CN106588440A - 黄瓜连作专用生物有机肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物有机肥料，具体为一种黄瓜连作专用生物有机肥及其制备方法，针对目前设施黄瓜连作障碍以及连作根节线虫病害严重的问题，包括生鸡粪、生牛粪、一次、二次发酵微生物复合菌剂，一次发酵微生物复合菌剂是由侧孢芽孢杆菌、嗜温高温放线菌、丁香苷链霉菌混合而成，二次发酵微生物复合菌剂是由芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌、酵母菌及霉菌混合而成；先进行一次发酵微生物复合菌剂的菌种培养、二次发酵微生物复合菌剂的菌种培养，再按照分批加菌、二次发酵的工艺进行制备。完全满足黄瓜生长需求，可以促进黄瓜生长，防治黄瓜生长各种病害，提高黄瓜果实品质效果，提高黄瓜产量 15％以上，具有明显的改土培肥和增产增质效果。

Description

黄瓜连作专用生物有机肥及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物有机肥料，具体为一种黄瓜连作专用生物有机肥及其制备方法。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus Linn)，葫芦科黄瓜属植物。也称胡瓜、青瓜。果实颜色呈油绿或翠绿，表面有柔软的小刺。一年生蔓生或攀援性草本植物；茎、枝伸长，有棱沟，被白色的糙硬毛。卷须细，不分歧，具白色柔毛。黄瓜有抗肿瘤、抗衰老、降血糖、减肥强体和健脑安神等作用，是主要蔬菜之一，分布世界各地，在我国已有2000多年的栽培历史。目前，黄瓜种植面积迅速扩大，品种更加丰富，并实现了周年生产。我国黄瓜栽培面积已达125.3万公顷，比1980年扩大了近3倍，约占全国蔬菜面积的10%左右，成为世界黄瓜生产第一大国。设施黄瓜种植经济效益高，每亩利润在3～6万元。我国黄瓜种植业建立起了规模化生产区域，许多农村产生了诸多大大小小的黄瓜设施种植专业户，给广大农村和农民带来了良好的经济利益，但也出现了一些问题。由于种植面积扩大，专业户的温室面积有限，轮作倒茬困难，不得不重茬种植，连作地块增多。黄瓜连作2年的地块发病率在15%～31%，，连作2年、3年、4年分别减产10%～15%、20%～25%和40%以上。设施黄瓜生产具有很好的经济效益和社会效益，但由于耕地数量、气候条件的限制及对高产高效的追求，导致多年连续种植，土地难以做到轮作倒茬，连作障碍日益严重，设施内部土壤的理化性状和营养平衡遭致破坏，蔬菜各种生理病害及土传病害大量发生，严重影响蔬菜的产量及品质。连作障碍带来的损失巨大，是黄瓜种植业中存在的最严重问题，也是影响黄瓜高效生产及可持续发展的最大限制因素。

鉴于目前国内外除了轮作、化学药剂处理之外，还没有解决设施黄瓜连作障碍的有效办法。在设施集约化种植黄瓜的情况下，轮作不利于农民的经济收益，化学药剂处理对环境、对产品都有污染，带来的不良后果更加严重。农民迫切希望能够研究出无需轮作、无需使用农药、无公害、安全可靠的办法来。

生物有机肥将功能微生物的优势与有机肥的优势相结合，既能依靠有机肥补充培肥地力，又使得功能微生物有附着的载体，可抑制病原菌的滋生有效防治病害，还能分解化感物质，其具有微生物肥和有机肥的双重优点而克服了它们各自的缺点，因此在生产中具有明显的改土培肥和增产增质效果，是提高农作物产量和品质的理想肥源。但是目前的微生物肥料产品种类繁多，绝大多数产品都存在营养不够全面，配伍不合理等问题，而且没有针对性，因为不同的农作物，对微生物的种类及数量的需求也不同。到目前为止，也未见有专门针对黄瓜的专用生物有机肥。

