CN112940976B - 海洋巨大芽孢杆菌、微生物肥料及发酵液和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株海洋巨大芽孢杆菌及其发酵液和应用，以及一种微生物肥料。该海洋巨大芽孢杆菌已于2019年6月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17890；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该海洋巨大芽孢杆菌具有促进植物生长和活化土壤固定磷、钾养分的作用，并且和枯草芽孢杆菌之间亲和性良好，定殖能力强，从而能够发挥改良土壤、促进植物生长的作用。以该海洋巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌制成的微生物肥料可以有效改良土壤质量并促进植物生长。

Description

海洋巨大芽孢杆菌、微生物肥料及发酵液和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株海洋巨大芽孢杆菌及其发酵液和应用，以及一种微生物肥料。
背景技术
在农业上，土壤质量的好坏是影响农作物健康生长的重要条件之一。然而，化学肥料的过量施用会引起土壤微生物种群数量降低、土质板结、地力贫瘠等问题发生，造成农作物的产量和质量下降。近年来，微生物菌剂作为一种高效绿色环保的生物肥料，在改善土壤微生物多样性、提高土壤养分、促进植物生长等方面发挥了重要的作用。
芽孢杆菌是一类好氧兼厌氧的产芽孢的革兰氏阳性杆菌，能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢，是研制微生物菌剂应用最多的菌属。芽孢杆菌可在土壤中存活、定殖和繁殖，在土壤中不仅具有解磷固氮、重寄生、诱导植物产生抗性的作用，还可以产生抑制有害病菌生长的拮抗物质，有利于土壤有益微生物的富集，从而缓解因大量使用化肥农药所带来的土壤质量问题，对促进农作物生长、提高作物品质具有积极影响。
但是对于陆地生态系统来说，由于多年重复筛选，造成筛选出具有良好功能的菌种的频率逐年降低，从而造成菌株缺乏。并且，有些芽孢杆菌在实验室表现出良好的平板拮抗效果，用于土壤中时却因定殖情况较差而不能发挥相应的作用。另外，功能微生物组合能够增加微生物肥料应用效果的稳定性，将芽孢杆菌用于制备菌剂时，菌种之间可能存在拮抗作用，同样影响其作用的发挥。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一株从渤海底泥中分离获得的海洋巨大芽孢杆菌及其发酵液和应用，以及一种微生物肥料。该海洋巨大芽孢杆菌具有促进植物生长和活化土壤固定磷、钾养分的作用，定殖能力强，且与枯草芽孢杆菌具有良好的亲和力，生长时无抑制作用，二者复合后协同增效，具有良好的改良土壤和促进植物生长的作用。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供一株海洋巨大芽孢杆菌，其分类名称为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，于2019年6月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17890；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的海洋巨大芽孢杆菌从渤海底泥样品中分离得到，属于芽孢杆菌属。该海洋巨大芽孢杆菌具有促生、解磷和解钾的作用，并且和枯草芽孢杆菌之间亲和性良好，定殖能力强，在土壤中存活28天时有效菌数可达到0.2×108～0.6×108cfu/g，从而能够达到改良土壤、促进植物生长的作用。以该海洋巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌制成微生物肥料可以有效改良土壤质量并促进植物生长。该海洋巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQID NO.1所示。
该海洋巨大芽孢杆菌的筛选方法具体包括以下步骤：
①采取我国渤海湾沧州海域的海洋底泥样品，采用无机磷海水细菌培养基(葡萄糖：10.0g，硫酸铵：0.5g，氯化钠：0.3g，硫酸镁：0.3g，硫酸锰：0.03g，硫酸亚铁：0.03g，磷酸钙：5.0g，酵母浸粉：0.5g，氯化钾：0.3g，琼脂：15.0g，海水：1000mL，pH7.2±0.2，121℃灭菌20min后使用)，利用稀释涂平板的方法进行海洋底泥样品的分离。将涂布的平板在28℃培养箱中培养，待平板长出菌落后，挑取周围有透明圈的菌落，采用划线分离法进行3次分离纯化，初步获得具有解磷性能的海洋细菌；
②步骤①得到的海洋细菌在LB细菌培养基上活化，将活化好的海洋细菌按1％的接种量接种到2216E培养基(配方为：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸铁0.1g，海水1000ml，用NaOH调pH为7.2，121℃灭菌20min后使用)上，28℃培养12h。将菌液5000rpm离心10min，倒掉上清液并加入用无菌水将菌体重悬，调OD600为1，吸取菌液至厚度为0.5cm的无机磷海水细菌培养基中，28℃培养3d，测量并记录菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算不同菌株的D/d值。取D/d值最大的菌株，经分子生物学鉴定，其分类名称为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，编号为BM-1。
第二方面，本发明实施例还提供一种巨大芽孢杆菌发酵液，其制备方法包括以下步骤：将上述海洋巨大芽孢杆菌在LB固体培养基上划线活化培养48～60h，挑取菌苔接种于已灭菌的LB液体培养基中，在26～30℃、180～220rpm/min摇床条件下培养12～16h，然后将培养液接种到已灭菌LB液体培养基中进行扩大培养，26～30℃、180～220rpm/min摇床培养48h～60h，即得所述巨大芽孢杆菌发酵液。
