CN110655925B - 解淀粉芽孢杆菌tf28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌tf28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用，涉及微生物技术领域，利用解淀粉芽孢杆菌TF28能够显著提高连作黄瓜根际土壤的土壤酶活性、微生物数量、调节菌群结果和丰富。可以改善棚室连作土壤质量和环境的菌株和方法，从而更有利于设施农业健康发展，从而实现设施蔬菜生产能力的持续稳定健康发展。

Description

解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用。
背景技术
黄瓜作为设施蔬菜主要品种，近年来其连作障碍的发生机制及其防治措施受到学者们较广泛的关注，己有的研究表明，土壤微生物区系失衡是黄瓜连作障碍发生的主要原因之一，并且认为施用有机肥及微生物肥料可有效改善土壤微生物生态，能有效解除作物连作障碍(吕雅悠，于迪，丁方丽,等.促植物生长根际细菌A21-4对田间辣椒生长及根迹土壤微生态环境的影响[J].中国生物防治学报,2016,32(1):86-92.)。吴凤芝等研究了土壤灭菌改善连作土壤对黄瓜生长发育的抑制作用，结果显示，土壤灭菌主要是改良了土壤的微生物环境，但灭菌后的黄瓜的生长发育却得到了显著改善，表明大棚黄光连作障碍的主要因素是来自前茬的土壤生物缓解(吴凤芝,王伟,栾非时.土壤灭菌对大棚连作黄瓜生长发育影响[J].北方园艺,1999(5):49-49.)。
解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens在自然界中分布广泛，是一类重要的生防资源菌，具有较高开发价值的农用微生物，在植物病害生物防治方面具有广阔的应用前景(车晓曦,李校堃.解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的研究进展[J].北京农业,2010(3):11-14.)。内生解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens TF28是从大豆根部分离出的一株内生细菌，具有广谱抗菌活性(张淑梅,沙长青,王玉霞,等.大豆内生细菌的分离及根腐病拮抗菌的筛选鉴定(英文)[J].微生物学通报,2008(10):1593-1599)，前期研究发现对番茄具有抗病作用，并对生长具有调控作用，同时提高果实品质(张淑梅,李晶,姜威,等.内生细菌TF28诱导番茄抗病分子机制研究[J].中国生物防治学报,2015,31(3):913-920)。可见，解淀粉芽孢杆菌TF28主要是作为一种植物内生菌，发挥其抗病菌作用。
发明内容
本发明为了解决黄瓜连作障碍，提供了解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用，解淀粉芽孢杆菌TF28能够显著提高连作黄瓜根际土壤的土壤酶活性、微生物数量、调节菌群结果和丰富。可以改善棚室连作土壤质量和环境的菌株和方法，从而更有利于设施农业健康发展，从而实现设施蔬菜生产能力的持续稳定健康发展。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用。
优选的，所述调节连作黄瓜根际土壤环境包括改善连作黄瓜根际土壤pH值、调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度和调节连作黄瓜根际土壤酶的活性。
优选的，所述调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度包括增加微生物数量和提高根际土壤微生物多样性。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌TF28以菌悬液和颗粒剂中的一种或两种施用至连作黄瓜根际土壤中。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液中，有效活菌数在108cfu/ml以上。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂中，有效活菌数在2～3亿个/g。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂的制备方法包括以下步骤：
将解淀粉芽孢杆菌TF28制成有效活菌数108cfu/ml以上的菌悬液，将菌悬液喷涂在颗粒载体上，干燥，得到有效活菌数2～3亿个/g的颗粒剂。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液施用时，按照4～10ml/株浇灌于黄瓜苗根部土壤中；所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂施用时，先按照3～10g/株施入待移栽黄瓜苗的土壤中，再移栽黄瓜苗。
优选的，当所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液和颗粒剂联用时，先按照3～10g/株施入待移栽黄瓜苗的土壤中，再移栽黄瓜苗，移栽后按照4～10ml/株浇灌于黄瓜苗根部土壤中。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、如本发明具体实施方式所示，将解淀粉芽孢杆菌TF28施入连作黄瓜的根际土壤后，连作黄瓜的苗期株高和根须数量有显著提高，说明本发明所述应用可以通过调节根际土壤环境缓解黄瓜的连作障碍。