发明内容

本发明针对目前设施黄瓜连作障碍以及连作根节线虫病害严重的问题，一种黄瓜连作专用生物有机肥及其制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：黄瓜连作专用生物有机肥，包括生鸡粪、生牛粪、一次发酵微生物复合菌剂及二次发酵微生物复合菌剂，其中生鸡粪和生牛粪的重量比为2：1，一次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的2.5～3.5%，二次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的1.5～2.5%；一次发酵微生物复合菌剂是由侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）、嗜温高温放线菌（thermophilic actinomycetes）、丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）按照2:1:2的重量比混合而成；二次发酵微生物复合菌剂是由45%芽孢杆菌和假单胞菌；25%放线菌，5%酵母菌以及25%霉菌混合而成，其中芽孢杆菌是由多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）构成，多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和假单胞菌的重量比为1:2:1:1，放线菌是由丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）以1:1的重量比混合而成，霉菌是由淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus（Thorn.） Samson）、解钾黑曲霉(Aspergillus niger)和聚生木霉（Trichoderma fasciculatum Bissett）以2:1:1的重量比混合而成。

所述的假单胞菌为杉木假单胞菌（Pseudomonas cunninghamiae）,所述的酵母菌为球拟酵母菌(Toruiopsis)。

制备黄瓜连作专用生物有机肥的方法，包括以下步骤：

（1）一次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：侧孢芽孢杆菌、嗜温高温放线菌和丁香苷链霉菌分类培养原种活化、种子液制备采用液体培养基培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品，成品中含活菌数10～20亿/ml；（2）二次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：将芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌、酵母菌、霉菌中的各菌种分类培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品；（3）按照分批加菌、二次发酵的工艺进行制备：首先将生鸡粪、生牛粪按比例混合而成，得到粪混合料，然后在粪混合料中按照比例先加入一次发酵微生物复合菌剂进行堆肥发酵，将肥料堆成下宽3米，高1.5米，上宽1.5米的梯形垛进行发酵，发酵15天，待堆肥温度降至40℃，按比例加入二次发酵微生物复合菌剂再次进行发酵，保持温度<40℃，发酵6天，待含菌量>10亿/g，摊晾降温，发酵结束，制成黄瓜专用生物有机肥。

所述二次发酵微生物复合菌剂制备时采用以下方法：

芽孢杆菌与假单胞菌的培养：均采用液体培养基分开培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为杉木假单胞菌、多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌的成品混合菌液，含活菌数10～20亿/ml；放线菌培养：丁香苷链霉菌和金素链霉菌分别采用液体培养基分开培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为丁香苷链霉菌和金素链霉菌的成品混合菌液，含活菌数4～6亿/ml；球拟酵母菌的培养：采用液体培养基培养，通过一级培养、二级培养和三级培养制备球拟酵母菌的种子液，含活菌数4～6亿/ml；霉菌的培养：淡紫拟青霉、解钾黑曲霉和聚生木霉分别采用液体+固体培养基培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为淡紫拟青霉、解钾黑曲霉和聚生木霉的种子液，含活菌数4～6亿/ml。

本发明所述的所有菌种均可从市场购得，其规格符合国家行业标准，上述各菌种在所制得的黄瓜专用生物有机肥中的作用机理：

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）它们都属于芽孢杆菌，为革兰氏阳性菌。这类细菌广泛存在于土壤中。它们特性相近，代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。生命力强，无湿状态可耐低温－60℃以下、耐高温+200℃以上，耐强酸、耐强碱、耐高氧，也耐低氧，可嗜氧繁殖，也可厌氧繁殖。其体积一般较大，比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。它们是异养性细菌，通常是靠有机质生存；

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）：属于类芽孢杆菌属，细胞呈杆状，以周生鞭毛运动。对瓜类枯萎病、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂都有防治效果。它还具有极强的解磷解钾作用，能够将植物难以吸收利用的磷、钾转化为可吸收利用的形态；

