为30公斤。按总616.7重量公斤总重量的6％接种上述种子液37升(用接种管直接在转锅中进行)。在加糖和接种的过程中采用边喷边转动转锅的办法进行，力求混合均匀。接种完毕将物料铺在发酵床上。物料厚度10-12cm。发酵温度控制在29±1℃，从发酵床底部通入无菌空气，通气量为每分钟每立方物料0.2M³。无菌空气由空气加热器控制其温度为29～30℃。在发酵至40小时的时候用翻曲机翻料一次，翻料的同时喷30％浓度的葡萄糖水补糖并补水，此次喷补糖水61.67公斤。其后每隔12小时喷施糖水一次，每次补糖水41.1公斤。共补糖水6次。发酵到144小时的时候停止发酵，取样测发酵效价，5次重复。用HPLC测得湿料平均效为10438.2μg/g。按实收湿料616.7公斤推算，发酵过程产生纳他霉素6.437公斤。

发酵结束后湿料用温热风原位风干。通过空气加热器将风温升到37-38℃，风量控制在2.0-2.2M³/分.M³，让发酵物在发酵床上干燥，30小时后收料过秤，共收获干物料272公斤，测得干料中素的含量为23525.82μg/g。素的总产量为6.399公斤，干燥过程收得率为99.41％。

装柱浸提和甲醇淋洗以及真空浓缩回收甲醇等工序的操作情况与实施例2完全相同。但是加水稀释浓缩液沉淀纳他霉素一步与实施例2有区别，其不同之处就在于本例不用无菌无离子水，而是用的实施例2中超滤膜滤出的清液。此水中含有纳他霉素192μg/ml。本实施例得到的浓缩液为213升，缓慢向浓缩液中加入250升实施例2中的滤清液，降温至4℃，静置过夜，再用超滤膜去水收集纳他霉素，收集到纳他霉素浓的水悬液79升。取样测得其中纳他霉素含量为76626μg/ml，本步骤产量为6.05345kg，本步骤提取收率为94.73％。

用喷雾干燥塔将纳他霉素浓的水悬液喷干，获得近白色纳他霉素折百干粉5.2907公斤。喷干过程收得率为87.40％。

实施例3提取总收率为81.192％。本实施例套用以上实施例2的水，不仅纳他霉素收得率有所提高，而且回收利用了生产废水，减少了环境污染。

实施例4

本实施例生产菌中采用纳塔尔链霉菌S.natalensis的N-1菌株。发酵容器为无秞陶罐。载体为白碳黑颗粒。

以高氏1号培养基为斜面培养基，接种后在恒温箱中28℃培养8天，至斜面表面的孢子堆转为浅灰色后收入冰箱4℃保藏备用。用无菌蒸馏水制备孢子悬液，每支茄式瓶用水6ml，将孢子层刮下并打散成团孢子。斜面孢子经二级种子扩大培养得到发酵用的种子液。种子培养基配方为蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.1％，葡萄糖1.5％，消毒前PH7.2。葡萄糖单独灭菌，方法同上，灭菌后与其它成份溶液混合。一级种子培养用250ml三角瓶，装25ml培养基，接种上述孢子悬液2ml，28℃，200rpm摇床摇瓶培养24小时。然后转二级种子瓶。二级种子在500ml三角瓶中培养，每瓶装培养基40毫升，接一级种子液10ml，28℃，200rpm摇床摇20小时。

发酵培养基配方为：淀粉2.0％，葡萄糖3.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母粉0.5％，玉米浆0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.5％。消毒前pH7.5，消后6.9。按每100克载体(白碳黑多孔颗粒)加120ML发酵培养基(含葡萄糖在内)的比例配制拌匀，装罐。每罐装湿料250克。将罐子堆码在卧式蒸汽消毒锅中消毒。121℃，40分钟。葡萄糖消毒用115℃，20分钟。在温度降至50℃以下时将葡萄糖溶液(40％浓度)加到罐中，每罐10.2ml无菌葡萄糖液，充分搅拌均匀。再向每罐中接入二级种子液20ml，再次充分拌匀。用八层纱布封罐口。在恒温室中28℃发酵7天。7天后收获物料在干燥房中以暖风(35℃左右)干燥。