2、如本发明具体实施方式所示，将解淀粉芽孢杆菌TF28施入连作黄瓜的根际土壤后，可有效提高土壤pH值，改善根际土壤环境。
在本发明的优选技术方案，将解淀粉芽孢杆菌TF28以菌悬液的方式施用对土壤pH值的提高更为显著。
3、如本发明具体实施方式所示，将解淀粉芽孢杆菌TF28施入连作黄瓜的根部土壤后，根际土壤中的碱性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶的活力均有显著提高。土壤酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，酶活性的高低反映土壤物质能量代谢强度。设施蔬菜连作会导致土壤酶活性降低、微生物群落结构单一化、有害微生物数量增多。土壤磷酸酶的活性可以评价土壤磷素状况，磷酸酶酶促作用能加快土壤有机磷的脱磷速度，土壤磷酸酶活性与作物的生育期和土壤水分、土壤温度、土壤pH等多方面因素有关，因而解淀粉芽孢杆菌TF28通过增加土壤磷酸酶的活性可以改善作物生长环境，有利于作物生长期生长。脲酶是催化尿素水解的唯一酶，可以将酰胺态有机氮化物水解转化为植物可直接利用的无机氮的酶，脲酶活性的高低可以反映出土壤供氮水平和能力，解淀粉芽孢杆菌TF28通过提高脲酶活性可以改善棚室连作土壤供氮水平。土壤过氧化氢酶活性能够反映土壤中碳、氮物质的转化状况已有的研究中生物炭的添加也对设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物也具有调节作用。解淀粉芽孢杆菌TF28通过提高过氧化氢酶活性，对碳、氮转化具有促进作用。几种酶活在酶活力增强的时间上有先后顺序，依次为酸性磷酸酶、脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶。
4、如本发明提供的具体实施方式所示，本发明将解淀粉芽孢杆菌TF28应用于连作黄瓜根系土壤后，根系土壤的微生物数量有显著改变，细菌和放线菌的数量增加，真菌数量降低，有利于连作土壤中的植物生长发育，可以一直犹豫连作引起的由“细菌型”向“真菌型”转变。
5、本发明利用高通量测序对解淀粉芽孢杆菌TF28施入连作黄瓜根系土壤后的细菌多样性和菌群组成，结果显示，解淀粉芽孢杆菌TF28对厚壁菌门芽孢杆菌属具有调节作用，通过调节芽孢杆菌数量抑制尖孢镰刀菌，表明解淀粉芽孢杆菌TF28可以降低黄瓜枯萎病的发病率。菌群代谢功能上明显优于空白对照组；解淀粉芽孢杆菌TF28还可有效提高土壤微生物的丰度值。
在本发明的一些优选实施方案中，解淀粉芽孢杆菌TF28以颗粒剂形式施入后，可在门水平和属水平上显著提高根际土壤微生物的丰度，显示出对棚室连坐土壤具有良好的改良作用。
附图说明
图1为TF28对黄瓜连作土壤pH值的调节作用，L：菌悬液处理；LP：复合处理(液体+颗粒)；P：颗粒处理；
图2为TF28对棚室连作黄瓜土壤酶活性调节作用图；其中，图A为试验天数与碱性磷酸酶活性的折线图，图B为试验天数与酸性磷酸酶活性的折线图，图C为试验天数与脲酶活性的折线图，图D为试验天数与过氧化氢酶活性的折线图；
图3为使用QIIME软件对ITS序列归并的结果图；
图4为不同时间段24个样本门水平组成和丰度分布图；对丰度在前20个绘制柱形图，横坐标依据样本名排列，每一个柱形图代表一个样本，并以颜色区分各分类单元，纵坐标代表各分类单元的相对丰度，柱子越长，该分类单元在对应样本中的相对丰度越高；其中，L：菌悬液处理；P：颗粒处理；LP：复合处理(液体加颗粒)；CK：空白对照；
图5为属水平上的、具有差异显著性的前20个分类单元小提琴图，图中横坐标为分类单元名称，纵坐标为各分类单元在各样本(组)内的序列量；其中，Acetobacteraceaebacterium：醋酸杆菌科-WX59，Frateuria：弗拉特氏菌属，Georgenia：乔治菌属，Microvirga：微枝形杆菌属，Rhodoplanes：红游动菌属；
图6为基于Krona的分类学组成信息交互展示图；
图7为菌群代谢功能预测图；其中，A为共有功能类群的Venn图，B为结合聚类分析的KEGG直系同源基因簇(KO)丰度热图。
具体实施方式
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用。在本发明中，所述调节连作黄瓜根际土壤环境优选的包括改善连作黄瓜根际土壤pH值、调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度和调节连作黄瓜根际土壤酶的活性。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28为已知菌种，2010年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.4038。
在本发明中，所述调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度包括增加微生物数量和提高根际土壤微生物多样性。