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）：属于芽孢杆菌属，无荚膜，周生鞭毛，能运动。菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或条件致病菌有明显的抑制作用。可产生丰富的代谢生成物：合成多种有机酸、酶、生理活性等物质及其它多种容易被利用的养分。可利用作物的残根败叶和施入土壤中的有机肥料，腐烂分解，释放出营养元素，供作物利用，并形成腐殖质，改善土壤的结构和肥力；

侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）：属于芽孢杆菌属，芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚(独木舟形)，最高生长温度50-55℃。它能分泌大量几丁质酶，抑制真菌类病害。其特异分泌的表面活性素等杆菌肽类物质能够造成线虫卵的细胞膜破裂，有防治线虫的作用；

杉木假单胞菌（Pseudomonas cunninghamiae）：属于革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水、植物、动物活动环境中。具有良好的促根生长效果，并可预防和抑制黄瓜、番茄、茄子、辣椒、烟草等作物的枯萎病、青枯病、姜瘟病等土传病害的发生，且具有促进种子萌发、提高发芽势和出苗率等功能特点；

嗜温高温放线菌（Thermoactinnomyces thalpophilus）、丁香苷链霉菌（Streptomycessyringini）、金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）都属于放线菌一类细菌，它们共同的特点是都存在于土壤中，特别是在有机质丰富的土壤中菌落数量多。在土壤中这一类细菌是以需氧性异养状态生活，它们的活性与不同的土壤温度、湿度、通气性和pH值有关，他们的优势作用只有在条件适宜的情况下才能显现。它们的主要活动是分解土壤中的纤维素、木质素、果胶类物质、酚类物质等，通过这些作用来改善土壤的养分状况，便于作物直接吸收利用土壤养分。在酸性的土壤中，以霉菌的活动为主，而在中性和微碱性的土壤中，则是以放线菌的活动为主。这些菌类在自我代谢的过程中能够分泌抗生素，所以也称它们为抗生性微生物。它们能够抑制病原菌的繁殖，防治土传病原菌对作物的危害。使用这类微生物一是降解根系化感物质；二是分解有机质肥料，还原和改善土壤理化性质及肥力；三是抑制土传病害；

嗜温高温放线菌（Thermoactinnomyces thalpophilus）属于高温放线菌属，在气丝和基丝上都有单个孢子形成。泛温嗜热：50—60℃生长好；45℃生长少；65℃以上不生长。常见于自然界的高温场所，如堆肥、草料、甘蔗渣等；

丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）属于链霉菌科链霉菌属细菌。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。营养菌丝又名基内菌丝，色浅，较细，具有吸收营养和排泄代谢废物的功能；气生菌丝是颜色较深，直径较粗的分枝菌丝；气生菌丝成熟分化成孢子丝，孢子丝再形成分生孢子。该菌在代谢过程中生成多种多元醇（季戊四醇、山梨醇等），能有效转化如阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸等化感物质；

金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）它属于链霉菌的一种，因能产生金霉素(chlortetracy-cline,即CTC)而得名。金霉素(CTC)是属于四环素类的一种广谱抗生素,在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途,尤其在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大抗生素产品之一；

球拟酵母(Toruiopsis) 属隐球酵母科，细胞为球形、卵形或略长形，生殖方式为芽殖。无假菌丝，无色素，有酒精发酵能力。像细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极少的环境中生长，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。在低于水的冰点或者高于47℃的温度下，酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20～30℃。酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生长较快。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。由于酵母菌体积大、生长快，常将其用于分解土壤有机质中的淀粉和糖类物质。该菌株能产生甘油等多元醇，在适宜条件下能将40%的糖转化为多元醇，可降解利用水杨酸、对羟基苯甲酸、儿茶酚等酚酸类物质；

淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson）属于丝孢菌科拟青霉属内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。该属主要特征是分生孢子梗呈瓶状或近球形(瓶梗),在菌丝端或短枝上轮生,分生孢子单孢链状,至今该属报道有近50个种,皆为昆虫病原菌和线虫病原菌。此菌广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点，特别在控制植物病原线虫方面功效卓著；

