CN102161975B - 链霉菌gsdx-1318及发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明筛选一株阿维拉霉素生产菌，它为链霉菌GSDX-1318，分类命名为链霉菌，拉丁学名是Streptomyces sp.，并提供一种发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法，它包括以下步骤：(1)斜面培养：将链霉菌GSDX-1318接种于营养培养基上，进行斜面培养；(2)对斜面培养而得的孢子进行种子培养，得到种子液；(3)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中培养，得到权利要求1所述的链霉菌GSDX-1318的发酵液，分离后获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。本发明采用发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素，工艺过程简单，生产成本低。本发明生产的寡聚糖类抗生素阿维拉霉素可以作为一种广谱、高效、安全的新型饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及的是链霉菌及一种发酵生产寡聚糖类抗生物阿维拉霉素的方法，属于农业生物技术、工业生物技术、发酵工程领域。
背景技术
抗生素添加于饲料中用以促进畜禽生长发育和提高产量报道已有近60年的历史，许多国家都长期应用抗生素添加剂。然而，伴随着抗生素类促生长剂的广泛使用，一系列问题也逐渐显露，主要是药物残留和耐药性问题。长期、广泛、不加选择地使用抗生素饲料给细菌性疾病的控制和治疗带来了极大的麻烦和困难，同时也给人类的健康带来潜在的威胁。目前虽然关于是否应该在饲料中使用抗生素存在众多的争议，但实践证明，合理地使用抗生素添加剂能都促进畜禽生长，提高饲料的转化率。同时也有报告显示，禁止在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生长剂的国家会造成畜牧业生产成本增加、盈利减少，同时也有可能引发诸如生态环境及国家之间的贸易战争等问题。事实上，抗生素添加剂仍在大量使用，只有对它们进行全面的认识和合理的应用，才能充分发挥其有利作用，并避免对人类健康造成伤害。当务之急便是针对微生物的耐药性进行研究，开发广谱、高效、安全的新型饲料添加剂，这不仅能带来显著的经济效益，还具有极其重要的社会意义。
阿维拉霉素(Avilamycin)，是一种安全性高，无残留，毒性小，不存在交叉耐药性，易降解，对环境污染小的广谱、高效、安全的新型饲料添加剂。它又称卑霉素、阿美拉霉素、肥拉霉素，是由绿色产色链霉菌发酵产生的一种寡聚糖类抗生素。作为一种新型的饲料添加剂，具有一下特点：①饲料中添加微量的阿维拉霉素就能促进畜禽的增重。②具有强烈的抗革兰氏阳性菌微生物活性。③由于其不易吸收，只在消化管内发挥其效果，不会残留与畜禽体内。④与临床上现有的抗生素或抗菌药之间不存在交叉耐药性。⑤在饲料中有良好的稳定性。
作为一种动物专用抗生素，阿维拉霉素即能够满足人们对安全性的要求，又可提高畜禽的产量。但目前阿维拉霉素工艺过程复杂，发酵时间长，生产成本高，单位效价低。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是针对背景技术的不足之处，筛选了一株阿维拉霉素生产菌，它为链霉菌GSDX-1318，分类命名为链霉菌，拉丁学名是Streptomyces sp.，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010028，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2010年2月3日。该菌株是由浙江天目山区土壤中分离得到的链霉菌株经过物理诱变、分子生物技术处理后筛选到的稳定的阿维拉霉素高产菌株。其发酵产物阿维拉霉素具有强烈的抗微生物活性，且敏感菌几乎不对阿维拉霉素产生耐药性。
本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法，工艺过程简单，生产成本低。为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下步骤：
(1)、斜面培养：将权利要求1所述的链霉菌GSDX-1318接种于营养培养基上，进行斜面培养；
(2)、对斜面培养而得的孢子进行种子培养，得到种子液；
(3)、发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中培养，得到权利要求1所述的链霉菌GSDX-1318的发酵液，分离后获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
