CN101506348A - 用于改善植物生长的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明已经意外地发现：某些形成孢子的微生物存在于土壤、植物和其它形式的有机物质中，在土壤或碳化的木材中，在过热的火中存活。已经测定：这样的微生物刺激植物生长，提高植物产品的营养价值，且结合二氧化碳。因此，本发明提供从土壤和从碳化有机材料分离和鉴别刺激植物生长的微生物的方法。本发明也提供可用于促进植物生长与营养性质和用于制备DNA提高的植物的组合物和方法，该DNA提高的植物可供人个体消费以提高人体DNA。本发明的组合物和方法也可用于改良土壤。本发明也提供使用木炭作为载体，促进植物生长，和将期望的微生物从一个生态系统转移和重新安置到另一个生态系统的方法。

Description

用于改善植物生长的方法和组合物

发明领域

本发明涉及刺激植物生长的微生物的鉴别和分离。详细地说，本发明涉及火烧顶级微生物从包封和保护这样的微生物以免过热的材料例如碳化的植物材料、海洋废物和土壤的分离。本发明也涉及这样的微生物通过土壤的补救和改良，而促进植物生长和营养性质的用途。本发明还涉及木炭促进微生物生长和将期望的微生物从一个生态系统转移和重新安置到另一个生态系统的用途。

发明背景

目前用于提高边缘耕地农作物产量的常规耕作方法一般过度使用有害的肥料和杀虫剂。详细地说，以植物可接受的形式，以增加的量，应用化学肥料，以提供氮、磷和钾源，以及其它矿物质和微量营养素。化学肥料已经使土壤酸化，堆积了高水平的重金属和盐。合成的尿素和其它的化学制品还导致表现为必需营养素和矿物质难以接近植物的失衡。肥料和杀虫剂的过量使用导致在被修正的土壤中必需营养素的失衡，最终表现为土地不适合耕作，和在最后无力维持植物的生命。灌溉和雨水使应用的肥料和杀虫剂冲进排水沟中，引起湖泊、江河和其它局部水资源的超营养化，显著导致水污染和造成不可饮用的或有毒的水资源。

在过去不到10年，已经引入有机耕作方法，努力减少常规肥料和杀虫剂对环境的负面影响。然而，有机耕作实践已经引起了其它的问题。例如，用于有机耕作的肥料可包含重金属、有机污染物和微生物病原体。鱼藤酮(由天然产物制备的和用于有机耕作的杀虫剂)能杀灭产多巴胺的神经元，导致运动障碍。已经证实鱼藤酮在大鼠中引起帕金森综合征(Renner，R.＂From Flush to Farm(从喷流到农田)，＂Scientific American，10/2002；Karow，J.，＂Pesticides and Parkinson′s(杀虫剂和帕金森综合征)，＂Scientific American，11/6/2000；Lozano，A.M.和Kalia，S.K.，＂New Movement in Parkinson′s：Environmental Culprits(帕金森综合征的新趋势：环境危害)，＂Scientific American，第71页，6/27/2005。)

因此，需要以下的方法和组合物：解决当前土壤营养失衡和减少有毒化学物质水平，以及创造最低限度地影响周围环境的自给耕地。

＂Terra preta＂土壤是富饶的土壤，因提高的肥沃和生产力而受到重视。被发现于亚马逊雨林地带中，它们包含高水平的有机物和碳。也已观察到terra preta土壤包含比非-terra preta土壤更高水平的营养物，包括氮、磷、钙和钾的水平，和具有更多的营养物和更高的保湿能力。Sombroek，WG等，Ambio，22：417-426(1966)；Smith，N.J.H.，Ann.Assoc.Am.Geogr.70：553-566(1980)；Zech，W.，等，在：McCarthy，P.等编辑，American Society of Agronomy and Soil Science Society of America，麦迪逊市，威斯康星州，第187-202页(1990)。如terra preta土壤一样，terra mulata土壤呈深灰棕色，包含提高水平的土壤有机物。

尽管围绕terra preta土壤的形成有充分的研究，但还不知道在terrapretas土壤和terra mulata土壤中细菌和真菌的鉴别和功能。见，例如Lehmann，J.等编辑，＂Amazonian Dark Earths＂，Kluwer学院出版社(2003)。例如，虽然科学家已经认识到在Terra preta土壤中木炭作为关键成分的传播，且已经知道细菌和其它微生物存在于土壤中，但是不知道在terra pretas土壤和terra mulata土壤中细菌和真菌的鉴别和功能。Glaser，B.等，Biol.Fertil.Soils 35：219-230(2002)；Lehmann等(2003)。

发明概述

本发明是基于意外的发现：某些形成孢子的火烧顶级微生物，或本文称为＂火烧顶极微生物＂，存在于有机材料例如土壤和植物中，在极端的条件如过热的火中存活。植物被火烧死，但这些火烧顶级微生物形成芽孢，且依靠碳化的植物材料和土壤的绝缘性，在包封材料如土壤和碳化的植物材料中存活，且一旦条件变得有利，则重新驻入土壤和植物。

因此，本发明提供分离和选择这样的火烧顶级微生物以及因此分离的微生物的可再生方法。也已测定这些火烧顶极微生物刺激植物的生长，提高植物产品的营养价值，且结合二氧化碳。本发明提供独特的见解，即碳化的木材作为刺激植物生长的火烧顶极微生物的贮藏库，因此可被用作载体，以重新安置刺激植物生长的火烧顶极微生物，重建生态系统。本发明也证实可能通过在孢子形成期间产生的有害化学因素的吸附而保护火烧顶极微生物，使木炭促进火烧顶级微生物的营养生长。根据本发明还提议，terra preta土壤的不寻常的肥沃可归于在亚马逊雨林中的自然和人为的火，它产生广阔的碳化木材，允许火烧顶极微生物存活和茂盛生长。基于木炭和火烧顶极微生物之间关系的新理解，本发明提供了以下方法：使用自然重设按钮，以纠正由农业引起的环境破坏，和引发火灾后在自然系统中发生的分子自组装的类型。

在一个实施方案中，本发明提供通过以下步骤，从碳化的有机材料特别是碳化的植物材料如木炭分离火烧顶级微生物的方法：用含火烧顶极微生物孢子的碳化材料，接种生长培养基；和在合适的温度下，将该生长培养基维持足以允许火烧顶极微生物在培养基中营养生长的时间。可获得火烧顶极微生物的多株混合物以及单个分离株。

本发明也提供制备碳化的材料特别是碳化的植物材料的方法，该方法模拟自然火的条件，允许火烧顶级微生物的可再生分离和选择。在具体的实施方案中，该方法涉及在一定的条件下加热或燃烧有机材料，该条件使碳化进展到恰好在火稳定性细菌消失之前的程度。例如，可在约1BTU远离将导致火稳定性细菌消失的温度和时间的温度和时间内，进行加热。在优选的实施方案中，该方法涉及在至少200℃，或优选在至少400℃，或更优选在约600℃，加热或燃烧植物材料约5-约20分钟，优选约10-约15分钟，制备碳化的植物材料。

在另一个实施方案中，本发明提供通过以下步骤从土壤分离火烧顶级微生物的方法：煮沸含火烧顶极微生物孢子的土壤液体悬浮液，用煮沸的悬浮液等分试样接种生长培养基，在合适的温度将该生长培养基维持足以允许火烧顶极微生物在培养基中营养生长的时间。

在再一个实施方案中，本发明提供鉴别刺激植物生长的火烧顶级微生物株的方法。从土壤或木炭分离火烧顶级微生物的单一株，筛选这些株刺激植物生长的能力。

在还另一个实施方案中，本发明提供分离的火烧顶极微生物，该火烧顶级微生物产生的孢子在至少200℃或甚至达约600℃或更高温度下存活。优选的火烧顶极微生物包括：中间短芽孢杆菌(Brevibacilluscentrosporus)的分离株特别是HAB7和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的分离株例如AC9。

在一个实施方案中，本发明提供含火烧顶级微生物的组合物，该火烧顶级微生物产生的孢子在至少200℃或甚至约600℃存活。本发明的组合物可用于提高植物的生长和改良土壤质量，可被制备成肥料组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供以下的方法：通过使植物的栽培变种生长于用本发明的至少一种火烧顶级微生物补充的植物栽培培养基中，而提高植物的生长。