在本发明中，所述调节连作黄瓜根际土壤酶的活性具体的包括调节碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28优选的以菌悬液和颗粒剂中的一种或两种施用至连作黄瓜根际土壤中；更优选的，本发明以颗粒剂形式施入连作黄瓜根际土壤对根际土壤环境的调节最优。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液中，有效活菌数优选的在108cfu/ml以上，更优选为108～1010cfu/ml。在本发明中，解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液优选的施用于连作黄瓜苗的根部土壤中；所述菌悬液的施用量优选为4～10ml/株，更优选为5ml/株。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液的制备方法优选的包括以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌TF28接种于细菌培养基中发酵，当发酵液中的TF28有效活菌数达到108cfu/ml以上时，即得解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液。在本发明中，所述细菌培养基优选为细菌NYD培养基。本发明对所述解淀粉芽孢杆菌TF28的发酵条件无特殊限定，能够得到菌悬液即可。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂中，有效活菌数优选的在2～3亿个/g。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂优选的在黄瓜苗移栽前施入待移栽的土壤中；所述颗粒剂的施用量优选为3～10g/株，更优选为4～6g/株。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂的制备方法优选的包括以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌TF28制成有效活菌数108cfu/ml以上的菌悬液，将菌悬液喷涂在颗粒载体上，干燥，得到有效活菌数2～3亿个/g的颗粒剂。在本发明中，所述颗粒载体优选为腐殖酸颗粒。
在本发明中，当所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液和颗粒剂联用时，优选的先按照3～10g/株施入待移栽黄瓜苗的土壤中，再移栽黄瓜苗，移栽后按照4～10ml/株浇灌于黄瓜苗根部土壤中。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本次试验对解淀粉芽孢杆菌TF28以菌悬液(L)、颗粒(P)和菌悬液+颗粒复合(LP)三种处理方法与空白对照(CK)进行对比实验，研究TF28菌株对棚室连作黄瓜的生长发育、土壤菌群和根迹微生态酶活的变化。
1材料和方法
1.1试验设计
实验地点：黑龙江省哈尔滨市太平镇兴业村，2018年2月23日穴盘育苗，4月5日移载到温室大棚中；黄瓜品种为“早熟绿神”，种籽购于哈尔滨全福种业。实验用颗粒为腐殖酸颗粒；细菌NYD培养基(货号：BS1002)；PDA培养基(北京陆桥技术股份有限公司)；放线菌培养基(货号：BS1075)。
菌悬液的制备：利用细菌NYD培养基培养解淀粉芽孢杆菌TF28，将解淀粉芽孢杆菌TF28制成108cfu/ml浓度的菌悬液，置于4℃冰箱待用。
颗粒剂的制备：将菌悬液用喷壶均匀地喷涂在腐殖酸颗粒上，制成2～3亿/g的含菌量颗粒剂，常温保存备用。
施用方法：
(1)菌悬液(L)处理：解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液(108cfu/ml)5ml浇在苗根部；
(2)颗粒(P)剂施肥法，移栽时将颗粒剂(2-3亿/g)每株施肥5g均匀洒在垄沟后，将瓜苗栽上；
(3)复合施用法(菌悬液和颗粒)：瓜苗移栽时，每个苗根部均匀放置5g颗粒剂(2-3亿/g)，将瓜苗栽上后再浇灌5ml菌悬液(108cfu/ml)。
以清水处理为空白对照。
移植第1周和第2周，随机选取健壮的黄瓜，对株高、叶面积(根部起第5片叶测量)、根须数量、主根长度和根部干重等生育指标进行测定，3个重复，每个重复5株；黄瓜果实在移栽第5周测定，共取样3次，每次取一空(1空为72棵黄瓜)的成熟果实，黄瓜移栽至大棚后每周取一次土样，采用五点取样法进行取样，将每个处理5点的土壤样品混合为一个重复，过2mm筛，-80℃冻存备用。
1.2测定方法
叶面积采用叶面积测量仪YMJ-B(浙江托普仪器有限公司)测量；土壤pH值采用FILDSCOUT pH400 Meter 2109仪读取；碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性检测试剂盒Solarbio(货号BC0285)，土壤酸性磷酸酶(S-ACP)试剂盒Solarbio(货号：BC0145)，土壤脲酶(S-UE)活性检测试剂盒Solarbio(货号BC0125)，土壤过氧化氢酶(S-CAT)活性检测试剂盒Solarbio(货号BC0105)。四种三酶活按规程进行操作，脲酶活性测试中37℃水浴锅用37℃恒温培养箱代替。离心机AIGMA3-18K(日本)；紫外分光光度计INESA-UV757CRT(青岛聚创环保设备有限公司)，96孔板Costar 3590，石英比色皿0.35ml Cat No:YA1150(Solarbio北京)。
