CN103131662A

CN103131662A - 基因工程菌株恰塔努加链霉菌l11的构建及培养方法

Info

Publication number: CN103131662A
Application number: CN2013100636506A
Authority: CN
Inventors: 李永泉; 王月月; 江辉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明提供一种基因工程菌株恰塔努加链霉菌，命名为：StreptomyceschattanoogensisL11，保藏登记号：CGMCC No.7182，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过基因改造纳他霉素生物合成途径中的限速酶获得。与原始菌株恰塔努加链霉菌L10相比，L11的遗传性状更稳定，纳他霉素发酵单位从2.21g/L提高到3.12g/L，而且纳他霉素发酵周期从144小时缩短为120小时，纳他霉素产量提高了40%，而且发酵周期缩短了24小时，降低工业化生产过程的成本，可在产生纳他霉素中的应用。

Description

基因工程菌株恰塔努加链霉菌L11的构建及培养方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及微生物制药领域中的基因工程菌株恰塔努加链霉菌L11及其培养方法。

背景技术

纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，由于其高效、广谱、安全等优点被广泛用于食品防腐剂和药物。它能有效抑制大多数酵母和霉菌的生长，阻止真菌毒素的形成；由于其难溶于水和油脂，它很难被动物或人体的肠胃吸收，因而对哺乳动物细胞的毒性极低。

作为食品防腐剂，纳他霉素具有低剂量、高效率、抗菌时间长、不影响食品的口味等优点。美国FDA（Food and Frug Administrition）已经批准纳他霉素用作食品防腐剂，并建议纳他霉素作为食品添加剂使用，还被归类为GRAS产品之列。1997年，我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为霉克（Natamycin^TM）。纳他霉素还作为高效抗菌剂应用于滴眼液或软膏等药物中，用来治疗真菌性角膜炎、脚藓等真菌性皮肤感染疾病。目前已有30多个国家批准使用它作为天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂。国际上多采用褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）发酵生长纳他霉素。

本发明人筛选得到了一株纳他霉素生产菌株恰塔努加链霉菌L10，利用该菌株生产纳他霉素的方法已经获得中国发明专利（ZL200810162820.5）。该菌株纳他霉素的遗传性状和发酵单位稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产，但是该菌株的发酵单位较低，在工业发酵培养基中纳他霉素发酵单位为2.21 g/L；而且发酵周期较长，纳他霉素产量在培养144小时才达到最大值。

发明内容

本发明的目的是提供一株基因工程菌株恰塔努加链霉菌株，本发明提供的链霉菌属为恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L11，所述恰塔链霉菌命名为： Streptomyces chattanoogensis L11，与原始菌株恰塔努加链霉菌L10相比，纳他霉素产量提高了40%，而且发酵周期缩短了24小时。该菌保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏日：2013年1月21日，保藏登记号：CGMCC No. 7182。所述恰塔努加链霉菌的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该DNA序列就命名为合成酶基因1。

本发明的另一个目的是提供所述的恰塔努加链霉菌的培养方法，通过以下步骤实现：

（1）固体培养：把恰塔努加链霉菌L11（CGMCC No. 7182）的菌株接种于固体培养基中，于28℃培养箱中培养10天，收集孢子；

（2）液体培养：固体培养后，将孢子接种于种子培养基中，在30℃摇床上培养24h，200rpm，接种至发酵培养中，接种量5%（V/V），培养168h，即得。

步骤（1）所述的固体培养基为：酵母提取物为0.4%，麦芽提取物1%，葡萄糖0.4%，碳酸钙 0.2%，琼脂糖2%，其余为水，pH调至7.2，所述百分含量均为质量百分含量。

步骤（2）所述的种子培养基为：葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%，NaCl 1.0%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。