解钾黑曲霉L(Aspergillus niger)：黑曲霉是真菌界丛梗孢科黑曲霉属中的一个常见种。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能。在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。在高温、高湿环境下，黑曲霉容易大量生长繁殖产酶生热。解磷黑曲霉和解钾黑曲霉是从土壤中分离得到的具有较强解磷、解钾功能的菌株，能够将植物难以吸收利用的磷、钾转化为可吸收利用的形态，它们广泛分布于土壤中；

聚生木霉（Trichoderma fasciculatumBissett）属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。它分泌纤维素酶、几丁质酶降解细胞壁既能降解纤维素也抑制真菌，竞争性抑制主要是夺取或阻断病原菌所需的养分，适应性很强，孢子在PDA培养基平板上24℃时萌发，菌落迅速扩展。

此外，本发明优选生鸡粪和生牛粪作为有机肥，因为鸡粪中含有大量的有机氮、钾、钙等营养物质，所有的粪肥中，鸡粪的养分含量最高、肥效最长；牛粪也被称作为“秸秆肥”，施入土壤后，能起到疏松改良土壤，增加有机质，提高地温，促根壮苗壮秧，减少沤根死苗等多种有益黄瓜生长的作用。

本发明针对黄瓜种植土地难以做到轮作倒茬，连作障碍日益严重，设施内部土壤的理化性状和营养平衡遭致破坏以及黄瓜出现各种生理病害及土传病害大量发生等问题，经过大量实验优选出多种有益微生物作为生物有机肥的复合发酵菌剂，充分发挥各种菌种自身的功能，例如在菌剂中针对性的添加了侧孢芽孢杆菌和淡紫拟青霉等对杀灭线虫有特效的功能微生物，嗜温高温放线菌、丁香苷链霉菌、金霉素链霉菌可降解根系化感物质、分解有机质肥料、原和改善土壤理化性质及肥力以及抑制土传病害，杉木假单胞菌具有促进种子萌发、提高发芽势和出苗率等功能，更重要的是本发明采用分批加菌、二次发酵的工艺，经过实验验证，尤其是经添加混合菌剂二次发酵的生物有机肥在总菌量上远超自然腐熟有机肥，并且在菌群区系结构上体现出巨大差异，二次发酵过程中添加的有益功能微生物大量繁殖，处于绝对优势地位，为下一步赋予土壤新的微生物群落结构打下坚实基础。

与现有技术相比，本发明制得的生物有机肥完全满足黄瓜生长需求，可以促进黄瓜生长，防治黄瓜生长各种病害，提高黄瓜果实品质效果，提高黄瓜产量 15％以上，具有明显的改土培肥和增产增质效果，是提高黄瓜产量和品质的理想肥源。

附图说明

图1为生物有机肥发酵期间温度变化曲线图；

图2为生物有机肥发酵过程中微生物总数量的变化；

图3为生物有机肥与自然腐熟有机肥的细菌类群PCA分析图；

图4为生物有机肥与自然腐熟有机肥的真菌类群PCA分析图；

图5为生物有机肥与自然腐熟有机肥的细菌类群在属水平的物种组成和相对丰度分布表；

图6为生物有机肥与自然腐熟有机肥的真菌类群在属水平的物种组成和相对丰度分布表。

具体实施方式

黄瓜连作专用生物有机肥，包括生鸡粪、生牛粪、一次发酵微生物复合菌剂及二次发酵微生物复合菌剂，其中生鸡粪和生牛粪的重量比为2：1，一次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的2.5～3.5%，二次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的1.5～2.5%；一次发酵微生物复合菌剂是由侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）、嗜温高温放线菌（thermophilic actinomycetes）、丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）按照2:1:2的重量比混合而成；

二次发酵微生物复合菌剂：各菌种比例见表1，二次发酵微生物复合菌剂组成：

制备黄瓜专用生物有机肥的方法，包括以下步骤：

（1）一次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：侧孢芽孢杆菌、嗜温高温放线菌和丁香苷链霉菌分类培养原种活化、种子液制备采用液体培养基培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品；

侧孢芽孢杆菌种子液培养基：蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L, Nacl 5g/L, pH 7.2。