1.3数据分析
采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析，应用ANOVA单因素(LSD法)进行显著性检验(a＜0.05)。
2结果与分析
2.1 TF28对黄瓜生育指标和土壤理化性质的调节作用
施用TF28菌剂一周后对黄瓜的叶片、根部采用5点取样法进行对比，株高分析结果显示P、L以及LP三种处理与空白对照分别提高了18.78％、17.27％、11.88％；根须数量L和LP两种处理分别高于空白对照35.20％和48.66％；三种处理对叶面积、果实重量、根长和根重影响不明显(表1)。
表1施用TF28对棚室连作黄瓜生育指标影响
Figure GDA0002150013450000081
注：表中数据后不同小写字母表示各处理与对照间在0.05水平差异显著。L：液体处理；LP：复合处理(液体+颗粒)；P：颗粒处理。
三种处理连续8周对土壤pH值的影响结果显示，L处理pH值在7.35～5.12，第1周是最高值，第7周为最低值(图一)；LP处理pH值在6.58～5.85之间，第6周为最高值，第5周为最低值；P处理pH值在6.34～5.23之间，第1周为最高低，第6周为最低值；CK处理pH值较平稳在6.18～5.23之间，第1周为最高值，第5周值最低。
2.2 TF28对连作黄瓜土壤酶活的影响
三种处理对连作黄瓜根际碱性磷酸酶具有调节作用(图2A)。在第3周液体、P和LP都高于CK，其中L处理与CK差异明显，提高了23.11％；第6周L和LP两种处理的呈下降趋势，P处理的呈上升趋势，与CK差异明显，提高35.03％；第7周LP高于CK24.19％，其它两种处理的酶活趋于空白对照。酸性磷酸酶在第2周三种处理酶活提高，L和CK差异明显，提高了14.33％(图2B)；第3周三种处理都高于空白对照，分别提高了41.47％、22.20％和77.43％；第4周三种处理仍高于空白对照，其中L高于CK对照差异明显，提高了17.91％。脲酶活性第4周L处理的高于CK对照差异明显，提高了24.34％(图2C)。过氧化氢酶第3周液体、LP和P三种处理都明显高于空白处理(图2D)，分别提高158.70％、163.24％和138.97％；第6周LP处理高于CK差异明显，提高了86.15％；第7周L处理明显高于CK对照提高了102.36％；第8周三种处理都高于CK处理，差异明显，分别提高了83.21％、91.52％和119.62％。
2.3菌株TF-28对黄瓜根际土壤微生物数量的影响
施用TF-28菌剂的三个处理对棚室连作黄瓜土壤中细菌、真菌和放线菌具有调节作用，提高细菌和放线菌的数量，降低了真菌的数量。移栽后7周L处理的黄瓜根际土壤细菌比对照分别增加了368.35％、279.21％、256.90％、134.54％、263.43％、90.35％、9.95％和-4.51％；放线菌分别增加了125.16％、146.56％、141.14％、123.21％、131.75％、125.79％、69.18％和46.36％；真菌降低了49.32％、94.12％、85.25％、64.86％、76.71％、54.65％、27.55％和43.44％。移栽后7周LP处理对黄瓜根际土壤细菌比对照分别增加了367.57％、378.22％、357.66％、186.91％、254.73％、17.95％、5.30％、-21.83％；放线菌分别增加了52.20％、78.63％、56.96％、125.00％、89.95％、46.69％、64.15％和30.46％；真菌分别降低了31.33％、70.10％、91.53％、190.48％、344.83％、454.17％、237.84和186.89％。P处理样品对黄瓜根际土壤细菌8周数据比对照分别增加了271.07％、355.05％、252.36％、187.22％、237.85％、64.86％、26.32％和-0.58％；放线菌分别增加了159.12％、222.90％、223.42％、215.48％、207.41％、251.57％、45.28％和68.87％；真菌分别降低了105.66％、243.75％、197.37％、542.11％、268.57％、171.43％、32.98％和30.60％。
表2三种处理对黄瓜根际土壤细菌微生物数量的影响
Figure GDA0002150013450000091
注：表中数据后不同小写字母表示各处理与对照间在0.05水平差异显著，L：液体处理；LP：复合处理(液体+颗粒)；P：颗粒处理。
表3三种处理对黄瓜根际土壤放线菌微生物种群的影响
Figure GDA0002150013450000092
注：表中数据后不同小写字母表示各处理与对照间在0.05水平差异显著，L：液体处理；LP：复合处理(液体+颗粒)；P：颗粒处理。
表4三种处理对黄瓜根际土壤真菌微生物种群的影响
Figure GDA0002150013450000101
注：表中数据后不同小写字母表示各处理与对照间在0.05水平差异显著，L：液体处理；LP：复合处理(液体+颗粒)；P：颗粒处理。
3讨论
植物根际是植物与外界环境交流的主要场所，土壤中微生物的含量与生态系统功能的发挥密切相关，是土壤中有机质养分的一种短暂而最有效的贮存形式[10-11]，同时也是土壤肥力水平的活指标[12]。内生细菌具有在植物体内定殖传导，不易受外界环境影响等优点，解淀粉芽孢杆菌TF28是广谱生防菌株，前期研究表明接种TF28后能够提高番茄抗灰霉病能力，番茄叶片防御酶活性以及JA(茉莉酸)SA(水杨酸)含量升高[9]，