在还另一个实施方案中，本发明提供以下的方法：通过使植物的栽培变种生长于用本发明的至少一种火烧顶级微生物补充的植物栽培培养基中，而制备营养提高的植物产品。

在再一个实施方案中，本发明提供以下的方法：通过使植物的栽培变种生长于用木炭补充的植物栽培培养基中，而提高植物的生长和/或营养价值。优选，在该方法中使用的木炭已选择含期望的火烧顶级微生物。

基于本发明的方法制备的植物和植物产品形成本发明的另一个实施方案。根据本发明制备的植物产品有益于摄取它们的动物，因为火烧顶级微生物在植物中增加植物化学成分的含量(实施例X和XI)，和认为火烧顶极微生物刺激动物的免疫系统。

在再一个实施方案中，本发明提供以下的方法：通过使用火烧顶级微生物或包含根据本发明鉴别的火烧顶级微生物的组合物，而改善土壤的刺激植物生长的性质，和在土壤中增加生物多样性。

此外，本发明提供提高植物太阳能转化的方法，和通过提高植物矿物质营养素利用的效率而减少污染的方法。

也可将本发明的火烧顶级微生物和/或包含火烧顶级微生物的木炭引入到非农业土地，包括景观荒地、城市绿化带和高尔夫球场。

附图简述

图1.从木炭分离的微生物的部分16S rDNA序列与已知的细菌序列的比较。该图显示最接近的细菌序列匹配和相应的百分序列差异。四个分离株CP1-2、CP1-6、CP1-13和CP1-14不可鉴别。＂最接近的匹配＂指这些分离株各自的序列差异>5％，因此推断不太可能是一样的。(见实施例I)

图2.从木炭分离的微生物的部分16S rDNA序列与GenBank序列的比较。该图显示4个未匹配的分离株找到的最接近的GenBank序列匹配。(见实施例I)

图3A-3B.从杏仁木炭分离的微生物的16S rDNA序列分析。所分析的29个分离株中的一个(见3B)被鉴别为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)。(见实施例II)

图4.从土壤分离的微生物的部分16S rDNA序列分析。该图显示DAP-1至DAP-6样品中的每一个的最接近细菌序列匹配和基于500碱基对16S rDNA测序的样品株与最接近匹配之间序列的相应百分差异。DAP-2被鉴别为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)。(见实施例III)

图5.获得的HAB7的完整16S-rDNA序列。(见实施例III)

图6.木炭对细菌生长的影响。该图显示与未处理的对照培养相比，在第3天木炭已提高细菌生长约20倍，在第5天已提高约8倍。在每次处理的3个重复培养中每一个中，通过测定活细胞，测定第5天的影响是非常显著的(P≤0.01)。在每次处理中，用一次重复培养测定第3天的影响。(见实施例V)

图7.HAB7的固碳作用。以总碳计，HAB7细胞结合CO₂至约0.25％的水平(黑圆形)。12-18小时的¹³C含量增加与12-36小时的¹³C含量增加是非常显著的(p≤0.001)。与周围大气CO₂(空心三角形)相比，在T₁₂(12小时)时增加的CO₂浓度(黑三角形)提高细胞生长(质量)50％(P≤0.01)，在T₃₆(36小时)时提高12％(P≤0.01)。(见实施例VI)

图8.尿素对HAB7生长的影响。评估了在存在或缺乏尿素时，培养30小时的HAB7的生长。该图显示尿素显著抑制HAB7的生长。(见实施例X)

发明详述

为了公开内容的清楚，且不受限制，将本发明的详述分成描述和举例说明本发明的某些特征、实施方案或应用的以下小节。

本发明的火烧顶极微生物的特征

当用于本文时，术语＂火烧顶极微生物＂指与植物有益相关并与火有特殊关系的高度进化的形成孢子的细菌。火烧顶级微生物具有适应环境变化的能力，产生的孢子经受的温度比与生命持续条件正常相关的那些温度高。所有的火烧顶级微生物，例如当火通过它们时在200℃、400℃或甚至600℃的土壤中存活，可在很高的温度(例如500℃或甚至600℃)加热制备的吡咯化(pyrrolized)碳底物如木炭或其它形式的碳化植物材料以及其它形式的碳化有机材料中，找到许多火烧顶级微生物。

根据本发明，火烧顶级微生物从火中得到4种益处。第1，火使孢子壁变弱，然后可吸收触发孢子萌芽所需的水。第2，火产生木炭，通过吸附有利于孢子形成的化学因素，保持火烧顶级微生物处于持续的营养生长状态(Gonzalez-Pastor等，Science 301：510-513，2003)，因此立即促进细菌的生长。第3，火杀灭许多与火烧顶级微生物竞争的微生物。最后，火通过从植物材料中释放矿物质营养素，为火烧顶级微生物创造肥沃的平台。在火烧之后，通过移植到新植物根系，火烧顶级微生物群落大量繁殖。最终，由于火的产物-木炭、高营养素水平和减少的竞争-消失，火烧顶级微生物形成孢子，并静止直至发生下一个火和再生长的周期。在该意义上说，火烧顶级微生物代表通常公认的火烧顶级植物种的微生物形式，其也在火烧之后唤醒和丰富地生长。

根据本发明，火烧顶级微生物存在于植物内，通过刺激对植物生长和保护起重要作用的植物化学成分的产生，而有益于宿主植物。另外，火烧顶级微生物刺激植物中的关键的代谢路径，包括根的分泌和呼吸，帮助碳从地上的植物器官直接流到根部。该根部生长的刺激又增加矿物质营养素和水的利用度。进而，各种火烧顶级微生物通过还原N₂变成氨，抑制植物病原体的生长，使磷酸盐增溶和结合二氧化碳，而刺激植物生长。不打算受任何特定的理论束缚，认为外遗传获得火烧顶级微生物对植物的刺激效应。火烧顶级微生物可能上调宿主植物中选择的基因的表达，导致“基因提高”或“DNA提高”的植物，其特征在于例如提高生长和植物化学成分的产生。见实验胚胎学的综述，Grant-Downton和Dickinson，Annals Botany 96：1143-1164(2005)，第1部分；和Annals Botany(2005年10月)，第2部分。

此外根据本发明，火烧顶级微生物也存在于未开垦的土壤中。火烧顶级微生物以孢子在火烧期间存活和后来它们在水分存在下生长，使火烧顶级微生物位于移植新植物根系的顶部。

火烧顶极微生物的分离和鉴别

在一个实施方案中，本发明提供从碳化的有机材料中分离火烧顶级微生物的方法。

有机物质是生物起源的材料，其包含(1)火烧顶级微生物，(2)它们的DNA，和(3)由碳和与活生物体有关的其它元素如氧、氢和氮组成的无活性底物。适合分离火烧顶级微生物的有机物质的实例包括植物材料、海洋废物材料如鱼肉和海藻以及得自土壤的有机物质。

碳化是指有机物转化成主要含碳的残留物。一般这样的残留物由多环芳族碳分子的混合物组成。

在具体的实施方案中，碳化的材料是木炭，木炭可以从自然获得，或可由本领域的技术人员已知的许多方法人工制备。例如，可从现代的具有有效风挡系统的低散发木材炉中的干木材制备木炭。一种适合该目的的炉子的内部尺寸为20＂×20＂×15＂(W×D×H)。操作者使用引火物例如裂开的红木和几个裂开的松树或橡树的圆木点火。应几次补充松树或橡树圆木，完全打开风挡燃烧，以充分加热炉子，产生合适的煤炭床。在约3-4小时之后，应在炉子的底部呈现约5＂深的炽热的煤炭床。

产生木炭的圆木可以是完整的或裂开的，但经验教导完整的圆木给出更高的木炭产量。应将选择用于木炭制备的3或4根圆木放在燃着的(鲜橙色)煤炭上，风挡完全打开。新圆木根据木材的湿气含量，典型地将在约10分钟内突然燃烧，在约20分钟内应产生强烈的火。在火焰包绕了所有的圆木之后几分钟，应将风挡完全关闭，以减少氧气的利用度。火将很快平息，圆木将炭化且同时燃烧。可允许含圆木的炉子在本文描述的条件下保留过夜，而无需进一步的监督。在早上，炉子将变冷，将提供圆木的碳化残留物。可立即将碳化的圆木打碎成较小的木炭片。