由于采用本发明的技术方案，本发明利用链霉菌GSDX-1318，采用发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素，工艺过程简单，生产成本低。本发明生产的寡聚糖类抗生素阿维拉霉素可以作为一种广谱、高效、安全的新型饲料添加剂。
进一步地，在进行斜面培养时，营养培养基的重量百分配比为淀粉0.5～1％、酵母浸出粉0.4～1％、葡萄糖0.4～1％、大豆蛋白胨或胰蛋白胨0.3～0.5％、琼脂1.5～2％、水余量，营养培养基的pH＝7.2-7.4，培养温度28-37℃，培养时间3-5天；
在步骤(2)中，用0.9％生理盐水将斜面上培养的孢子制成孢子悬液，并接种到100ml种子培养基中培养，种子培养基的重量百分比为甘露醇1～3.0％、豆粕粉2～4.0％、L-缬氨酸2～3％，水余量，种子培养基的pH＝7.2-7.4。培养温度为28℃，转速为220rpm，培养时间2～3天；
发酵培养基的重量百分配比为可溶性淀粉1～2.0％、豆粕粉1～2.0％、大豆蛋白胨0.3～0.5％、D-木糖0.05～0.78％、L-缬氨酸0.1～0.23％、CaCO3 0.03～0.05％、MgSO4 0.03～0.05％、MnCl2 0.03～0.05％、水余量，发酵培养基的pH＝7.2-7.4，温度控制在28℃，转速在200-450rpm，发酵4-8天。
所述的链霉菌GSDX-1318在营养琼脂平板上培养后，大量的灰白色营养菌丝平铺于培养基表面，气生菌丝呈现白色至微灰色。
由于采用本发明的上述技术方案，根据菌株生长代谢过程中对氧需求量的不同，进行分阶段控制溶氧，这是一个有氧、微氧等多阶段的集成发酵，本发明在起始低葡萄糖浓度发酵生产过程中通过流加葡萄糖、豆油等营养物质的方法流加碳源、氮源的方法，并通过发酵不同阶段对溶氧的需求差异的情况下实现了阿维拉霉素产生菌的高密度培养，单位体积发酵液中阿维拉霉素效价高，采用HPLC进行定量分析，单位体积发酵中阿维拉霉素效价达到1194.6～2265.02mg/l。
具体实施方式
实施例1：
链霉菌GSDX-1318可在28-37℃，pH偏碱性条件生长。菌丝放射状伸展，形成有规则的螺旋的单轴孢子，螺旋紧密。菌丝颜色较深，直径较粗。大部分气生菌丝成熟，分化成孢子丝，螺旋紧密的单轴孢子头。通过横隔分裂产生成串的分生孢子。将链霉菌GSDX-1318接种到多种常用天然与合成培养基上培养，观察培养特征(表1)。
表1：链霉菌GSDX-1318在各种测试平板上的培养特征
| 培养基 | 培养特征 |
| 高氏一号培养基 | 气丝灰至褐色，基丝绿褐色。 |
| 葡萄糖天门冬素培养基 | 气丝粉状，白色。基丝白色。 |
| 蔗糖察氏培养基 | 气丝粉状，白色。基丝绿褐色。 |
| 甘油天冬素培养基 | 无气丝。基丝淡褐色。 |
| 无机盐淀粉培养基 | 气丝粉状，绿色带蓝色彩。基丝淡绿褐色。 |
| 淀粉铵盐培养基 | 气丝粉状，绿色带蓝色彩。基丝淡褐色。 |
| 瓦氏肉汁培养基 | 气丝迹量，粉状，白色。基丝灰色。可溶色素深褐色。 |
| 贝氏培养基 | 气丝粉状，绿色带蓝色彩。基丝暗褐色。可溶色素深褐色。 |
| 马铃薯块培养基 | 气丝粉状，灰白色。基丝褐色。可溶色素褐色。 |
| 克氏合成一号培养基 | 气丝粉状，白色。基丝绿褐色。无可溶色素。 |
| 酵母精麦芽精琼脂 | 气丝粉状，绿色带蓝色彩。基丝暗褐色。可溶色素深褐色。 |
链霉菌GSDX-1318能液化明胶，伴有褐色素产生；能凝固并冻化牛奶；有淀粉酶产生，可溶性淀粉；在柴斯纳琼脂培养基上能产生硫化氢；硝酸盐还原反应为阳性；能产生酪氨酸水解酶和利用七叶苷；在碳源利用上，菌株GSDX-1318能利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露醇、纤维素、海藻糖、肌醇、L-阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖，但不能利用棉子糖。细胞壁化学组分分析表明链霉菌GSDX-1318细胞壁组分中有L，L一二氨基庚二酸，无特征性糖(胞壁I型，糖型C)，属于链霉菌属(Streptomyces)。
实施例2：