本实验对TF28以菌悬液、颗粒剂和复合三种形式施用，可以提高棚室连作黄瓜苗期株高和根须数量，可显著提高设施黄瓜土壤中细菌和放线菌的数量，降低了真菌的数量，其中以颗粒形式施用比其它两种处理效果要好。表明TF28可以改善棚室连作黄瓜土壤质量和环境，对土壤具有调节作用，利于植株生长发育，可以抑制由于连作引起的由“细菌型”向“真菌型”转变。已有研究表明不同作物的根际有其特定的微生物群落，就是同一作物在不同生育时期和营养状态下，其根际微生物数量也呈现一定的动态变化[13]。微生物数量及多样性的增加，但是作用期较短，这与张昕[14]研究两株生防菌对黄瓜根围的环境生态效应结果相似，生防菌株的施入对土壤中细菌的种群数量有短期影响，但随着黄瓜生育期的延长，施入生防细菌土壤的细菌数最终与对照土壤中细菌数持平。其原因可能是土壤本身的微生物生态环境有一定的自我恢复能力,在受到外来因素扰动后，短期内出现激烈的变化,但是随着时间的推移逐步恢复到原有的水平。
土壤酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，酶活性的高低反映土壤物质能量代谢强度。设施蔬菜连作会导致土壤酶活性降低、微生物群落结构单一化、有害微生物数量增多。土壤磷酸酶的活性可以评价土壤磷素状况，磷酸酶酶促作用能加快土壤有机磷的脱磷速度，碱性磷酸酶作为一种适应酶，当植物缺少磷肥时碱性磷酸酶会增加，其活性会随着磷素含量的上升而降低[19]。土壤磷酸酶活性与作物的生育期和土壤水分、土壤温度、土壤pH等多方面因素有关。本研究中三种处理均提高了碱性磷酸酶、酸性磷酸酶。在连续8周所有样品中，除了第1周L处理呈碱性，其它样本都在酸性范围内，酸性磷酸酶L处理在第2周最高值37407.71nmol/d/g，碱性磷酸酶的调节P处理在第6周达到最高值25684.77nmol/d/g，3种处理无论是单个样品还是8周平均数值，酸性磷酸酶作为优势酶作用要大于碱性磷酸酶，在苗期酸性磷酸酶呈先升高再降低的趋势。脲酶是催化尿素水解的唯一酶，可以将酰胺态有机氮化物水解转化为植物可直接利用的无机氮的酶，脲酶活性的高低可以反映出土壤供氮水平和能力。本实验脲酶活性在苗期第3周和第4周L和LP两种处理显示与空白对照的差异性显著，说明TF28可以改善棚室连作土壤供氮水平。土壤过氧化氢酶活性能够反映土壤中碳、氮物质的转化状况，已有的研究中生物炭的添加也对设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物也具有调节作用。实验中L和LP两种处理在第6、7周活性明显，说明TF28对碳、氮转化具有促进作用。几种酶活在时间上有先后顺序，分别是酸性磷酸酶、脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶。几种处理P对碱性磷酸酶、L对酸性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶提高明显。
4结论
解淀粉芽孢杆菌TF28对设施连作黄瓜根际土壤酶活性、微生物含量和pH具有调节作用。三种处理，L和P两种处理效果明显，可以提高苗期植株植高，增加苗期根须数量，提高土壤碱性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶，酸性磷酸酶是主导磷酸酶。施用TF28增加了土壤细菌和放线菌数量，降低了真菌数量。8周连续采样结果显示，无论是菌群数量、pH值、四种酶活，都呈波浪状起伏，说明土壤具有自身的调节能力，TF28可以促进土壤自身恢复调节。
实施例2
内生解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens TF28是从大豆根部分离出的一株内生细菌，具有广谱抗菌活性，实施例1的实验表明，TF28菌株可以改善棚室连作土壤pH值、增加土壤细菌和放线菌数量，降低真菌数量，对酸性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶都有提高作用。
本次实验采用高通量测序技术测定，Illumina MiSeq第二代测序技术检测，分析解淀粉芽孢杆菌TF28对棚室连作黄瓜土壤细菌群落动态丰度变化，为TF28对棚室连作黄瓜土壤健康状况的改善提供理论基础。
1、材料与方法
1.1试验材料
实验地点：黑龙江省哈尔滨市太平镇兴业村，2018年2月23日穴盘育苗，4月5日移载到温室大棚中；黄瓜品种为“早熟绿神”，种籽购于哈尔滨全福种业。实验用颗粒为腐殖酸颗粒；细菌NYD培养基(货号：BS1002)；PDA培养基(北京陆桥技术股份有限公司)；放线菌培养基(货号：BS1075)。
菌悬液的制备：利用细菌NYD培养基培养解淀粉芽孢杆菌TF28，将解淀粉芽孢杆菌TF28制成108cfu/ml浓度的菌悬液，置于4℃冰箱待用。
颗粒剂的制备：将菌悬液用喷壶均匀地喷涂在腐殖酸颗粒上，制成2～3亿/g的含菌量颗粒剂，常温保存备用。
施用方法：
(1)菌悬液(L)处理：解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液(108cfu/ml)5ml浇在苗根部；
(2)颗粒(P)剂施肥法，移栽时将颗粒剂(2-3亿/g)每株施肥5g均匀洒在垄沟后，将瓜苗栽上；