基于重量的木炭产量差异大。有经验的矿工能获得25％的产率，但在本文描述的条件下更典型的产率为约15-20％。

为了释放木炭内的火烧顶级微生物，从大片的木炭中分离出细微的、直径约2mm-15mm的粉尘样木炭颗粒。然后将细木炭颗粒用于接种生长培养基，该生长培养基选自任何适合细菌培养的培养基。可通过将木炭颗粒直接添加入液体生长培养基中，来实现接种。或者，可使用固体生长培养基，在该情况下，可在培养基的制备期间和在它固化之前(例如，在培养基高压灭菌之后不久)，将木炭颗粒添加到生长培养基中。然后将用木炭颗粒接种的生长培养基保持在5℃-55℃的适当温度范围内，持续足以允许火烧顶极微生物在培养基中营养生长的时间。可容易地从生长培养基分离这样产生的火烧顶级微生物，待用。

如果需要，也可分离火烧顶级微生物的单一株。例如，可在培养基固化之前，将木炭颗粒添加到生长培养基的液体悬浮液中。为了在板上得到单一菌落，按以下的浓度将木炭添加到液体悬浮液中：约0.5％-约10％，优选约1％-约5％，和更优选约3％(w/v)。然后将培养基悬浮液倾入培养皿中，固化。代表单一火烧顶级微生物株的单一菌落将在板上发育，并可收集，进一步使用或分析。可对菌落的16S rDNA测序，以在种水平鉴别火烧顶级微生物。

在另一个实施方案中，通过在使碳化进展到恰好在火稳定性细菌消失之前程度的条件下，加热含火烧顶级微生物或其孢子的有机材料，例如切碎的树皮组织和植物的木材、或海洋有机废料，来制备用于分离火烧顶级微生物的碳化材料。例如，可在约1BTU远离将导致火稳定性细菌消失的条件的条件下，进行加热。

在具体的实施方案中，将有机材料例如切碎的树皮组织和植物的木材或海洋有机废料在极高的温度例如在约600℃加热(即热处理)一定时间优选约10-15分钟，最优选在600℃加热10分钟。如下面的实施例III所例证，为了达到一致的和完全的碳化，可使用有小室的炉子来进行加热过程。在实施例III中的木材可已经完全燃烧，但在约10分钟时停止碳化处理，以恰好在它们消失之前恢复细菌孢子，即无活孢子保留在下一个收集的样品中(在600℃加热15分钟)。

＂约600℃＂指585℃-615℃，优选590℃-610℃，或更优选595℃-615℃。达到期望的碳化程度(即恰好在火稳定性微生物消失之前)所需的准确温度可取决于包封火稳定性微生物的有机材料的具体密度、湿气含量、数目或数量、均匀度、形状、尺寸、一致性、化学成分、氧水平、压力、化学处理(若有的话)。

热条件包括温度和时间应该是这样的：以起始材料计，产生重约10-20％的残留物。可由从有机物质释放、恢复、分离或获得火烧顶级微生物所需的能量，适当地定义与本发明有关的热条件。公式时间乘以温度，和从有机物质释放、恢复、分离或获得火烧顶级微生物所需的能量成比例。在有机物质600℃热处理10分钟的情况下，供应释放、恢复、分离或获得火烧顶级微生物所需的100％的能量，有机物质在同样的温度下热处理5分钟或15分钟，将分别提供50％和150％的能量值。因此，按照本发明，适合从有机物质释放、恢复、分离或获得火烧顶级微生物的热条件，是供应例如51％-149％的能量的那些热条件。

然后将产生的碳化材料用于接种如上所述与木炭有关的适合细菌培养的生长培养基。

在另一个实施方案中，本发明提供从土壤中分离火烧顶级微生物的方法。按照该实施方案，可将土壤悬浮于水中，例如按1:1的比率(v/v)。然后将悬浮液置于沸水浴中约2-4分钟，优选约3分钟。从悬浮液中取等分试样，放在适用于细菌生长的固体生长培养基上。这样的生长培养基的实例为TY培养基(Bacto胰蛋白胨(5g/l)、Bacto酵母提取物(3g/l)和CaCl₂(1.3g/l)和Bacto琼脂(15g/l))。各细菌菌落将在固体生长培养基上发育，如果需要得到单一菌株，可进一步次培养。

可进一步筛选如上所述分离的细菌的促进植物生长和生产力的能力。可基于枝条干重、种子的产量、根的生长和/或果实的产量或大小，测定植物的生长和生产力。可用作测试介质的植物包括几乎任何生长于土壤中的植物。示范性植物包括日用谷类农作物(例如玉米、小麦和大豆)和高粱属的植物。其它的实例包括未加工的日用农作物，包括果树和结坚果的树(例如杏树)、大豆、花生、葡萄、苹果、浆果类(草莓、黑莓、红莓)、根茎类(例如马铃薯、红薯)、玉米、谷类作物(例如小麦、水稻、黑麦)、西红柿、洋葱、葫芦类(例如西瓜、黄瓜和香瓜)、多叶蔬菜(例如莴笋、菠菜、菊苣)、棉花和其它日用作物。

分离的火烧顶极微生物株

在另一个实施方案中，本发明提供了基于上述本发明的方法分离的火烧顶极微生物。

根据本发明的方法分离的火烧顶极微生物是产孢子的细菌，该孢子经受至少200℃或甚至600℃的高温。认为这样的火烧顶极微生物是广义芽孢杆菌(Bacillu ssensu lato)属，例如梭形气芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、烟酸芽孢杆菌(Bacillus niacini)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、异常芽孢杆菌(Bacillus insolitus)、Bacillus psychrodurans、耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)、耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)、固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillusamylolyticus)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacil luslautus)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus spp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.)、嗜热溶胞土芽孢杆菌(Geobacillus spp.)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus spp.)、硫化杆菌属(Sulfobacillus spp.)、Ammoniphilus spp.和解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus·spp.)。

分离的火烧顶极微生物的实例包括从豆科灌木木炭分离的那些(图1)，特别是命名为CP1-2、CP1-6、CP1-13和CP1-14的四个分离株。在Genbank中没找到与这四个分离株的16S rDNA序列的匹配度高于97％的序列。

分离的火烧顶极微生物的另外的实例是从杏仁木炭分离的那些(图3A-3B)，特别是命名为“C17304 AC23con”的分离株。C17304 AC23con(图3B)测定为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)，抗大观霉素、四环素和氯霉素。

分离的火烧顶极微生物的另一个实例为从土壤分离的HAB7。与C17304 AC23con相似，HAB7也是中间短芽孢杆菌(Brevibacilluscentrosporus)的菌株，抗大观霉素、四环素和氯霉素。相信HAB7和C17304 AC23con可能代表同一种分离株。含C17304 AC23con的木炭来自杏树，该杏树生长于分离出HAB7的相同土壤中。另外，所分析的HAB7和C17304 AC23con的16S rDNA序列相同(500bp)。而且，HAB7和C17304 AC23con有同样的抗生素耐药性，即自然抗大观霉素(25μg/mL)、四环素(1μg/mL)和氯霉素(2.5μg/mL)的组合。

本发明的优选的火烧顶极微生物为经测定可促进植物生长、能够固碳的那些，例如HAB7和C17304 AC23con。

于2006年11月17日，将菌株HAB7和AC9保藏在弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，20108。

含火烧顶极微生物的组合物

可用由如上所述的木炭和土壤制备的火烧顶极微生物制备可用于促进植物生长和改善土壤的组合物。因此，本发明提供植物肥料组合物和改善土壤的组合物，该组合物包含至少一种根据本发明的方法分离的火烧顶极微生物。

“至少二种火烧顶极微生物”指单一的火烧顶极微生物株，或多种(即至少两种)火烧顶极微生物株的组合。例如，组合物可包括通过以下方法制备的火烧顶极微生物的混合物：用含火烧顶极微生物孢子的木炭，接种生长培养基，将生长培养基温育一段时间，以引发火烧顶极微生物的营养生长。为用于制备本发明的组合物分离火烧顶极微生物的单一株不是绝对必要。然而，在优选的实施方案中，采用一种或多种分离的火烧顶极微生物株，来制备促进植物生长或改善土壤的组合物。用于本发明组合物的特别优选的火烧顶极微生物是已被测定能促进植物生长的那些，例如HAB7和AC9。在具体的实施方案中，组合物包括HAB7和AC9两者。