培养方法如下：

一级培养：将冻存菌种活化后于试管中培养，培养温度37℃，转速100~150 rpm；

二级培养：按1~5%的接种量将一级种子液接入500ml的三角瓶在摇床上培养，培养条件同一级培养。

三级混合培养条件同一级培养，含活菌数10～20亿/mL。

嗜温高温放线菌和丁香苷链霉菌种子液培养基：可溶性淀粉20g/L,KNO3 1g/L,NaCl 0.5g/L, K₂HPO₄ 0.5g/L, MgSO₄ 0.5g/L, FeSO₄ 0.01g/L, pH 7.2。

培养方法如下：

菌种活化→一级种子摇床培养→二级种子培养→三级扩大培养

各级种子制备条件为嗜温高温放线菌温度45℃、丁香苷链霉菌温度30℃，转速100～150 rpm。

最后将侧孢芽孢杆菌、嗜温高温放线菌和丁香苷链霉菌按比例混合成品。

（2）二次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：将芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌、酵母菌、霉菌中的各菌种分类培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品；

a．芽孢杆菌与假单胞菌的培养：均采用液体培养基分开培养。

种子液培养基：蛋白胨10g/l,酵母粉10g/l, Nacl 5g/l, pH 7.2。

培养方法如下：

一级培养：将冻存菌种活化后于试管中培养，培养温度37℃，转速100~150 rpm；

二和三级培养：按1~5%的接种量将一级种子液接入500ml的三角瓶在摇床上培养，培养条件同一级培养。

最后按比例混合后即为杉木假单胞菌、多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌的成品混合菌液，含活菌数10～20亿/ml。

b．放线菌培养：丁香苷链霉菌和金素链霉菌同属放线菌一类，采用液体培养基培养，各菌种培养单独进行，最后混合成品。

种子液培养基：可溶性淀粉20g/L,KNO₃ 1g/l, NaCl 0.5g/l, K₂HPO₄ 0.5g/l,MgSO₄ 0.5g/l, FeSO₄ 0.01g/l, pH 7.2。

培养方法如下：

菌种活化→一级种子摇床培养→二级种子培养→三级扩大培养

各级种子制备条件为温度30℃，转速100～150 rpm。

成品是丁香苷链霉菌和金素链霉菌的混合菌液，含活菌数4～6亿/ml左右。

c. 球拟酵母菌的培养：

种子液培养基：葡萄糖0.2g/l, KCl 0.36g/l, 酵母浸膏0.5g/l, NaAc 1.84g/l, pH自然。

培养方法如下：菌种活化→一级种子摇床培养→二级种子培养→三级扩大培养

各级种子液培养条件均为温度25℃，转速100～150 rpm，培养2～3天，含活菌数4～6亿/mL左右。

d.霉菌的培养：淡紫拟青霉、解钾黑曲霉和聚生木霉同属于霉菌类微生物，采用液体+固体培养基培养。

液体培养基：NaNO₃ 5g/l, K₂HPO₄ 1g/l, KCl 0.5g/l, MgSO₄ 0.5g/l,FeSO₄0.01g/l, 蔗糖30g/l。

培养方法：将保存的菌种活化后，接于500mL三角瓶中，28℃，100～150 rpm摇瓶培养制备一级种子液。将一级种子液接入麸皮培养基中，28℃暗培养至产孢制备二级种子。最后将各单菌的二级种子混合接入以玉米、秸秆、麸皮、蘑菇菌棒等为原料的天然农产品培养基上扩大培养，发酵完成后含活菌数4～6亿/g。

使用时按上述四级培养好的成品芽孢杆菌、假单胞菌类45%，放线菌类25%，酵母菌类5%，霉菌类25%的比例混合。

（3）按照分批加菌、二次发酵的工艺进行制备：首先将生鸡粪，生牛粪按比例混合而成，得到粪混合料，然后在粪混合料中按照比例先加入一次发酵微生物复合菌剂进行堆肥发酵，将肥料堆成下宽3米，高1.5米，上宽1.5米的梯形垛进行发酵，发酵15天，待堆肥温度降至40℃，按比例加入二次发酵微生物复合菌剂再次进行发酵，保持温度<40℃，发酵6天，待含菌量>10亿/g，摊晾降温，发酵结束，制成黄瓜专用生物有机肥。