该巨大芽孢杆菌发酵液与枯草芽孢杆菌之间具有良好的亲和力，且在土壤中定殖情况良好，可用于制成微生物肥料，用于改良、修复土壤以及促进作物生长。
优选地，所述LB培养基包括以下质量份数的成分：10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份NaCl、15-20份琼脂和1000份蒸馏水，pH调至7.0-7.2。
第三方面，本发明实施例还提供上述海洋巨大芽孢杆菌在制备微生物肥料中的应用。
该海洋巨大芽孢杆菌具有促生、解磷和解钾的作用，定殖能力强，与枯草芽孢杆菌亲和力强。将其制成微生物肥料，可通过常规的沟施、撒施、穴施等方法施于土壤而发挥改良土壤、促进植物生长的作用。
第四方面，本发明实施例还提供一种微生物肥料，所述微生物肥料中含有上述海洋巨大芽孢杆菌。
优选地，所述微生物肥料中所述海洋巨大芽孢杆菌的活菌数为2×107～2×108cfu/g。
优选地，所述微生物肥料中还含有枯草芽孢杆菌。本发明的巨大芽孢杆菌BM-1与枯草芽孢杆菌有良好的亲和力，含有二者的微生物肥料可以进一步有效改良土壤质量并促进植物生长。
优选地，所述枯草芽孢杆菌保藏编号CGMCC No.3665。该菌株已经被公开在申请号为CN201010197538.8、名称为“一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用”的专利中。本申请通过试验研究发现，上述巨大芽孢杆菌BM-1与保藏编号为CGMCCNo.3665的枯草芽孢杆菌之间有良好的亲和力。
优选地，所述微生物肥料中所述海洋巨大芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌的菌数之比为(1～2)∶(1～2)。
优选地，所述微生物肥料中还含有经无害化处理的腐熟有机物料。腐熟有机物料可选自腐熟的鸡、猪等畜禽粪便或腐熟秸秆中的至少一种。腐熟有机物料应符合NY 884-2012表1中除有效活菌数外的其它技术指标要求。
优选地，所述微生物肥料的制备方法包括：将所述海洋巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别在LB固体培养基上划线活化，培养48～60h，挑取菌苔分别接种于灭菌的LB液体培养基中，在26～30℃、180～220rpm/min摇床条件下培养12～16h，然后将培养液分别接种到LB液体培养基中进行扩大培养，26～30℃、180～220rpm/min摇床培养48～60h，将得到的菌液分别按1.8～2.2％的接种量接种到腐熟有机物料中，堆置至发酵完成，大约需要5～7天，得所述微生物肥料。发酵后得到的微生物肥料中总活菌数为2×108～2×109cfu/g。
附图说明
图1为实施例1中分离的巨大芽孢杆菌BM-1菌株的菌落形态；
图2显示了巨大芽孢杆菌BM-1菌株和解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌间的亲和力；其中，A为巨大芽孢杆菌BM-1菌株和枯草芽孢杆菌间，B为巨大芽孢杆菌BM-1菌株和解淀粉芽孢杆菌间，C为巨大芽孢杆菌BM-1菌株和地衣芽孢杆菌间。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所采用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
以下实施例中所采用的原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
以下实施例中试验数据采用SPSS13.0软件进行分析，用单因素ANOVA进行方差分析，结果均以平均数±标准差表示，并用Duncan法进行多重比较。
以下实施例中LB培养基的配方为，10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl、琼脂15-20g、蒸馏水1L，pH调至7.0-7.2。
实施例1
本发明实施例提供了一株海洋巨大芽孢杆菌，该菌株通过以下步骤筛选得到：
1、海洋底泥解磷细菌的初筛
利用深层底泥采样器采取了我国渤海湾沧州海域的底泥样品24个，采用无机磷海水细菌培养基(葡萄糖：10.0g，硫酸铵：0.5g，氯化钠：0.3g，硫酸镁：0.3g，硫酸锰：0.03g，硫酸亚铁：0.03g，磷酸钙：5.0g，酵母浸粉：0.5g，氯化钾：0.3g，琼脂：15.0g，海水：1000mL，pH7.2±0.2，121℃灭菌20min后使用)，利用稀释涂平板的方法进行海洋底泥样品的分离。将涂布的平板在28℃培养箱中培养，待平板长出菌落后，挑取周围有透明圈的菌落。采用划线分离法进行3次分离纯化，初步获得具有解磷性能的海洋细菌32株，将这些细菌置于20％甘油中于-80℃超低温冰箱中保存。
2、海洋解磷细菌的复筛
将步骤1保存的分离自海洋底泥的海洋细菌在LB细菌培养基上活化，之后将活化好的海洋细菌按1％的接种量接种到装有20ml 2216E培养基(配方为：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸铁0.1g，海水1000ml，用NaOH调pH为7.2，121℃灭菌20min后使用)的三角瓶中，28℃培养12h。将菌液5000rpm离心10min，倒掉上清液并加入用无菌水将菌体重悬，调OD600为1，准确吸取菌液10μL至培养基厚度为0.5cm的无机磷海水细菌培养基中，28℃培养3d，测量并记录菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算不同菌株的D/d值。其中，菌株编号为1的菌株透明圈直径D为3.45cm，菌落直径为0.82cm，该菌的D/d值最大，为4.21。
3、菌株编号为1的菌株的分子生物学鉴定