除了微生物之外，本发明的组合物可包括木炭。本发明已显示木炭独立地促进火烧顶极微生物的营养生长，这又刺激植物生长。

本发明的组合物也可包括适用于肥料组合物的其它组分或成分。

促进植物生长和改善土壤的方法：

在一个实施方案中，本发明也提供通过使用本发明的火烧顶极微生物，促进植物生长的方法。使植物的栽培变种生长于植物栽培培养基中，用至少一种本发明的火烧顶极微生物补充该培养基，以达到促进的生长。

根据本发明，按有效促进植物生长和繁殖的量，将火烧顶极微生物添加到植物栽培培养基例如土壤或合成的栽培培养基中。例如在种植之前、期间或之后，按2×10⁷-2×10¹¹CFU/ft²或优选2×10⁸-2×10¹⁰CFU/ft²或更优选约2×10⁹CFU/ft²，将火烧顶极微生物添加到土壤中。可以以任何合适的方式包括喷洒含火烧顶极微生物的粉末或液体悬浮液，以孢子或细胞的形式，将火烧顶极微生物接种到栽培培养基中。本领域的技术人员可容易地测定有效促进植物生长的火烧顶极微生物的精确量和接种的时间与频率。与生长于不添加火烧顶极微生物的在其它方面相同的培养基中的植物比较，根据增加的枝条干重、种子产量、根的生长和/或果实产量/大小，可测定提高的植物生长。

根据本发明，通过实践本发明办法可提高多种植物的生长，包括但不限于谷类作物(例如玉米、小麦和大豆)、高粱、结果实的和有坚果的树(如杏仁)、大豆、花生、葡萄、苹果、浆果(草莓、黑莓、红莓)、根茎类(如土豆、甘薯)、玉米、谷物类(如小麦、水稻、黑麦)、番茄、洋葱、葫芦类(如西瓜、黄瓜和香瓜)、多叶蔬菜(如莴苣、菠菜、菊苣)、棉花和其它的日用作物。

在另一个实施方案中，使植物的栽培变种生长于植物栽培培养基中，用至少一种本发明的火烧顶极微生物补充该植物栽培培养基，以制备营养提高的植物产品。

“营养提高的植物产品”指与无一种或多种火烧顶极微生物存在下生长的植物产品相比，在存在至少一种本发明的火烧顶极微生物下生长的植物的产品的植物化学成分或营养素的量增加。植物产品包括预定用于消费的植物的任何部分，例如根、茎、叶、汁液、果实、油或花。

术语“植物化学成分”是非营养植物物质的通用术语。已经显示许多植物化学成分及其消耗后转化的产物均可防护疾病。植物化学成分包括例如类胡萝卜素、抗氧化剂(如类黄酮)和生育酚(如α-生育酚和γ-生育酚)。

在具体的实施方案中，增加的营养素或植物化学成分为类黄酮或异类黄酮。在其他实施方案中，营养素或植物化学成分为维生素，例如维生素E(α-生育酚或γ-生育酚)。本发明的方法可以实现α-生育酚的量增加至少1.3倍，或约1.3倍-2倍，γ-生育酚的量增加至少1.3倍，或约1.3倍-3倍。

可将本发明的方法用于增加各种植物产品的营养素或植物化学成分的含量，包括果类(如葡萄、苹果、浆果如草莓、黑莓和红莓)、根茎类(如马铃薯、甘薯)、坚果类(如杏仁、花生)、大豆、玉米、谷物类(如小麦、水稻、黑麦)、番茄、洋葱、葫芦类(如西瓜、黄瓜和香瓜)、多叶蔬菜类(如莴苣、菠菜、菊苣)。在具体的实施方案中，植物产品为杏仁，收获营养提高的产品的植物为杏树植物。

在再一个实施方案中，本发明提供通过使植物的栽培变种在用木炭补充的植物栽培培养基中生长，促进植物生长和/或营养价值的方法。在具体的实施方案中，已经选择包含至少一种刺激植物生长的火烧顶极微生物的木炭用于本发明的方法。

存在微生物时生长的植物和这类植物的产品，形成本发明的另一个实施方案。认为存在火烧顶极微生物时生长的植物具有提高的基因和DNA，显示为具有提高的生长和增加的如植物化学成分的产生。此类DNA提高的植物和植物产品对摄取它们的动物是有益的，不仅因为植物和植物产品的营养价值提高，而且因为DNA提高的植物材料被认为调整和提高动物(如人)的DNA，导致例如提高的先天的和适应性的动物免疫系统。因此，在一个实施方案中，动物包括人摄入含本发明火烧顶极微生物的植物产品，以提高微生物菌丛，促进和改善健康，减少疾病。不希望被特定的机制或理论束缚，认为被摄入的火烧顶极微生物抑制或甚至杀灭在动物系统中引起疾病的细菌，因此改善健康和减少疾病与生病。

在还一个实施方案中，使用根据本发明分离的火烧顶极微生物，改善和重构土壤，提高土壤的生物多样性。改善土壤质量的方法和结果、修正的土壤是本发明的另外的实施方案。

可以以孢子或细胞的形式，将火烧顶极微生物接种待修正的土壤。可使用火烧顶极微生物的单一株或多株混合物。或者，直接将含火烧顶极微生物的木炭颗粒添加到土壤中，而不分离木炭中的火烧顶极微生物，或仅最小量的培养和处理木炭中的微生物。可通过例如喷洒含火烧顶极微生物的粉末或液体悬浮液，或通过喷洒含火烧顶极微生物的木炭颗粒，完成土壤的接种。

本发明已鉴别存在于土壤中的某些火烧顶极微生物提高生长于此土壤中的植物的生长和生产力；火烧顶极微生物生活于植物中和生存于由植物的碳化产生的木炭中。碳化的木材具有促成生态系统复原的关键的物理和化学特性。除储藏微生物之外，碳化的木材还含多种化学催化剂。碳化木材的纳米特性产生无限的表面，用于维持生命的化学反应，形成无数捕捉和释放气体的小室。结果是在植物生命的有机残余和微生物的恢复活性之间形成了深厚的、高度演化的界面。碳化木材的一个希望的特性为它包含连接的水和非水环境，喷洒可在许多不同的氧化还原电位下提供和接受电子的新公认的催化剂。因此该复杂的、尚未被理解的基质滋养相互连接的微生物的复杂集落。作为一个简单的实例，兼性厌氧菌在缺乏O₂的情况下，由于N₂被还原为氨释放H₂，而当将电子转移到O₂时，在碳化木材微粒周围的需氧菌可使用H₂还原CO₂，因此创造有利于N₂固定的缺氧环境。存在于碳化木材中的广义芽孢杆菌(Bacillus sensu lato)属可实现所有的这些功能。

本发明已独特地认识到了木炭的价值。根据本发明，可将木炭用作火烧顶极微生物的载体，使火烧顶极微生物从一个生态系统移位到另一个生态系统，和使土壤的植物生长促进性质从一个地理位置转移到另一个地理位置。例如可通过木炭，将在溢价酒制备区中的合适细菌转移到其它的所选择的地理位置。

根据本发明改良的土壤不依赖于商品肥料和杀虫剂而支持植物生长，不造成环境污染。此外，火烧顶极微生物的固碳性质允许大气中的碳被固定于土壤中的有机化合物中，除去空气中的二氧化碳，提高土壤中的碳贮藏。

因此，在还一个实施方案中，可使用本发明的火烧顶极微生物，提高植物的太阳能转换，通过提高植物的矿物质营养素利用的效率，减少环境污染。该提高效率的基础是火烧顶极微生物提高植物根部生长的能力。更大的根对土壤的水和矿物质营养素提供更大的通路。这些限制性因素的增加，提高了太阳能到植物生物量的光合转化。在80％的美国农业栽培面积上，促进25％的植物生长可增加总碳贮藏量，和因此增加20％的潜在的生物量产生。该技术的另一个益处为减少肥料的沥取，这些肥料常毒害地下水，促进表面水流的富营养化。