试验例1

（1）粪混合料中加入一次发酵复合菌剂进行堆肥发酵（3%），将肥料堆成下宽3米，高1.5米，上宽1.5米的梯形垛进行发酵；发酵15天，待堆肥温度降至40℃左右，加入二次发酵复合菌剂再次进行发酵（2%），保持温度<40℃，发酵6天，待含菌量>10亿/g，摊晾降温发酵结束。

（2）发酵期间，每天检测发酵温度，采取肥料样品随机多点采样（>5），采用稀释平板计数方法进行微生物总数量分析。同时将同等质量的粪混合料堆成相同垛型自然发酵（3个月）。发酵结束后，采取肥料样品与自然发酵样品，随机多点采样（3个样混合作为1个重复，取3个重复），一部分样品采用稀释平板计数方法进行微生物总数量分析，另一部分提取总DNA进行微生物多样性高通量测序分析。

基因组DNA的提取

利用细菌和真菌基因组DNA提取试剂盒对样本的基因组DNA进行提取，之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。

PCR扩增

稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer。使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R；ITS1区引物为ITS1F- ITS2；ITS2区引物为：ITS2-3F-- ITS2-4R。

PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Thermo Scientific公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。

文库构建和上机测序

使用New England Biolabs公司的NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit forIllumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用MiSeq进行上机测序。

数据信息分析

测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。然后基于有效数据进行OTUs( Operational Taxonomic Units )聚类，再进行样品间聚类和各个样品内的物种分类分析。

（3）发酵指标检测：

a) 发酵过程中的温度监测

由图1可以看出，加入一次发酵微生物复合菌剂开始堆垛发酵后，混合料升温迅速，在第6天达到70℃，维持70℃以上的垛温4天后，第10天开始温度下降，待温度降到40℃左右时一次发酵结束；于第15天加入二次发酵微生物复合菌剂翻垛混匀进入二次发酵阶段，本阶段以大量繁殖有益菌群为目的，所以将温度控制在40℃以下，发酵6天，待总菌量>10亿/g后摊晾降温发酵结束，共发酵21天。

b) 发酵过程中微生物总数量的变化

由图2可以看出，发酵过程中微生物总数量经历了“上升—下降—平稳—再上升”四个阶段。接入一次发酵微生物复合菌剂后混合料中的微生物数量迅速上升在第3天达到第一个峰值（3.7×10⁸个/g），随着发酵的继续垛温迅速上升；超过50℃后微生物数量骤降，当温度达到65℃以上微生物总量下降5个数量级，此后微生物总量不随温度变化一直保持在10³个/g的水平，可以说混合料中绝大部分的微生物被高温杀死，而只占极小比重且多处于休眠状态中的微生物群体才能存活下来，一次发酵阶段的高温可有效腐熟有机物，杀灭混合料中的杂菌、虫卵和草籽。当温度回落到40℃左右接入二次发酵微生物复合菌剂后进入二次发酵阶段，混合料中的微生物一直处于适宜的温度下其总量开始直线上升，发酵结束后达到1.98×10⁹个/g。二次发酵使得加入的有益菌群大量繁殖，数量提升2个数量级。3个月后，检测了自然腐熟的粪混合料中的微生物总量（8.58×10⁶个/g），其数量远远小于经二次发酵的生物有机肥。

c) 生物有机肥与自然腐熟有机肥在微生物多样性上的比较

由图3、4可知，利用PCA分析生物有机肥与自然腐熟有机肥的细菌类群和真菌类群都明显的分为两类，且都是生物有机肥的3个重复与自然腐熟有机肥的3个重复各自划为一组。说明生物有机肥中的菌群结构与自然腐熟有机肥的菌群结构存在明显的差异。