将菌株编号为1的菌株接种到海洋培养基，28℃摇床培养24h，采用天根生化科技(北京)有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA作为模板，以27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 5μL，27f引物1μL，1492r引物1μL，dNTPs 4μL，Taq酶(5U/μL)1μL，ddH2O 36μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，获得16S r DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)。如下所示：
ACTCTGGGTCACTTAGGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGCCATCCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCCGGCAGTCACCTTTAGAGGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGAACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCCGGTAAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGACTTGCATGTATTAGCACCCCGCACTTCT
登录NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)将获得16S r DNA基因序列与GenBank中己知的序列进行同源性比对分析，选择同源性相近的序列进行系统进化分析，序列先进行多重比对，之后使用MEGA7软件采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，最终明确菌株的系统发育学地位。经过序列分析显示，该菌株属于的一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)。将该海洋巨大芽孢杆菌编号为BM-1。
将该巨大芽孢杆菌BM-1菌株于2019年6月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17890；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本发明实施例提供了实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM-1菌株的平板促长试验。
将-80℃保存的巨大芽孢杆菌BM-1菌株在LB平板上活化，之后将活化好的巨大芽孢杆菌BM-1菌株按1％的接种量接种到装有20ml无机盐海水培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂12g，人工海水定容至1L，pH7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。人工海水：NaCl29.5g，MgCl2·5H2O 2g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 3.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，海水微量元素①5mL，海水微量元素②1mL，蒸馏水定容至1L。其中，海水微量元素①(g/L)：柠檬酸0.6g，K2HPO4 3.2g，Na2CO3 10.4g，柠檬酸铁1g，EDTA0.15g。海水微量元素②(g/L)：H2BO4 2.86g，Na2MoO4·2H2O 0.3g，MnCl 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O 0.0499g)的三角瓶中，28℃培养12h。将菌液5000rpm离心10min，倒掉上清液并加入5ml无菌水震荡，将菌体重悬，然后再次5000rpm离心10min，倒掉上清液。用无菌水重悬菌体并调OD600为0.2，得到菌液。将白菜、小麦种子于该OD600为0.2的菌液中浸泡4h，整齐地摆放在已灭菌的滤纸上并加入5ml的无菌水，放入25±2℃植物培养室培养，于培养48h测定白菜和小麦的发芽率和根长，计算该菌株对白菜、小麦的发芽势和对根长和芽长的促进结果(以同批次的未经该菌液处理的白菜、小麦种子作为空白对照)。测定结果显示，利用巨大芽孢杆菌BM-1的菌液处理的白菜、小麦种子，其发芽势较空白对照分别增加38.2％和41.5％，芽长较空白对照分别增加24.6％和36.8％，根长较空白对照分别增加18.9％和31.8％。
实施例3
本发明实施例提供了实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM-1菌株的土壤定殖试验。
海洋细菌由于其独特的生活环境有可能对陆地土壤环境不适应，从而导致不能够定殖和发挥效果。因此，本实施例采用盆栽试验进行了本发明巨大芽孢杆菌BM-1菌株在土壤中定殖情况的测定。选择小麦作为栽培作物，在直径约10cm、高8cm的花盆中进行实验。将巨大芽孢杆菌BM-1菌株在LB固体培养基上划线活化，培养48h，挑取菌苔接种于100mL已灭菌的LB液体培养基中，在28℃、200rpm/min摇床条件下培养12h，然后按10％接种量将培养液接种到1L LB液体培养基中，进行扩大培养，28℃、200rpm/min摇床培养48h，镜检80％以上均为芽孢后。将菌液与灭菌土壤进行掺混并测定土壤中各个菌的初始菌数，活菌数为1×107～3×107cfu/g土。分别在接种后的1d、3d、5d、7d、14d、28d、60d测定土壤中巨大芽孢杆菌的活菌数。以同样的方法测定陆地分离的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆和和地衣芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。由表1结果可以看出，巨大芽孢杆菌BM-1菌株具有良好的土壤定殖能力，接种60d后，土壤中巨大芽孢杆菌的数量为0.65×107cfu/g土，定殖能力高于陆地枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌能力，说明巨大芽孢杆菌BM-1菌株和其他几株菌均具有较好的土壤定殖能力，可以用于作为微生物制剂或肥料在农作物上应用。