通过以下实施例，进一步举例说明本发明。

实施例

实施例I.在豆科灌木木炭中新火烧顶极菌株的鉴别

培养物在燃烧豆科灌木获得的豆科灌木木炭中成长。由较大的木炭片分离出直径约2mm-15mm的细微的粉尘状木炭颗粒。通过以下步骤从CP-1(豆科灌木木炭的来源)细粉分离细菌：使250ml的TY琼脂培养基在烧瓶中以15lb/in²高压灭菌45分钟，从高压灭菌器取出培养基，当灭菌的琼脂温度为约200℉时，通过将5g未灭菌的CP1＂细粉＂添加到250ml溶液中，制备2％的木炭悬浮液。振荡烧瓶，以混合悬浮液，将20ml含木炭的琼脂培养基倾入每个90-mm培养皿中。将板在室温下冷却，使琼脂固化。在28小时之后，细菌和真菌菌落在板上发育。在72小时之后，挑选14个细菌菌落，将细菌菌落转移到新鲜的TY琼脂板。14个菌落中的12个在第二组板上生长。这12个菌落再在第三组TY琼脂板上传代。将起源于第三代的菌落的16S rDNA部分测序(Midi实验室，纽华克市，特拉华州)。

图1显示最接近的细菌序列匹配和相应的百分序列差异。4个分离株CP1-2、CP1-6、CP1-13和CP1-14不可鉴别。＂最接近的匹配＂指这些分离株各自的序列差异>5％，因此推断不可能相同。图2显示四个不匹配的分离株找到的最接近的GenBank序列匹配。没有发现CP1-2、CP1-6、CP1-13和CP1-1416S rDNA序列与在GenBank中的任何序列匹配大于97％。

实施例II.杏树木炭中的新火烧顶极菌株的鉴别

检测来自杏树木炭的29个分离株的16S rDNA序列。在这些分离株中，1个被鉴别为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)。此外，19个分离株是不同的，8个被鉴别为种水平(≤1％差异)，6个与已知属菌差异1％-≥5％，3个与已知属菌差异>5％。序列鉴别表见图3A-3C所示。

部分的16S rDNA序列分析显示，在图3B中命名为“C17304AC23con”的杏树木炭分离株与中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)有0.29％的差异，与HAB7相似。HAB7是从土壤分离的菌株，如在实施例III中所进一步描述的。也发现C17304 AC23con与HAB7一样，在25mg/L大观霉素、1mg/L四环素和2.5mg/L氯霉素的组合中生长。

实施例III.碳化道格拉斯冷杉(Douglas Fir)木材和树皮屑以及从碳化的材料分离火烧顶极微生物的方法

将最近伐倒的道格拉斯冷杉树切割成14＂段。用20＂链锯，将树皮组织(即韧皮部)和木材(即木质部)分别撕碎和收集。按1:1的比率将两种植物组织混合在一起，在70℃干燥过夜，储存于密封的玻璃广口瓶中备用。

把10g的混合组织装在一系列的2＂直径的陶瓷坩埚中。将具有程控温度控制和5＂(W)×4＂(H)×6＂(D)室的F47920-80型240 V BarnsteadInternational马弗炉用于在该实施例中所述的所有实验中。用可在1093℃持续运行或在1200℃间歇运行的该炉子模仿林火的情况。将炉子预热到600℃，将各坩埚置于炉子中持续不同的时间。当将坩埚置于炉子室中时，温度暂时下降到约585℃，然后返回到600℃。在4分钟之后，炉子温度增加到605℃，持续几分钟，同时黑烟从顶部通风口冒出。在5、10和15分钟之后取出坩埚，冷却，用铝箔覆盖。在每个时间段分别处理两个坩埚。将一个用于分离微生物；将另一个照相。在该实施例中所报道的所有实验涉及仅将一个坩埚置于炉子中，持续特定的时间，以达到一致的碳化。

经过不同时间处理的样品的物理特性相当不同。如通过干重的减少所估算的，在600℃ 5分钟之后取出的样品被碳化了约50％，许多木片未变黑。在炉子中保持10或15分钟的那些样品完全变黑，质量减少80-90％。在600℃ 10或15分钟之后，无片保留自然的木材颜色。

从处理不同时间的样品获得的细菌分离株的数目不同。当它从约100℃的高压灭菌器中取出时，通过将每个碳化样品悬浮于250mL的热消毒TY培养基中，来分离细菌。将悬浮液剧烈地振荡，然后从各混合物倾倒到12个100mm培养皿中。在20-25℃温育4天之后，观察板，从41个细菌菌落中挑选14个，用于通过16s rDNA测序的鉴别。大多数分离株属于传统的杆菌样细菌。然而圆红球菌(Rhodococcus globerulus)是与土壤微生物如链霉菌属(Streptomyces)更密切相关的放线菌(表1)。计数清晰地显示：600℃ 10分钟为在这些实验中从木材分离火烧顶级微生物的最佳条件。木材和树皮组织的其它组合可具有不同的热特性，这可产生改变的最佳条件。其它种的木材可包含另外属的细菌。

如所示，根据本发明，样品自身的物理特性非常重要，其中因为样品的数目、形状、大小和一致性将影响外部热量多快地转移个整个样品。

样品中所包含的水分或样品周围的空气也将改变碳化物的特性，因为水的高热量汽化使用高能量，以将水从液相转化成气相(即煮沸)。因此相对百分湿度和海拔高度(即大气压)可改变碳化率。

炉子的热设置和暴露时间也会影响碳化率。恒温的数值是重要的。与较低的温度相比，较高的温度将加速碳化。只要样品灼烧，在较低温度下的较长时间可等同于在较高温度下的较短时间。温度的程序化改变也将为相似的碳化状态产生不同的条件。

表1.由10g的道格拉斯冷杉组织产生的菌落形成单位(CFU)。

 

600℃下的时间(min)	细菌菌落(cfu/10g组织)	真菌菌落(cfu/10g组织)	由16S rDNA鉴别的细菌属 (即与标准株的差异<1.00％)
				0	0	0	不适用
5	0	1	不适用
				10	41	0	解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)、中间短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)。
15	0	0	不适用

也从其它形式的碳化有机物质分离细菌。可市购的鱼肉样品为海洋有机废物的形式，可在许多有机园艺商店中找到，在分离并通过16SrDNA的部分测序鉴别细菌(表2)之前，将鱼肉样品在600℃加热并悬浮于95℃ TY琼脂中。也将与MicroSeq数据库偏离超过1％的序列与GenBank数据库比较。在不同时间恢复的分离株互相排斥。

表2.从海洋有机废物分离的细菌

实施例IV.土壤的火烧顶级微生物培养

从砂质粘土土壤样品(加州中部大农场，加州)中生长培养物，以鉴别存在于样品中的微生物能产孢子。为了该目的，通过悬浮等体积的土壤和水，制备2.0ml的溶液，将该溶液置于沸水浴中3分钟，然后将等分试样(如0.5ml)接种在琼脂TY培养基(Difco Bacto胰蛋白胨(5g/l)、Difco Bacto酵母提取物(3g/l)和CaCl₂(1.3g/l)以及Difco Bacto琼脂(15g/l))。

经过这些方法最初分离的细菌通过500碱基对16S rDNA测序，鉴别为需氧的形成内生孢子的细菌属。这些分离株被鉴别为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(Midi实验室，纽华克市，特拉华州)。图4显示样品DAP-1至DAP-6中的每一个的最接近的细菌序列匹配和样品株与最接近的匹配之间相应的百分序列差异。DAP-2(本文也称为HAB7)被测定为中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)。

发现HAB7具有对多种抗生素的抗性，在25mg/L大观霉素、1mg/L四环素和2.5mg/L氯霉素的组合存在下，能够在富含琼脂培养基(TY)上生长。根据部分的16S rDNA测序，发现HAB7与中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)有0.29％的差异，表明属匹配。如图5所示，HAB7获得的完整的16S-rDNA序列还指示与中间短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)有0.10％的差异。

实施例IV.菌株HAB7和AC9对植物生长的影响

在两个研究中评估了HAB7促进总体植物生长的能力。在第一个研究中，使用不同的土壤处理，包括高(100-11.25-151b/ac)和低(30-11.5-151b/ac)NPK的组合，有和无2×10⁹CFU/ft²的HAB7，将小麦种子种植于试验田中。在种植两天之后处理土壤，在种植四个月之后收获。在表3中详细说明的5个条件中的每一个下，栽培三个相邻的试验点，每个试验点为3英尺×5英尺。因此，使用了共15个试验点，表中显示的每个数字代表经过同样处理的三个试验点的平均值。在每个试验点的中心收获1×3ft²的面积。发现存在高或低NPK时，HAB7显著增加种子产量。未测量根部生长。处理和结果显示于表3中。

表3

 