(3)复合施用法(菌悬液和颗粒)：瓜苗移栽时，每个苗根部均匀放置5g颗粒剂(2-3亿/g)，将瓜苗栽上后再浇灌5ml菌悬液(108cfu/ml)。
以清水处理为空白对照。
日光温度南北跨度为50m，东西跨度为7m，黄瓜种植行距50cm，株距35cm。黄瓜移栽至大棚后每周取一次土样，取根迹0-20cm处土壤采用五点取样法进行取样，将每个处理5点的土壤样品均匀混合，过2mm筛，-80℃冻存备用。
1.3测定方法
土壤选用苗期(4月13-19日)、花期(4月27日)、盛果期(5月3-10日)和结果后期(5月30日)共6组样品，送至派森诺生物科技(上海)股份有限公司进行DNA提取和高通量测序。使用PowerSOIL DNA分离试剂盒E.N.Z.A.Soil DNA Kit(omega)提取总基因组DNA，DNA的浓度和质量由纳米滴剂ND-2000C(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Theromo Fisher Scientific)测定。提取的DNA使用通用引物和正向引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，以v3和v4为目标区域进行引物设计。目标片段PCR扩增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，并严格控制扩增循环数，使循环数尽可能低的同时，也保证同一批样本的扩增条件一致。扩增产物回收纯化PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。扩增产物荧光定量参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT LibraryPrep Kit制备测序文库。
1.4数据分析
采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析，应用ANOVA单因素(LSD法)进行显著性检验(a＜0.05)。
2.结果分析
2.1不同处理土壤微生物细菌群落丰度及多样性
3种处理6个时间点的样品共计24个样本，共获得804159条高质量的ITS序列(表1)。使用QIIME软件，调用UCLUST序列比对工具[13 Edgar,2010]，按97％的序列相似度进行归并共产生10398个OUT(图3)。连续六周取样土壤细菌Coverage指数介于0.9098～1.000之间，说明测序数据量合理，测序数据基本涵盖了棚室连作黄瓜土壤中所有的细菌类群，能体现土壤环境中细菌的特征。通过Alpha多样性指数计算，不同指数反应样品中的菌群丰富程度和多样性程度，Simpson指数介于0.996369～0.998619，Shannon指数介于9.85～10.50，第一周LP处理高于L、P和空白，第三周和第四周P处理高于其它处理。Chao1指数介于2192.28～4043.64，第一周L和LP处理高于P和CK，第三周LP高于其它三种处理，第四周P处理高于其它三种处理；ACE指数介于2201.77～4172.24，第一周L和LP两种处理高于P和CK，第三周LP高于L、P和CK，第四周P处理最高，L处理高于P和CK，第五周P大于L、LP和CK。多样性Simpson和Shannon指数第3周P处理均为最高，最低值是在第4周LP处理；丰富度Chao1和ACE指数在第4周P处理最高值，CK最低值。Observed species在第一周LP处理为最高值，第二周L处理高与其它三种处理，第三周LP处理高于其它三个处理，第四周P处理高于其它三个处理，最高值在第一周LP处理，最低值是第四周CK(表1)。综上所述，以P处理的多样性指数和丰富度指数要比其它两种处理效果明显，与空白对照具有明显的差异显著性。
表5连续6周不同处理土壤细菌多样性指数
Figure GDA0002150013450000141
Figure GDA0002150013450000151
注：Simpson和Shannon指数表示菌群多样性，指数值越大，群落多样性越高；Chao1和ACE指数表示菌群丰富程度，指数值越大，丰富程度越高。同列中不同小写字母表示达到每次4个样品差异显著性，大字字母表达24个样品差异显著性(a＜0.05)。
2.2不同处理棚室连作黄瓜土壤细菌群落组成
OTU进行物种注释，共注释到31个门，106个纲，218个目，424科，1008个属和1769个种。门水平比较3种处理6个时间点24个样品的微生物组成，丰度大于1％的有8个(图4)，分别是Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Saccharibacteria(螺旋体菌门)，所占比例分别为43.52％、25.80％、7.19％、7.00％、6.32％、4.38％、1.89％和1.85％，变形菌门为主要优势菌类群。硝化螺旋菌门(Nitrospirae)为P处理独有，浮霉菌门(Planctomycetes)为CK独有。Firmicutes(厚壁菌门)P处理在第一周比CK提高60.48％，其余时间段和处理与空白差异不明显。8个优势种群6个时间段门水平丰度值总量Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)比空白提高58.67％，Acidobacteria(酸杆菌门)提高30.81％。1008个属中，丰度高于1％即高丰度属共有17个，其中4个属于Proteobacteria(变形菌门)，3个属于(放线菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)和Bacteroidetes门(拟杆菌门)，1个分别属于Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Acidobacteria(放线菌门)、Saccharibacteria(螺旋体菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)。