步骤（2）所述的发酵培养基为：生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。

本发明的再一个目的是提供该菌株在产生纳他霉素中的应用。

本发明通过生物信息学和体外生化反应鉴定出恰塔努加链霉菌L10中纳他霉素生物合成途径中的限速步骤和限速酶，通过基因工程技术提高某些限速酶基因的表达量获得了一系列突变株，从突变株中筛选出纳他霉素的发酵单位提高而且发酵周期缩短的基因工程菌株恰塔努加链霉菌L11。

该菌株在斜面培养基上培养后收集孢子，经种子培养基和发酵培养基进行发酵实验验证，通过高效液相色谱和紫外可见分光光度计测定菌丝和发酵液中纳他霉素的产量，并与原始菌株L10进行比较。结果显示L11的遗传性状稳定，纳他霉素发酵单位从2.21 g/L提高到3.12 g/L，而且纳他霉素发酵周期从144小时缩短为120小时。

本发明通过基因改造纳他霉素生物合成途径中的限速酶以提高纳他霉素的产量，而且缩短发酵周期以降低工业化生产过程的成本。

附图说明

图1是恰塔努加链霉菌L11和恰塔努加链霉菌L10在发酵过程中纳他霉素产量。

图2是恰塔努加链霉菌L11在扫描电子显微镜（9000倍）下孢子的形态照片。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

本发明的恰塔努加链霉菌L11，如无特殊说明其培养方式和发酵条件均与恰塔努加链霉菌L10（中国发明专利ZL200810162820.5）相同。

实施例中所使用的培养基：

1、斜面培养基：酵母提取物0.4%，麦芽提取物1%，葡萄糖0.4%，碳酸钙 0.2%，琼脂糖2%，其余为水，pH值调至7.2，所述百分含量均为质量百分含量。

2、种子培养基：葡萄糖1.75 %，蛋白胨1.5%，NaCl 1.0%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。

3、发酵培养基：生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水, 所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。

4、MS固体培养基：甘露醇2%，黄豆粉2%，琼脂糖2%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，10 mM MgCl₂，pH自然。

实施例1 L11的获得

具体：把SEQ ID NO.1的DNA序列用聚合酶链式反应（PCR）扩增，引物序列：gcgccatatgatcgacaaactgctccc和gcgcaagcttctaccgttcgaccaccaccg。PCR条件：94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，60秒，共30个循环。扩增后的DNA片段通过DNA限制性内切酶（NdeI和HindIII）消化后分别插入质粒pIJ8660中，再分别将含有上诉DNA序列的质粒转化到大肠杆菌ET12567（已含有质粒pUZ8002）之中。

将含有上诉质粒的大肠杆菌ET12567（已含有质粒pUZ8002）分别接种到5 ml LB液体培养基（含相应抗生素）中，37 ℃培养至OD₆₀₀为0.6，离心收集菌体，用10 ml LB液体培养基洗涤一次，用0.5 ml的2×YT液体培养基重悬；将20 μl恰塔努加链霉菌L10的孢子加入0.5 ml的2×YT液体培养基中重悬，45 ℃热休克10 min后冰浴冷却2 min；分别将上诉的大肠杆菌和L10的孢子混合后均匀涂在MS固体培养基上，30 ℃培养16小时后，加入20 μg/ml的萘啶酸和相应的抗生素，30 ℃继续培养4-5天；分别将上诉得到的链霉菌转化子在含有相应抗生素的斜面培养基上培养4-5天后收取孢子，通过PCR方法确证目标DNA序列已经融合在L10的基因组之中得到L11。

实施例2 L11的发酵验证

将20 μl L11孢子接种到种子培养基中，转速200 rpm，30 ℃培养24小时；将种子培养基中的菌丝体接种至发酵培养基中至OD₆₀₀为0.15，转速200 rpm，30 ℃培养168小时，在培养12、24、48、72、96、120、144、168小时后分别取样测定纳他霉素产量。