处理	枝条干重(g/3ft2)	种子产量(g/3ft2)	N含量(％)	蛋白质含量(％)	收获的总N(mg)
						未处理的对照	230	46	1.57	9.81	722
低NPK(30-11.25-151b/ac)	270	63	1.39	8.69	876
						高NPK(100-11.25-151b/ac)	375	94	1.48	9.25	1391
低NPK+HAB7	292(+8％)*	87(+38％)*	1.41	8.81	1227
						高NPK+HAB7	437(+16％)*	127(+35％)*	1.67	10.44	2121
LSD0.05#	53	17

^*相对于单独肥料处理，HAB7的效果是显著的(P<0.05)。

^#所有处理的LSD0.05测量值显著不同。

如表3所示，将HAB7添加到低NPK，导致枝条干重增加8％，种子产量增加38％。将HAB7添加到高NPK，导致枝条干重增加16％，种子产量增加35％。也测得在生长于HAB7/高NPK处理土壤的小麦植物中，氮大量增加。

在第二个研究中，通过在存在或缺乏HAB7时，用高或低的NPK播种，使一年生黑麦草生长，来测量在所有根可回收的区域中最精确评估的根部生长。将草种植于64个10英寸的区域中。按2×10⁹CFU/ft²将HAB7细胞供应到每个HAB7处理的区域中。在种植28天之后，在根生满区域之前，收获草。在开花之前收获植物，因此未测定种子产量。将植物干燥之后，去除所有的沙、沙砾和碎屑，将植物分成枝条和根。该实验的处理和结果见表4所示。该表显示存在HAB7时根生长增加11％(P≤0.05)，提供组合的HAB7/高NPK处理时根生长增加33％(P<0.05)。

^*“NPK”表示氮、磷和钾。后面有不同字母的值显示HAB7相对于适当对照的显著效应(p<0.05)。

也显示AC9以及HAB7与AC9的混合物促进营养素丰富的盆栽土壤中的植物生长。在表5中给出了来自两个实验的代表性数据。未接种的对照植物的变异反映在该年的不同月份中改变温度和光照。

实施例VI 木炭对细菌生长的影响

用HAB7容易地证明木炭对代表性微生物生长的促进作用。使HAB7生长于不含添加剂或含1.5％压碎的豆科灌木木炭(＂CP-1＂)的TY细菌培养基中。在接种之前将所有的培养基调节至pH6.74。在接种后第0、3和5天，用标准稀释技术，按照在TY琼脂板上的菌落形成单位(CFU)将细胞计数。刚接种后的细胞密度为5×10⁴CFU/ml。结果显示：与未处理的对照培养物相比，在第3天木炭已提高细菌生长约20倍，在第5天已提高细菌生长约8倍(图6)。每次处理使用三个重复培养物测定的第5天效果是非常显著的(P≤0.01)。在每次处理中用一个重复培养物测定第3天的效果。

在类似地进行的实验中，试验了较低(0.375％)和较高(3％)浓度的压碎木炭，显示与未处理的对照培养物相比，1.5％的木炭提高了细菌生长，然而较低浓度对生长没有显著影响，但显著减少了孢子形成。3％木炭处理比1.5％浓度木炭对细菌生长具有更大的促进作用，并形成了更少的孢子。将接种后3天测得的数据显示于表6。在第3天通过它们的延缓发育和较小的菌落大小，来鉴别由孢子而不是由营养细胞发展的菌落。

统计对比：            总细菌           孢子的集落％

1.5％和3.0％对TY      P<0.001          P<0.01

0.375％对TY           不显著           P<0.05

1.5％对3.0％          P<0.05           P<0.01

实施例VII.HAB7的碳固定

检测了HAB7结合¹³CO₂的¹³C的能力。将培养过夜并生长36小时的2％的HAB7接种物添加到9个50-ml锥形瓶中，每个锥形瓶含25ml的无菌TY液体培养基。将培养物置于摇床上，145rpm，25℃。用橡胶隔片将所有的锥形瓶密封。三个重复的锥形瓶含约0.042％ CO₂的常压CO₂(1.085原子％¹³C)。用60-cc注射器将¹³C-碳酸氢钠(98原子％¹³C)与2NHCl产生的5％¹³CO₂加到6个重复锥形瓶中。在12、18和36小时之后，从每个锥形瓶收集5ml等分试样，在Eppendorf管中通过离心去除细菌细胞。打开锥形瓶，暴露于空气中，然后在无菌超净台中将锥形瓶重新密封，在取样的每个时间点，用5％¹³CO₂充满标示5％CO₂的那些锥形瓶。将Effendorf管中的样品冷冻干燥，用¹²C/¹³C同位素比率质谱法，分析样品的¹³C含量。计算相对于标准对照1.08504原子％¹³C的¹³C变化，报道为Δ¹³C原子％。通过比较对标准TY培养基的细胞稀释计数与对含对HAB7有选择性的三种抗生素混合物的TY计数，在结束实验时排除了HAB7污染的可能性。对于每个锥形瓶，两种培养基的数据(CFU)相似。

如图7所示，HAB7细胞结合CO₂到约0.25％的总碳水平(黑色圆形)。在12-18小时的¹³C含量的增加和在12-36小时的¹³C含量的增加是非常显著的(p≤0.001)。与周围大气的CO₂(空心三角形)相比，增加的CO₂浓度(黑三角形)在T₁₂(12小时)时增加了50％的细胞生长(质量)(P≤0.01)，在T₃₆(36小时)时增加了12％的细胞生长(质量)(P≤01.01)。

实施例VIII.木炭中的火烧顶级微生物的固碳作用

试验已确定，存在于豆科灌木木炭中的火烧顶级微生物(CP-1)明显结合CO₂(表4)。用以下物质接种各含25ml无菌TY液体培养基的锥形瓶(50-ml大小)：1)在周围CO₂存在下的高压灭菌CP-1，以定量木炭对背景¹³C吸附的任何物理影响，或2)在5％¹³CO₂存在下的高压灭菌CP-1，以定量木炭对高度标记的¹³CO₂(98原子％¹³C)的¹³C吸附的任何物理影响，或3)在5％¹³CO₂存在下的非无菌CP-1，以定量CP-1中的微生物对从高度标记的¹³CO₂(98原子％¹³C)摄取CO₂的任何影响，或4)在5％¹³CO₂存在下的用HAB7接种的无菌CP-1，以将已被证明的这些细菌摄取CO₂的能力与该实验中的其它处理关联起来。因此CO₂水平是周围的0.42％ CO₂(1.08515原子％¹³C)或5％CO₂(98原子％¹³C)。在整个72小时实验中烧瓶保持密封。在研究结束后，将取自处理1和处理2的烧瓶的样品接种到TY培养基上，以确认在¹³C分析之前无菌。在72小时结束后，将处理3和处理4的烧瓶高压灭菌，然后将每个这些烧瓶中的细菌悬浮液过滤，分离木炭。在¹³C分析之前，在75℃将木炭干燥。通过细菌悬浮液离心，收集处理3和处理4的细菌(和一些CP-1)，在¹³C分析之前在热灯下干燥。用¹²C/¹³C同位素比率质谱法，测定每个样品的¹³C含量。计算相对于含1.08504原子¹³C的标准参照的¹³C变化，报告为Δ¹³C原子％。

数据显示：CP-1微生物结合的CO₂的水平显著大于无菌¹³C对照(P<0.01)，与HAB7处理后测量的那些相似，在实施例VII中证明它是结合CO₂的生物体。

实施例IX.二氧化碳对HAB7生长的促进

评估了CO₂对HAB7生长的影响。使用生长于TY培养基中的过夜HAB7培养物，提供50ml烧瓶中的2％接种物，各烧瓶含25ml的TY和在液体上的30ml空气。在T₀(接种时间)、T₁₅(接种后15小时)、T₃₆(接种后36小时)和T₄₂(接种后42小时)，通过稀释接种到TY琼脂培养基上，计数菌落形成单位(CFU)。在接种后和在每次取样后，调节液体上空间的空气中大气CO₂，以基于体积包含大气(约0.042％)、5％ CO₂或9.8％CO₂。在通过离心收集细胞后T₄₂，称重细胞产物。数据见表8所示。在对数生长期(T₁₅)，5％和9.8％CO₂处理显著增加CFU/ml，但在42小时取样时间，9.8％ CO₂显著减少CFU/ml。