2.3不同处理样本间分类学组成的差异分析
使用Mothur软件通过统计检验评价差异显著性分析，样本(组)之间的丰度差异结果显示，门水平L和CK组间具有差异性的是酸杆菌门(Acidobacteria)，属水平有28个(表6)，LP与CK组间有差异的属为15个；P和CK组间门水平具有差异性的有5个，分别是Chlorobi、Nitrospirae、Acidobacteria、Chloroflexi和Gemmatimonadetes，属水平具有差异性的共有44个(表2)；L和CK属水平具有差异性的有28个(表6)。其中Microvirga(微支杆菌属)为三种处理与CK共有差异属，Acidiphilium为L和LP两个处理共有差异属；Alicycliphilus、Aquicella和Virgisporangium三个为P和LP两个处理所共有差异属；Asanoa、Phytohabitans、Rhodoplanes、Hamadaea、Reyranella和Gaiella为L和P两个处理与CK共有的差异属。属水平具有差异显著性前20个分类单元以小提琴图形式可以直观看出(图5)，三种处理Asanoa和Microvirga两个属与空白差异明显。
表6属水平的各个分类单元在样本(组)之间的序列量两两比较检验
Figure GDA0002150013450000161
Figure GDA0002150013450000171
Figure GDA0002150013450000181
注：每列按P值升序排列(P<0.05)
如图5所示，样本无分组情况下，将以散点图的形式展示；样本有分组的情况下，将以小提琴图结合箱线图的形式展示：其中，小提琴图可以直观地显示数据的分布特征，“小提琴”的“胖瘦”反映了样本数据分布的密度高低(宽度越宽，表明该序列量下对应的样本越多)；箱线图边框代表上下四分位数间距(Interquartile range，IQR)，横线代表中位值，上下触须分别代表上下四分位以外的1.5倍IQR范围，符号“·”表示超过范围的极端值。
基于Krona的分类学组成信息交互展示图Bacillus(芽孢杆菌属)在Firmicutes(厚壁菌门)的三种处理百分比含量与空白对照差异明显(图5中红色箭头标示)，三种处理6个时间段中，L组所占百分比分别为21、22、24、19、28、18％；LP组所占百分比分别为20、20、22、20、29、29％；P组所占百分比分别为26、27、25、20、23、26％；CK对照所占百分比分别为20、20、15、12、19、15％。L组第5周为最高，LP组第5周和第6周为最高量，P组第2周最高，空白第1周和第2周相对较高。6个时间段的每种处理平均值数值显示与空白对照差异明显(图6)。
如图6所示，4个样本Bacillus(芽孢杆菌属)百分比交互展示，圆圈从内到外依次代表门、纲、目、科、属五个分类水平，扇形的大小反映了不同分类单元的相对丰度高低，并给出具体数值。在每个分类水平，各单元以不同的颜色加以区分。右上方显示某一分类单元在各分类层次中所占的比例，红色箭头指示Bacillus(芽孢杆菌属)在Firmicutes(厚壁菌门)中所占比例部分。
2.4菌群代谢功能预测
根据预测得到的各功能类群在各样本中的丰度分布，使用R软件计算各样本(组)共有功能类群的数量，并通过Venn图直观地呈现各样本(组)所共有和独有的功能类群所占的比例，对菌群组成的测序数据(典型的如16SrRNA基因的测序结果)进行菌群代谢功能的预测，其中L、LP、P和CK处理功能菌群数量21、58、16和5个(图7A)。对丰度前50位的功能类群进行聚类分析并绘制热图，红色的部分为丰度较高的功能类群，10个高丰度功能类群中L组有3个，LP组有3个，P组有3个，CK组有1个，L组为第1、4、6周，LP组为第1、3、6周；P组为第4、5、6周。14个低丰度的，L组有3个，LP组有3个，P组有3个，CK组有5个(图7B)。
如图6所示，其中A为共有功能类群的Venn图，每个椭圆代表一个(组)样本，椭圆间的重叠区域表明样本(组)间的共有功能类群，每个区块的数字表明该区块所包含的样本(组)的共有或独有功能类群的数量。B为结合聚类分析的KEGG直系同源基因簇(KO)丰度热图，样本先按照彼此之间功能类群丰度分布的相似度进行聚类，根据聚类结果横向依次排列。同理，功能类群也按照彼此在不同样本中分布的相似度进行聚类，根据聚类结果纵向依次排列。图中，红色代表在对应样本中丰度较高的功能类群，绿色代表丰度较低的功能类群。
3.讨论
微生物是土壤有机质形成和养分转化循环的重要动力，影响土壤养分和微生物的种类和数量，设施蔬菜连作会导致土壤微生物群落结构单一化、有害微生物数量增多。合理的土壤微生物群落结构、丰富的多样性和较高的微生物活性能缓解或消除连作障碍，同时也是维持土壤生态系统稳定性和可持续性的重要保证。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TF28能够产生多种抗菌物质，具有广谱抑制植物病原真菌的功能。