表1菌株在土壤中的定殖情况
Figure BDA0002956864040000091
实施例4
本发明实施例提供了一种上述巨大芽孢杆菌发酵液的制备方法：
将实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM-1菌株在LB固体培养基上划线活化，培养48h，挑取菌苔接种于100mL已灭菌的LB液体培养基中，在28℃、200rpm/min摇床条件下培养12h，然后将培养液接种到1L已灭菌LB液体培养基中，进行扩大培养，28℃、200rpm/min摇床培养48h，即得。
实施例5
本发明实施例考察了巨大芽孢杆菌BM-1菌株和枯草芽孢杆菌之间的亲和力。
将实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM-1菌株在LB固体培养基，28℃条件下培养48h，分别与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌进行平板交叉划线，28℃培养48h，观察交叉点间的生长情况，如图2所示中A、B、C所示，发现巨大芽孢杆菌BM-1菌株与三种菌均有一定的亲和力，其中与枯草芽孢杆菌亲和力最强。
实施例6
本实施例提供了一种微生物肥料，其制备方法为：
将实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM-1菌株和保藏编号为CGMCC No.3665的枯草芽孢杆菌分别在LB固体培养基上划线活化，培养48h，挑取菌苔分别接种于100mL已灭菌的LB液体培养基中，在28℃、200rpm/min摇床条件下培养12h，然后将培养液分别接种到1L LB液体培养基中，进行扩大培养，28℃、200rpm/min摇床培养48h。分别将菌液按2％的接种量接种到腐熟的鸡粪肥料中，堆置至发酵完成(5-7天)。该肥料中的总活菌数为2×108-2×109cfu/g。
本发明实施例还考察了上述微生物肥料制备对苹果园土壤的影响。
试验共设2个处理组：
对照组：每棵苹果树沟施鸡粪有机肥15kg、化肥1kg，施肥深度20cm；
微生物肥料处理组：每棵树沟施微生物肥料15kg、化肥1kg。施肥深度20cm。
两组均连续施用两年，采用5点取样法收集耕层土壤样品，并测定土壤微生物的数量，结果见表2。由表2可以看出，施用上述微生物肥料可以使土壤中细菌和放线菌数量增加，而真菌数量则比对照降低，说明土壤微生物环境改善。
表2对苹果园土壤微生物数量的影响
Figure BDA0002956864040000111
采用5点取样法收集耕层土壤样品，并测定土壤酶活性的数量，结果见表3。
表3对苹果园土壤酶活性的影响
Figure BDA0002956864040000112
注：*表示与对照组相比P＜0.05。
由表3结果可以看出，施上述微生物肥料能够显著增加碱性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性，提高土壤供应氮、磷和碳的能力。
采用5点取样法收集耕层土壤样品，并测定土壤种的养分，结果见表4。
表4对苹果园土壤养分的影响
Figure BDA0002956864040000113
由表4结果可以看出，施上述微生物肥料能够增加有机质、速效磷、速效钾、有效铁的含量，使pH值更接近于中性，从而增加土壤供应金属离子的能力。
于结果期采集对照组、微生物肥料处理组的苹果树叶各100片，测定叶片厚、叶面积和叶绿素指标，并于收获期测产。结果见表5。
表5微生物肥料对苹果叶片生长的影响
处理 叶片厚(mm) 叶面积(cm<sup>2</sup>) 叶绿素(mg/g)
对照组 0.25±0.04 22.55±7.07 2.97±0.38
微生物肥料处理组 0.28±0.05 31.75±9.26 3.59±0.32
由表5结果可以看出，施上述微生物肥料能够显著增加苹果的叶片厚、叶面积和叶绿素含量，说明上述微生物肥料促进了苹果的营养生长。测产结果表明该微生物肥料还能够显著增加苹果的产量。
基于以上试验结果可见，巨大芽孢杆菌BM-1在土壤改良修复以及促进苹果生长方面有着明显的促进作用，不会对环境造成污染，可以解决过去过度使用农药化肥所带来的土壤问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 海洋巨大芽孢杆菌、微生物肥料及发酵液和应用
<130> 2021.2.24
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> BM-1
<400> 1
actctgggtc acttagggcg gctagctcct tacggttact ccaccgactt cgggtgttac 60
aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat 120
gctgatccgc gattactagc gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg 180
aactgagaat ggttttatgg gattggcttg acctcgcggt cttgcagccc tttgtaccat 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gccatccccc 300
accttcctcc ggtttgtcac ccggcagtca cctttagagg tgcccaacta aatgctggca 360
actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacaacca tgcaccacct gtcactctgt cccccgaagg ggaacgctct atctctagag 480
ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg 540
ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc 600
cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaaag ggcggaaacc ctctaacact 660
tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc 720
tttcgcgcct cagcgtcagt tacagaccaa aaagccgcct tcgccactgg tgttcctcca 780
catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccgctt ttctcttctg cactcaagtt 840
ccccagtttc caatgaccct ccacggttga gccgtgggct ttcacatcag acttaagaaa 900
ccgcctgcgc gcgctttacg cccaataatt ccggataacg cttgccacct acgtattacc 960
gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtacgagca 1020
gttactctcg tacttgttct tccctaacaa cagagtttta cgacccgaaa gcccttcatc 1080
actcacgcgg cgttgctccg tcagaacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc 1140
ctccccggta aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg 1200
tcggctatgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tgcaccgcgg 1260
gcccatctgt aagtgatag ccgaaaccat ctttcaatcat ctcccatgaa ggagaagatc 1320
ctatccggta ttagcttcgg tttcccgaag ttatcccagt cttacaggca ggttgcccac 1380
gtgttactca cccgtccgcc gctaacgtca tagaagcaag cttctaatca gttcgctcga 1440
cttgcatgta ttagcacccc gcacttct 1468

Claims (9)

1.一株海洋巨大芽孢杆菌，其特征在于，其分类名称为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，于2019年6月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17890；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种巨大芽孢杆菌发酵液，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：将权利要求1所述海洋巨大芽孢杆菌在LB固体培养基上划线活化培养48～60h，挑取菌苔接种于已灭菌的LB液体培养基中，在26～30℃、180～220rpm/min摇床条件下培养12～16h，然后将培养液接种到已灭菌LB液体培养基中进行扩大培养，26～30℃、180～220rpm/min摇床培养48h～60h，即得所述巨大芽孢杆菌发酵液。
3.权利要求1所述的海洋巨大芽孢杆菌在制备微生物肥料中的应用。
4.一种微生物肥料，其特征在于，含有权利要求1所述的海洋巨大芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中所述海洋巨大芽孢杆菌的活菌数为2×107～2×108cfu/g。
6.根据权利要求4所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中还含有保藏编号为CGMCC No.3665的枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中所述海洋巨大芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌的菌数之比为(1～2)∶(1～2)。
8.根据权利要求6或7所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中还含有经无害化处理的腐熟有机物料。
9.根据权利要求6所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料的制备方法包括：将所述海洋巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别在LB固体培养基上划线活化，培养48～60h，挑取菌苔分别接种于灭菌的LB液体培养基中，在26～30℃、180～220rpm/min摇床条件下培养12～16h，然后将培养液分别接种到LB液体培养基中进行扩大培养，26～30℃、180～220rpm/min摇床培养48～60h，将得到的菌液分别按1.8～2.2％的接种量接种到腐熟有机物料中，堆置至发酵完成，得所述微生物肥料。
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