这些结果可被解释为显示：在对数生长期，另外的CO₂刺激脂肪酸的合成和膜的形成，但最高的CO₂处理最终增加了细胞的死亡率。在实验初期在含有额外CO₂的烧瓶中，用额外的膜增加细胞数量。因为TY培养基是这样的丰富，无底物限制，所以当细胞呼吸产生足够的CO₂以支持优化的膜合成时，对照处理达到升高CO₂的烧瓶。干重数据提示：在对照处理中的细胞比在较高CO₂中生长的培养物产生更多的多糖。

*与对照有显著差异，P≤0.05。

实施例X.土壤生成调节剂增加植物的维生素E含量

在从常规生长的植物和生长于木炭处理的土壤中的植物得到的植物产品中，测定维生素E(α-和γ-生育酚)的水平，以评估本发明的组合物和方法对植物营养性质的影响。

分析两种杏仁坚果样品(每种重复三次)。一种样品的商标为＂加州钻石＂，在数据表中称为＂钻石＂。已在前两年中的每一年，按200磅/英亩的比率，用如实施例I所述制备的商品木炭处理土壤，从在加州中部大农场(＂加州中部＂)在该土壤中生长的树收获成批杏仁，从该杏仁获得第二种样品。在咖啡研磨器中，将杏仁样品(6盎司/样品)磨成粉末，将该粉末呈交到商业实验室(阿纳海姆公司的分析实验室，阿纳海姆市，加利福尼亚州)，分析生育酚的含量。用甲醇提取杏仁＂糊＂，使用HPLC分离生育酚，使用LC-MS(液相色谱-质谱)法分析生育酚并与标准品比较。

在各样品中观察到的生育酚水平见表9所示。加州中部大农场杏仁的α-生育酚含量比钻石杏仁高39％(P≤0.05)。加州中部大农场杏仁的γ-生育酚含量比钻石杏仁高200％(P≤0.01)。

以下文献已描述了用于评价植物产品中生育酚含量的其它方法：例如Guitierrez等，1999，＂生态栽培对初榨橄榄油品质的影响＂，J.Amer.Oil Chemists Soc.76：617-621和Martinez，J.M.等，1975，＂关于Abencor产量分析仪用途的报告，＂Grasas Aceites 26：379-385。

实施例XI.HAB7增加莴苣的植物化学成分含量

使用含Ace Potting土壤的2加仑的盆，在Caspar温室中种植Buttercrunch莴苣。8个盆中的4个接种HAB7。发芽后各盆减到两株植物。在约2个月内收获植物，称重，当运送到实验室分析时，在冰上或在冷藏条件下冷却。从各处理物中挑选大小相等的莴苣头，用于维生素分析。使用原始值和对数转化值，用双向方差分析检验所有的数据。

结果显示：收获的总生物量(2头/盆)在对照和HAB7处理之间无显著差异。将各盆中的较大的莴苣头用于测量维生素的含量，对照和HAB7处理的盆中的那些头的平均值(±SE)分别为163±17和159±16。

生长于HAB7处理的盆中的莴苣的维生素C含量增加超过50％，总维生素E含量(α-生育酚和γ-生育酚)增加超过80％。

 

处理	维生素C(mg/100g)	总维生素E(μg/100g)
			无	8.5	37
HAB7	13.3(+56％)P≤0.05	67.3(+82％)P≤0.05

实施例XII.尿素对HAB7的影响

通过在存在尿素时培养HAB7，测试尿素对HAB7的生长和存活的影响。

基于施用200磅氮/英亩的常规耕作实践，计算出100mM尿素为有可能短暂地存在于正常土壤的顶部一英寸的浓度。将HAB7接种至TY培养基中，在室温下生长过夜至约1×10⁷CPU/ml。

将过夜培养物接种至含TY(3个烧瓶)或TY+100mM尿素(3个烧瓶)的烧瓶(200μl过夜培养物/烧瓶)中。在30小时之后，由6个烧瓶中的每1个制备10倍稀释系列，且将各稀释管的1份50-μl等分试样接种至TY琼脂上。将从各50-μl小滴发育的菌落形成单位(CFU)计数，用于计算在各烧瓶中活细胞的数目。使用Student检验，比较尿素处理效果的平均值±标准误差。

图8显示在存在或缺乏尿素时，在30小时之后细菌密度增加。在TY中，细菌经过多于12次的倍增，但在存在100mM尿素时，发生了少于5次的倍增。结果，含尿素烧瓶的HAB7细胞数比对照烧瓶的HAB7细胞数少1％。在该实验(t＝2.91，n＝4)中，尿素的影响是显著的(P≤0.05)。

与烧瓶稀释同时，由过夜培养物自身制备10-倍稀释液系列。将过夜培养物不同稀释液的3个独立50μl等分试样接种至分开的琼脂板上，该琼脂板含TY或TY+100mM尿素。

接种实验显示：58％的过夜培养物细胞不能在TY琼脂+100mM尿素板上生长。例如，10^-4稀释板在TY上产生50.0±5.5菌落，而在TY+100mM尿素上产生21.3±3.2菌落。此实验中(t＝4.51，n＝4)尿素影响显著(P≤0.05)。

因此，用于通常耕作实践的浓度的尿素不利地影响HAB7细菌的生长。

实施例XIIII.土壤生成调节剂对植物类黄酮含量的影响

也可将本文公开的微生物有机体和碳源用于增加植物的植物化学成分含量，特别是异类黄酮，例如植物雌激素和其它的类黄酮。植物可生长于用碳源如豆科灌木木炭修正的土壤中。然后可用微生物有机体修正土壤，如中孢芽孢杆菌(Bacillus centrosporus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。也可将微生物有机体的组合用于在土壤中有核土壤生成。在可见的生长之后，分析植物根部和植物多叶物质的植物化学成分的含量，包括异类黄酮和类黄酮的含量。

可如以下文献所述测定类黄酮的含量：Ren，H.，等，2001，＂使用水溶性壳聚糖作为土壤改良剂和叶表面喷雾剂，无农药和有机栽培的绿色蔬菜的抗氧化活性和抗诱变活性及多元酚含量＂，J.Sci.Food Agric.81：1426-1432。收获生长于根据本发明的方法制备的土壤或植物栽培培养基中的蔬菜，在冷藏容器内将蔬菜转移到实验室进行分析，与生长于未修正的土壤中的参比试样蔬菜比较。从各品种的5-20个样品(各蔬菜共1.5-2.0kg)，随机切掉一部分蔬菜体(各50-60kg)，以消除个体差异。用流动的自来水和纯水清洗样品，用纸巾擦，用榨汁机(MJ-C29型，Matsushita电气公司，神户，日本)处理。将汁液在5℃下，各自以3800×g和然后13500×g离心10分钟，以除去细粒。为了微生物测定，将上清液通过辐射灭菌的膜(孔径0.45μm，Toyo Advantec，东京，日本)过滤。将所有样品均贮藏在-80℃无菌管形瓶内，供多元酚含量分析用。

如Vazquez，A.等，1973，＂Determinacion de los Polifenoles Totalesdel Aceite de Oliva(橄榄中总多元酚和二酚的测定)＂，Grasas Aceites 24：350-357所述，可使用Folin-Deni试剂或钼酸铵，通过比色法测定总多元酚和邻二酚。可使用用于液相色谱/质谱(LC/MS)的QP-8000α(岛津，日本京都)仪，结合STR ODS-II半微量柱(150mm×2.1mm同上，ShinwaChemical Industry，日本东京)，测量各类黄酮的水平。作为流动相，0.2％醋酸溶液(A)和甲醇(B)可经过柱子，具有(1)30-50％ B(0-5mm)，(2)50-90％ B(5-10mm)，(3)90％ B(10-15mm)，(4)30％ B(15-25mm)的梯度曲线。

用作校准标准品的纯试剂(例如咖啡酸、橙皮苷、橙皮素(hesperitin)、杨梅黄酮、槲皮素、槲皮黄素、芹菜苷配基和黄岑素)可例如从Sigma Chemical(圣路易斯市，密苏里州，美国)购买得到。将它们分别溶于甲醇中，然后在30％甲醇中配制成合适的浓度。以0.2ml/min的恒定流速进行色谱分析。注射的样品体积为5μl，柱子保持在40℃烘箱中。将常压化学电离(APCI)用于界面，将氮气流调节到2.5升/min，作为雾化器气体。在通过与标准品比较的保留时间和通过从MS检测器获得的分子量信息，鉴别各化合物之后，使用由选择性离子监测获得的单点绝对校准曲线，进行定量测定。