进而利用QIIME软件，本发明对生物有机肥与自然腐熟有机肥各样品内的物种分类和相对丰度进行了分析。生物有机肥与自然腐熟有机肥的细菌类群与真菌类群在属水平差异显著（图5、6，相对丰度>1%的属），细菌类群中我们添加功能微生物的芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）在生物有机肥中分别占42.28%、16.28%、5.21%和18.16%，占总菌量的80.93%；而在自然腐熟有机肥中分别占3.37%、0.89%、1.07%和0.54%，仅占总菌量的5.78%。真菌类群中，有益功能菌所在的曲霉属（Aspergillus）、拟青霉属（Paecilomyce）、球拟酵母属（Toruiopsis）和木霉属（Trichoderma）在生物有机肥中分别占26.71%、18.29%、13.48%和12.63%，占总菌量的71.11%；而在自然腐熟有机肥中分别占2.38%、1.02%、0.09%和1.88%，仅占总菌量的5.37%。

经添加混合菌剂二次发酵的生物有机肥在总菌量上远超自然腐熟有机肥，并且在菌群区系结构上体现出巨大差异，二次发酵过程中添加的有益功能微生物大量繁殖，处于绝对优势地位，为下一步赋予土壤新的微生物群落结构打下坚实基础。

试验例2

本发明所制备的黄瓜连作专用生物有机肥对黄瓜的温室大棚抗病实验

2014年，以黄瓜品种‘中农26号’为试材，在山西省运城市盐湖区一座大棚内分两个小区进行实验。该大棚已连续6年栽种黄瓜，重茬病发病率较高。一个小区为处理，使用本发明所制备的黄瓜连作专用生物有机肥；另一个小区为对照，使用市售的复合肥，其它管理方式均相同。考虑病原微生物能随空气传播，可能会造成不同小区间相互干扰，所以在两个小区间设高挡板分隔，温室两头留有保护区域。小区内黄瓜行距40cm，株距30cm，每个小区种植200株。结果期统计各种重茬病害的发病率。

由表2可知，黄瓜连作在当地主要是线虫病和灰霉病，施用黄瓜连作专用生物有机肥后两种病害都得到有效控制，发病率锐减。

表2黄瓜各种重茬病调查表

试验例3

本发明所制备的黄瓜连作专用生物有机肥对黄瓜的温室大棚实验

2015年，以黄瓜品种‘津优35号’为试材，在山西省曲沃县一座大棚内分两个小区进行实验。该大棚已连续5年栽种黄瓜，重茬病发病率较高。一个小区为处理，使用本发明所制备的黄瓜连作专用生物有机肥；另一个小区为对照，使用市售的复合肥，其它管理方式均相同。考虑病原微生物能随空气传播，可能会造成不同小区间相互干扰，所以在两个小区间设高挡板分隔，温室两头留有保护区域。小区内黄瓜行距40cm，株距30cm，每个小区种植200株。结果期统计各种重茬病害的发病率；随机取20株黄瓜调查其它指标。

调查指标：

结果期调查不同处理黄瓜各种重茬病的发病率

结果期调查不同处理黄瓜植株系统抗性酶活性

结果期调查不同处理黄瓜果实品质差异

结果期调查不同处理黄瓜产量构成因子及产量的差异

1、结果期调查不同处理黄瓜各种重茬病的发病率

由表3可知，黄瓜连作在当地主要是枯萎病、白粉病和灰霉病，施用黄瓜连作专用生物有机肥后三种病害都得到有效控制，发病率锐减。

表3黄瓜各种重茬病调查表

注：在同一列中，不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。下同。

2、结果期调查不同处理黄瓜植株系统抗性酶活性

抗氧化保护酶（SOD、POD和CAT）是清除植株体内自由基关键酶，酶活力增强可清除植株体内因受胁迫而产生的氧自由基，提高植株系统抗性，施用黄瓜连作专用生物有机肥与对照相比SOD、POD和CAT活性均有提高，差异显著。