研究显示TF28的添加可以提高棚室连作黄瓜中的碱性磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶活性，提高土壤中细菌和放线菌的数量，降低了真菌数量，对土壤中的pH值有明显的调节作用。随着分子生物学技术的发展对土壤微生物多样性的研究已从传统技术向高通量测序技术(High-throughput Sequencing)迅速扩展，使得对土壤微生物群落差异结构进行全面分析成为可能。本次试验在实施例1基础上采用高通量测序技术详细分析了棚室连作黄瓜施用TF28后土壤细菌多样性及其群落组成，结果显示三种处理与空白对照相比，在苗期、花期、盛果期和结果后期土壤微生物的群落结构差异不大，连作并未造成土壤菌群大量丢失，菌群构成较稳定。但是在花期和盛果期土壤微生物的相对丰度存在较大差异，这与前人的研究相似。P处理在第三周(花期)和第四周(盛果期)多样性指数与丰富度指数达到最高值，明显高于其它两种处理和空白对照，胡元森在对连作黄瓜研究中指出根际微生物主要类群的数量与其生长发育呈正相关。土壤细菌群落组成结果表明Proteobacteria(变形菌门)为优势类群、其次为Actinobacteria(放线菌门)和Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)，连作会造成土壤微生物选择性的适应，造成某些种群富集，而一些种群数量降低的现象。P处理对硝化螺旋菌门比其它处理要高，表现出明显的根迹效应。酸杆菌门(Acidobacteria)是新近基于分子生态学研究划分的新细菌类群,酸杆菌门(Acidobacteria)是新近基于分子生态学研究划分的新细菌类群，大多为嗜酸菌,目前对它们的了解还很少。已有的研究表明酸杆菌广泛存在于自然界的各种环境中，约占土壤细菌类群的5％～46％，但也有研究表明酸杆菌门在一些土壤菌群结构中的比例超过了50％，如Sang-Hoon Lee对栗子树根系周围的土壤样品的菌群结构分析表明酸杆菌门所占比例高达65％。王春香等对西双版纳地区热带雨林土壤酸杆菌群体结构和多样性分析中发现酸杆菌对土壤pH值极为敏感。两两比较P组与CK对照差异性无论是门水平和属水平都要高于其它两组处理，显示对棚室连作土壤具有良好的改良作用。
三种处理对Microvirga具有明显的调节作用(表6，图5)，赵璞钰等对抗马铃薯晚疫病的研究中发现三个Microvirga(微支杆菌属)的菌株有明显的溶大肠杆菌活性，并具有抗马铃薯晚疫病菌活性，这也为微枝形杆菌属对棚室连作黄瓜针对性研究提供了一定的参考。TF28对Firmicutes(厚壁菌门)Bacillus(芽孢杆菌属)具有调节作用，Bacillus对尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)具有抑制作用，表明TF28可以降低黄瓜枯萎病的发病率。菌群代谢功能预测数量上三种处理都明显高于CK对照，L、LP和P处理与空白对照相比特有的数量分别高于320％、1060％和220％，说明三种处理与空白对照相似度小，对土壤微生物的功能作用高于空白对照。丰度值三种处理也高于空白对照，说明TF28对棚室连作黄瓜土壤具有改善作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.解淀粉芽孢杆菌TF28在调节连作黄瓜根际土壤环境中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌TF28以菌悬液和颗粒剂中的一种或两种施用至连作黄瓜根际土壤中；
所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂的制备方法包括以下步骤：
将解淀粉芽孢杆菌TF28制成有效活菌数108cfu/ml以上的菌悬液，将菌悬液喷涂在颗粒载体上，干燥，得到有效活菌数2~3亿个/g的颗粒剂；
所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液施用时，按照4~10ml/株浇灌于黄瓜苗根部土壤中；所述解淀粉芽孢杆菌TF28的颗粒剂施用时，先按照3~10g/株施入待移栽黄瓜苗的土壤中，再移栽黄瓜苗。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调节连作黄瓜根际土壤环境包括改善连作黄瓜根际土壤pH值、调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度和调节连作黄瓜根际土壤酶的活性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调节连作黄瓜根际土壤微生物丰度包括增加微生物数量和提高根际土壤微生物多样性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述解淀粉芽孢杆菌TF28的菌悬液和颗粒剂联用时，先按照3~10g/株施入待移栽黄瓜苗的土壤中，再移栽黄瓜苗，移栽后按照4~10ml/株浇灌于黄瓜苗根部土壤中。
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