将链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318接种于可溶淀粉0.5％、酵母浸出粉0.4％、葡萄糖0.4％、大豆蛋白胨0.4％、琼脂2％、水余量，pH 7.2的营养培养基上，进行斜面培养，培养温度为28℃，培养时间3天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种针轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取2ml孢子悬液接种到100ml种子培养基中培养2天，该种子培养基含甘露醇2.0％、豆粕粉4.0％、L-缬氨酸3％，水余量，pH 7.2，培养温度为28℃，转速为220rpm。再将5ml种子液接入到装液量为100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，28℃，200rpm，pH7.2的条件下摇床发酵培养4天，得到链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318发酵液，采用离心分离的方法将菌丝体用甲醇进行提取分离，采用凝胶树脂方法进行精制分离，获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中阿维拉霉素的浓度。单位体积发酵液中阿维拉霉素为1194.6mg/l。
所述的发酵培养基的配比为可溶性淀粉2.0％、豆粕粉2.0％、大豆蛋白胨0.5％、D-木糖0.78％、L-缬氨酸0.23％、CaCO3 0.03％、MgSO4 0.05％、MnCl2 0.05％、水余量。
实施例3：
将链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318接种于可溶淀粉0.6％、酵母浸出粉0.6％、葡萄糖0.6％、大豆蛋白胨0.5％、琼脂1.8％、水余量，pH 7.2营养培养基上，进行斜面培养，培养温度为28℃，培养时间5天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种针轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取2ml孢子悬液接种到100ml种子培养基中培养3天，该种子培养基含甘露醇3.0％、豆粕粉4.0％、L-缬氨酸3％，水余量，pH 7.2，培养温度为28℃，转速为220rpm。再将5ml种子液接入到装液量为100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，28℃，200rpm，pH 7.2的条件下摇床发酵培养6天，得到链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318发酵液，采用离心分离的方法将菌丝体用甲醇进行提取分离，在采用凝胶树脂方法进行精制分离，获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中阿维拉霉素的浓度。单位体积发酵液中阿维拉霉素为1869.25mg/l。
所述的发酵培养基的配比为可溶性淀粉2.0％、豆粕粉2.0％、大豆蛋白胨0.4％、D-木糖0.6％、L-缬氨酸0.23％、CaCO3 0.05％、MgSO4 0.05％、MnCl2 0.05％、水余量。
实施例4：
将链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318接种于淀粉0.8％、酵母浸出粉0.8％、葡萄糖0.8％、大豆蛋白胨0.5％、琼脂1.8％、水余量，pH 7.4的营养培养基上，进行斜面培养，培养温度为37℃，培养时间3天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种针轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取2ml孢子悬液接种到100ml种子培养基中培养3天，该种子培养基含甘露醇2.0％、豆粕粉4.0％、L-缬氨酸3％，余量，pH 7.4，培养温度为28℃，转速为220rpm。再将100ml种子液接入到装液量为1.5L发酵培养基的5L发酵罐中，28℃，空气以1.0L/min流入，维持溶氧浓度(DO)为20-40％，400rpm搅拌混合。用20％(w/v)NaOH将pH值维持在7.2-7.4，适量补葡萄糖、豆油，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到30时，维持溶氧浓度(DO)为6-12％，连续发酵8天，得到链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318发酵液，采用离心分离的方法将菌丝体用甲醇进行提取分离，在采用凝胶树脂方法进行精制分离，获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中阿维拉霉素的浓度。单位体积发酵液中阿维拉霉素为2004.39mg/l。
所述的发酵培养基的配比为可溶性淀粉2.0％、豆粕粉2.0％、大豆蛋白胨0.5％、D-木糖0.72％、L-缬氨酸0.23％、CaCO3 0.05％、MgSO4 0.05％、MnCl2 0.05％、水余量。