本实施例共做48罐，投入湿料12公斤。收获湿料9.38公斤。发酵完成之后，测得湿料效价，三次重复，结果平均为2248μg/ml，产量为21.07克。

本实施例在发酵过程中未进行补糖。发酵结束后未进行纳他霉素提取。

实施例5

本实施例生产菌种采用恰塔努加链霉菌(S.chattanovgensis)的C-103菌株。发酵容器为市售的多网格状网眼的塑料筐。载体选用玉米芯颗粒。

斜面培养基和种子培养基均同实施例4，制备种子液的方法也同实施例4。

半固体发酵培养基配方为：大米粉1.5％，葡萄糖4％，大豆蛋白粉2％，酵母粉0.5％，鱼蛋白胨0.5％，轻质碳酸钙1％。消毒前pH用NaOH溶液调为7.6，消后6.8。葡萄糖配成50％浓度溶液单独灭菌，灭菌后加到培养基中，方法同前。半固体发酵培养基物料是用四层纱布自制的纱布袋装着在高压锅中灭菌的。每袋装湿料2280克，其中玉米芯800克，培养基物质悬浮液1480毫升(包括葡萄糖溶液的体积，118ml)。发酵培养基在灭菌结束后加入无菌葡萄糖溶液，再接种摇瓶种子液，接种量为5％，即每袋用种子液114ml混合均匀。在事先用甲醛熏蒸杀菌的塑料筐内铺上二层灭过菌的报纸，然后将物料袋放入其中，摊平，再用三层无菌的湿报纸盖在物料袋外面。置于28-29℃的培养室中发酵。发酵24小时后注意检查料温，不让其超过31℃，温度达到31℃时翻动物料并通过无菌空气降低培养室温度。分别在36小时，48小时，60小时，72小时，100小时向物料袋内补糖水各一次，无菌葡萄糖水浓度50％，每袋每次补进47.8ml。补葡萄糖水的过程用50ml注射器进行，补毕将其与袋内物料混匀。发酵进行到160小时结束。揭去塑料筐上下的报纸。培养室升温至37℃，吹入同温度暖风，令物料中水份挥发。两天后物料含水量降到10％。取样测效价，6次重复平均值为1673.33μg/g。本实施例共做10筐，收获干料8565克，理论素产量为14.3292克。

本实施例的发酵产物未做提取试验。

实施例6

本实施例所用生产菌种为S.gilvosporeus的Y-42菌株。半固体发酵载体为实施例2中已经使用过一次的珍珠岩颗粒。将实施例2中已经用甲醇基本上洗净纳他霉素的珍珠岩用1倍柱体积的去离子水缓慢淋洗一次，然后取出在烘房烘干即重复用于本实施例。

本实施例的斜面孢制备，孢子悬液制备，一级种子和二级种子制备均与实施例2相同，发酵过程也在李佐虎教授设计的固体发酵罐中进行。其半固体发酵培养基的配方，发酵控制参数、装料量与补糖工艺完全同实施例2。

本实施例共得湿物料807公斤，取样测得发酵效价为11637μg/g，37℃风干得干料282公斤，干料效价33035.2μg/g。

与实施例2比较，可以看出珍珠岩颗粒作为载体重复使用第二轮发酵生产纳他霉素的效价与第一轮使用效价接近，未发现明显的负面影响。

实施例7

本实施例所用生产菌种仍为S.gilvosporeus的Y-42。除了本实施例所用的珍珠岩颗粒是实施6中用过的载体第三轮重复使用之外，本实施例所有操作方法，工艺参数完全按照实施例6。

本实施例收得湿物料812公斤，取样测得发酵效价为10989μg/g，37℃风干得干料289公斤，干料效价30752.2μg/g。

实施例8

本实施例所用菌种不变，仍为Y-42菌株。一切配方、工艺、操作方法均按实施例2和实施例6进行，仅仅只是珍珠岩颗粒为实施例7中用过的回收载体重复第四轮使用。

本实施例收得湿物料818公斤，发酵效价11034μg/g，37℃原位干燥后收获干物料294公斤，干料效价30537.3μg/g，风干过程收得率99.47％。

完全按实施例2的提取过程进行提取，最终收得近白色纳他霉素干粉7.4748公斤，总收得率为82.81％。

本实施例已经是珍珠岩重复第四轮使用，生产中仍未发现发酵效价有明显下降，也没有发现收得率有明显下降。产品质量也没有发现问题，证明本发明中的载体(优选为珍珠岩颗粒)是可以重复使用的。这样可大大减少生产废渣的排放，有利于降低生产成本和保护环境。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种纳他霉素的半固体发酵方法，其特征在于，其采用多孔颗粒状物质作为发酵基质载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多孔颗粒状物质包括珍珠岩颗粒、玉米芯颗粒或膨化的白碳黑颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述半固体发酵方法采用褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)的任何产生纳他霉素的菌株和恰塔努加链霉菌(Strepotomyces chattanovgensis)以及纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)进行。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述的发酵基质包括蛋白胨、葡萄糖、玉米浆、酵母浸出物、麦芽提取物、氯化纳或氯化钾水溶物质溶液，还包括豆饼、大豆蛋白粉、酵母粉、鱼粉、大米粉、淀粉或玉米粉的水悬浮液。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，在半固体发酵过程中，每6～12小时翻曲一次，每次翻曲的同时，采用喷淋方式向发酵料中补充无菌葡萄糖水溶液，补糖量控制为湿料重的1～5％，优选为2.0～4.0％，最优为2.5％。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述多孔颗粒状物质反复用于半固体发酵。

7.权利要求1-6任意一项半固体发酵方法获得的纳他霉素发酵物料的提取方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)发酵物料原位风干；

2)干料装柱用甲醇浸泡并淋洗；

3)浓缩脱溶；

4)浓缩液稀释沉淀并脱色；

5)喷雾干燥得到粉末状产品。

8、根据权利要求7所述纳他霉素发酵物料的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述原位风干至物料含水量＜12％。

9、根据权利要求7或8所述纳他霉素发酵物料的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述甲醇的体积为物料体积的1.1～1.5倍；所述甲醇淋洗的体积为2.5倍至3.5倍柱的体积，淋洗速度为每2～3小时一个柱体积。

10、根据权利要求7所述纳他霉素发酵物料的提取方法，其特征在于，步骤4)中所述浓缩液加无离子水分1～3次稀释1～6倍，沉淀纳他霉素的同时脱去色素。