将纳他霉素标准品用甲醇配成一定浓度的溶液，通过紫外-可见分光光度计测量OD₃₀₃和OD₂₉₀的吸光度，建立纳他霉素浓度—— OD₃₀₃和OD₂₉₀两者之差的标准曲线；取1 ml通过发酵培养基发酵的菌液，加入9 ml 甲醇，剧烈涡旋震荡5 min后，离心取上清，用甲醇稀释至一定倍数后测量OD₃₀₃和OD₂₉₀的吸光度之差，根据标准曲线得到纳他霉素的浓度。在相同培养条件下，L10的纳他霉素产量在培养144小时达到最大值，发酵单位为2.21 g/L；L11的纳他霉素产量在培养120小时达到最大值，发酵单位提高到3.12 g/L，发酵周期缩短24小时，产量提高约40%（图1）。

实施例3 L11的性状和遗传稳定性

L11在斜面培养基培养10天，基内菌丝和气生菌丝发育良好，孢子丝柔曲或弯曲，孢子呈卵圆形，表面具刺（图2）。在各种不同的培养基中的表观特征，结果见表1；L11的生理生化特性见表2。菌株L11在斜面培养基上培养10天后收集孢子，孢子在10%甘油中-80℃保存0-6个月，遗传性状和纳他霉素发酵单位稳定。

<110> 浙江大学

<120> 基因工程菌株恰塔努加链霉菌L11的构建及培养方法

<160> 3

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213>

<223> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L11

<400> 1

atgatcgaca aactgctccc ggcgcccata gcgaccgccg aggctttcga ggacgagccg 60

ctgtccgcga tgttccccga ggaacgggcg ctggtggcca acgcggtccc gcaccgccag 120

cgcgaattcg gcaccgtacg ccactgcgcc cgcaccgccc tgtcggaatt cggcatcgag 180

ccggccccca tactccccgg ccccggccgc gccccccgct ggccgcacgg catcgtcggc 240

gcgctgaccc actgcaccgg ctaccgggcg gcggcggtgg cccgcgcgag ggacctgcac 300

gccatcggcg tggacgccga acccaaccag cccatcagcg accccggcgt cctcgacctc 360

atcgccctcc ccgaagaacg cgcccagctg cgccacttgg ccaccctcga acccggcgtc 420

agctgggacc gcctgatatt cagcgccaag gaatccgtct acaaggcgtg gtaccccctg 480

acctcccgct ggctcggctt cgaggacgcc cacatcaccc tcgaccccac cgacgccacc 540

ttcaccgccc gtctcctcgt cccgggcccg gtggtcgccg ggaccgtgct cgaggagttc 600

agcgggcgtt ggacggtggg tgcggggctg gtggtgacgg cggtggtggt cgaacggtag 660

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 上游引物

<400> 2

gcgccatatgatcgacaaactgctccc

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 下游引物

<400> 3

gcgcaagcttctaccgttcgaccaccaccg

Claims

1.一种基因工程菌株恰塔努加链霉菌，其特征在于，所述恰塔链霉菌命名为：恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L11，已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日：2013年1月21日，保藏登记号：CGMCC No. 7182，所述恰塔努加链霉菌的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.根据权利要求1所述的一种恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）固体培养：把恰塔努加链霉菌L11的菌株接种于固体培养基中，于28℃培养箱中培养10天，收集孢子；

（2）液体培养：固体培养后，将孢子接种于种子培养基中，在30℃摇床上培养24小时，200rpm，接种至发酵培养中，接种量5%（V/V），培养168小时，即得。

3.根据权利要求2所述的一种恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的固体培养基为：酵母提取物为0.4%，麦芽提取物1%，葡萄糖0.4%，碳酸钙 0.2%，琼脂糖2%，其余为水，pH调至7.2，所述百分含量均为质量百分含量。

4.根据权利要求2所述的一种恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的种子培养基为：葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%，NaCl 1.0%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。

5.根据权利要求2所述的一种恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的发酵培养基为：生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。

6.根据权利要求1所述的一种恰塔努加链霉菌在产生纳他霉素中的应用。