表4黄瓜系统抗性酶活调查表

3、结果期调查不同处理黄瓜果实品质差异

由表5可知，施用黄瓜连作专用生物有机肥后，除可溶性固形物外，其它指标均高于对照组且差异显著，提高黄瓜果实品质效果显著。

表5黄瓜果实品质调查表

4、结果期调查不同处理黄瓜产量构成因子及产量的差异

由表6可知，施用黄瓜连作专用生物有机肥后，果实纵径、横径和单瓜重明显提升，换算亩产后比对照组增产661.97公斤，促生效果显著。

表6黄瓜产量构成因子及产量调查表

Claims (5)

1.一种黄瓜连作专用生物有机肥，其特征是包括生鸡粪、生牛粪、一次发酵微生物复合菌剂及二次发酵微生物复合菌剂，其中生鸡粪和生牛粪的重量比为2：1，一次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的2.5～3.5%，二次发酵微生物复合菌剂的加量为生鸡粪和生牛粪总重量的1.5～2.5%；一次发酵微生物复合菌剂是由侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）、嗜温高温放线菌（thermophilic actinomycetes）、丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）按照2:1:2的重量比混合而成；二次发酵微生物复合菌剂是由45%芽孢杆菌和假单胞菌；25%放线菌，5%酵母菌以及25%霉菌混合而成，其中芽孢杆菌是由多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）构成，多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和假单胞菌的重量比为1:2:1:1，放线菌是由丁香苷链霉菌（Streptomyces syringini）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）以1:1的重量比混合而成，霉菌是由淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson）、解钾黑曲霉(Aspergillus niger)和聚生木霉（Trichoderma fasciculatum Bissett）以2:1:1的重量比混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种黄瓜连作专用生物有机肥，其特征是所述的假单胞菌为杉木假单胞菌（Pseudomonas cunninghamiae）。

3.根据权利要求1所述的一种黄瓜连作专用生物有机肥，其特征是所述的酵母菌为球拟酵母菌(Toruiopsis)。

4.制备如权利要求1或2或3所述的黄瓜连作专用生物有机肥的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）一次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：侧孢芽孢杆菌、嗜温高温放线菌和丁香苷链霉菌分类培养原种活化、种子液制备采用液体培养基培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品，成品中含活菌数10～20亿/ml；

（2）二次发酵微生物复合菌剂的菌种培养：将芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌、酵母菌、霉菌中的各菌种分类培养，先通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，然后按比例混合成成品；

（3）按照分批加菌、二次发酵的工艺进行制备：

首先将生鸡粪、生牛粪按比例混合而成，得到粪混合料，然后在粪混合料中按照比例先加入一次发酵微生物复合菌剂进行堆肥发酵，将肥料堆成下宽3米，高1.5米，上宽1.5米的梯形垛进行发酵，发酵15天，待堆肥温度降至40℃，按比例加入二次发酵微生物复合菌剂再次进行发酵，保持温度<40℃，发酵6天，待含菌量>10亿/g，摊晾降温，发酵结束，制成黄瓜专用生物有机肥。

5.根据权利要求4所述的一种制备黄瓜连作专用生物有机肥的方法，其特征是二次发酵微生物复合菌剂制备时采用以下方法：

芽孢杆菌与假单胞菌的培养：均采用液体培养基分开培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为杉木假单胞菌、多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌的成品混合菌液，含活菌数10～20亿/ml；

放线菌培养：丁香苷链霉菌和金素链霉菌分别采用液体培养基分开培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为丁香苷链霉菌和金素链霉菌的成品混合菌液，含活菌数4～6亿/ml；

球拟酵母菌的培养：采用液体培养基培养，通过一级培养、二级培养和三级培养制备球拟酵母菌的种子液，含活菌数4～6亿/ml；

霉菌的培养：淡紫拟青霉、解钾黑曲霉和聚生木霉分别采用液体+固体培养基培养，通过一级培养、二级培养和三级培养单独制备各菌种的种子液，最后按比例混合后即为淡紫拟青霉、解钾黑曲霉和聚生木霉的种子液，含活菌数4～6亿/g。