实施例5：
将链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318接种于淀粉1％、酵母浸出粉1％、葡萄糖1％、胰蛋白胨0.3％、琼脂1.5％、水余量，pH 7.4的营养培养基上，进行斜面培养，培养温度为37℃，培养时间5天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种针轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取2ml孢子悬液接种到100ml种子培养基中培养3天，该种子培养基含甘露醇3.0％、豆粕粉4.0％、L-缬氨酸3％，水余量，pH 7.4，培养温度为28℃，转速为200rpm。再将100ml种子液接入到装液量为1.5L发酵培养基的5L发酵罐中，28℃，空气以1.5L/min流入，维持溶氧浓度(DO)为20-40％，450rpm搅拌混合。用20％(w/v)NaOH将pH值维持在7.2-7.4，适量补葡萄糖、豆油，当细胞浓度光密度(0.D.)水平达到35时，维持溶氧浓度(DO)为10-16％，连续发酵6天，得到链霉菌Streptomyces sp.GSDX-1318，采用离心分离的方法将菌丝体用甲醇进行提取分离，在采用凝胶树脂方法进行精制分离，获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中阿维拉霉素的浓度。单位体积发酵液中阿维拉霉素为2265.02mg/l。
所述的发酵培养基的配比为可溶性淀粉2.0％、豆粕粉2.0％、大豆蛋白胨0.5％、D-木糖0.72％、L-缬氨酸0.23％、CaCO3 0.05％、MgSO4 0.05％、MnCl2 0.05％、水余量。
以上实施例仅为对本发明的举例说明，可以预见，按照前述发明内容中的营养培养基、种子培养基、发酵培养基及相应的条件，均能制得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素，且单位体积发酵中阿维拉霉素效价达到1194.6～2265.02mg/l。
Claims (4)
1.链霉菌GSDX-1318，分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010028，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.一种发酵法产生寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)、斜面培养：将权利要求1所述的链霉菌GSDX-1318接种于营养培养基上，进行斜面培养；
(2)、对斜面培养而得的孢子进行种子培养，得到种子液；
(3)、发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中培养，得到权利要求1所述的链霉菌GSDX-1318的发酵液，分离后获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
3.如权利要求2所述的一种发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法，其特征在于在进行斜面培养时，营养培养基的重量百分配比为淀粉0.5～1％、酵母浸出粉0.4～1％、葡萄糖0.4～1％、大豆蛋白胨或胰蛋白胨0.3～0.5％、琼脂1.5～2％、水余量，营养培养基的pH＝7.2-7.4，培养温度28-37℃，培养时间3-5天；
在步骤(2)中，用0.9％生理盐水将斜面上培养的孢子制成孢子悬液，并接种到100ml种子培养基中培养，种子培养基的重量百分比为甘露醇1～3.0％、豆粕粉2～4.0％、L-缬氨酸2～3％，水余量，种子培养基的pH＝7.2-7.4，培养温度为28℃，转速为220rpm，培养时间2～3天；
发酵培养基的重量百分配比为可溶性淀粉1～2.0％、豆粕粉1～2.0％、大豆蛋白胨0.3～0.5％、D-木糖0.05～0.78％、L-缬氨酸0.1～0.23％、CaCO30.03～0.05％、MgSO40.03～0.05％、MnCl20.03～0.05％、水余量，发酵培养基的pH＝7.2-7.4，温度控制在28℃，转速在200-450rpm，发酵4-8天。
4.如权利要求2所述的一种发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法，其特征在于在步骤(3)中，用与发酵液等量的甲醇30℃浸泡2h，采用离心法进行提取分离，再采用凝胶树脂方法进行分离，获得寡聚糖类抗生素阿维拉霉素。
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