由在至少3个不同的月份内独立收获的蔬菜制备试样。使用在3个不同的月份制备的蔬菜汁，每个试验重复两次，将获得的6组数据用于评价各样品的生物活性和化学成分。使用Student t检验，可测定试样和参比试样之间的统计学显著差异。

实施例XIV.植物营养素、植物化学成分和细菌抗原对先天免疫系统活性的影响

用本文公开的方法和组合物，从生长的植物中分离的微生物抗原、植物营养素和植物化学成分，也可用于提高哺乳动物的免疫系统活性。例如，微生物抗原或营养素和植物化学成分(包括异类黄酮和类黄酮)可从植物根部或植物物质样品分离，可喂养大鼠或小鼠。或者，植物提取物可从使用本文公开的方法和组合物生长的植物制备，可喂养大鼠或小鼠。可通过监测免疫系统活性，包括通过增加IgA的生成而激活先天免疫系统，或刺激先天免疫系统中的toll-样受体，来测定效果。可通过测量受试者血液中的免疫蛋白包括溶菌酶和乳铁蛋白，来评价先天免疫性(Bard，E.，等，2003年2月，Clin.Chem.Lab.Med.41(2)：127-33)。

可将血液样品收集在干燥管中，立即放置在冰上，在4℃、1000×g下离心10分钟澄清。将抑肽酶(0.0025％)和叠氮化钠(0.1％)添加到上清液中，在-20℃贮藏200μl的等份试样备用。

通过将＂唾液收集专用离心管(Salivette)＂(Sarstedt，Orsay，法国)放置在口史泰侬(Stenon)管轴线上牙龈和颊之间，在口的一侧持续5分钟，然后放在另一侧，可获得唾液样品。将所得的唾液立即放置在冰上，通过在4℃、1000×g下离心10分钟澄清，以从＂唾液收集专用离心管＂分离唾液。将抑肽酶(0.0025％)和叠氮化钠(0.1％)添加到上清液中，在-20℃贮藏200μl的等份试样备用。

可将粪便样品收集在1升的塑料广口瓶中，在收集后2小时内、将它们转移到实验室之前，在4℃冷藏。称重粪便的鲜重，以测定粪便的蛋白质排出量。使用稀释三倍的样品测定粪便的蛋白浓度。为了提取粪便的蛋白质，在4℃，用10ml的NaCl(0.15M)，用磁力搅拌器，强烈地振摇5g匀化粪便1小时。在4℃，3000×g离心10分钟之后，将叠氮化钠(粪便浓度0.1％重量/体积)和苯甲基磺酰氟(PMSF)(终浓度为5mM)添加到粪便提取物中。叠氮化钠是微生物增殖的抑制剂，PMSF则是消化酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶)和细菌的抑制剂。然后将粪便提取物分配在200μl试管中，在-20℃冷冻。

可使用Belec等所述的灌洗技术获得子宫颈-阴道分泌物。用移液管将3毫升的无菌磷酸盐缓冲水溶液(PBS)放置入阴道中。在流出和逆流周期各持续60秒之后，收集2-3ml的流体。将该样品在4℃，1000×g离心10分钟。将上清液用于测定Lz和Lf，而将含细胞和其它粘液的片状沉淀物冷冻，以待以后研究。通过Hem Check 1检验，可排除血液污染的可能性。通常可将稀释系数用于子宫颈阴道灌洗。

通过时间分辨的免疫荧光测量法(TR-IFMA)，测定所收集的血清、唾液、粪便和子宫颈阴道分泌物中的Lz和Lf的测量值。涂覆MicrowellImmuno板(Microwell Maxisorp，Life Technologie，法国)，在K₂HPO₄缓冲液(50mmol/L，pH8.5)中，在4℃下，与5mg/L浓度人Lz的纯化IgG(兔抗人Lz纯化的多克隆IgG，Dako，Dakopans，丹麦哥本哈根)、5mg/L浓度人Lf的纯化IgG(兔抗人Lf纯化的多克隆IgG，Dako)一起温育过夜。通过将板与阻断溶液(50mmol/L Na₂HPO₄，1％小牛血清白蛋白(BSA))一起温育，阻断非特异性蛋白结合位点。将试样和标准纯化的Lz(7个水平：1.02；2.55；4；6.4；10；16和25μg/L)或Lf(8个水平：1.02；2.55；6.4；10；16；40和100μg/L)(人乳Lz，Sigma，Bourgoin Jallieu，法国；人乳Lf，Sigma，Bourgoin Jallieu)的系列稀释液(比率2.5)添加到孔中。按3个不同的浓度(以标准试验线性浓度)，将空白和阳性对照(人乳Lz、人乳LU)有条理地添加到所用的各板中。在平稳搅拌、实验室温度下将板温育2小时。用自动板清洗器将它们清洗6次，然后在平稳搅拌下，按250μg/L兔抗人Lz生物素的浓度或250μg/L兔抗人Lf/生物素的浓度，与生物素缀合的IgG一起温育2小时。按100μg/L的浓度，将与铕缀合的链霉亲和素(用铕标记的链霉亲和素，Delfia^TM，Wallac，土尔库，芬兰)添加到孔中，在室温、平稳搅拌下温育2小时。在用自动板清洗器清洗6次之后，通过添加增强溶液(Delfia，Ref.1244-104，Wallac，土尔库，芬兰)开始反应，在搅拌下持续10分钟。用Victor 2荧光计(Wallac 1420多标记计数器，土尔库，芬兰)在615nm处读取荧光信号。用软件(Multicalc2000^TM，Wallac，土尔库，芬兰)分析数据。参照标准曲线测定定量结果。考虑到为TR-IFMA技术的稀释，用稀释系数校正浓度。

可测定各蛋白质的相对排泄系数(RCE)，以比较在人排泄物中蛋白质排泄的参数，确保与其它类物质比较。RCE表示相对于白蛋白排泄率的蛋白质排泄率，白蛋白完全通过被动扩散从血浆得到。涉及白蛋白的RCE仅适用于流体，其中白蛋白不被酶即唾液和子宫颈阴道分泌物降解。因此，将涉及AAT的RCE用于粪便样品。根据下式获得RCE：[(血清中的白蛋白或AAT)/(流体中的白蛋白或AAT)]/[(血清中的蛋白质)/(流体中的蛋白质)]。分泌和渗出之间的限度(截止点)等于1(白蛋白或AAT的RCE)。在该限度以下，从血清房室发生渗出，然而RCE大于1证明主要为局部分泌，伴有少量的渗出。

结果可表示为均值±均值的标准误差(SEM)、中值和范围值。通过Mann-Whitney U检验建立了分泌物之间的均值比较关系。显著差异可设定p值等于或小于0.05。使用PC版StatView^TM软件(SAS Institute公司)进行统计分析。

Claims (59)

1.一种制备适用于火烧顶极微生物分离的碳化有机材料的方法，所述方法包括在使碳化进展到恰好在所述火烧顶极微生物的所述孢子消失之前的程度的条件下，将含有所述火烧顶极微生物孢子的有机材料加热。

2.权利要求1的方法，其中所述加热在约1BTU远离将导致所述火烧顶极微生物的所述孢子消失的条件的条件下进行。

3.权利要求2的方法，其中所述加热在约600℃进行约10-约15分钟。

4.权利要求1的方法，其中所述有机材料为植物材料或海洋废物材料。

5.权利要求1的方法，所述方法还包括从产生的碳化材料回收所述火烧顶极微生物的所述孢子。

6.一种从碳化的有机材料制备火烧顶极微生物的方法，所述方法包括：

a.用含有所述火烧顶极微生物孢子的碳化有机材料，接种生长培养基；

b.将所述生长培养基温育，以允许所述孢子开始营养生长，因此产生所述火烧顶极微生物。

7.权利要求6的方法，其中所述碳化的有机材料为碳化的植物材料。

8.权利要求7的方法，其中所述碳化的植物材料为木炭。

9.权利要求8的方法，其中所述木炭为豆科灌木木炭或杏仁木炭。

10.权利要求6的方法，其中所述碳化的有机材料为碳化的海洋有机废物。

11.权利要求6的方法，其中通过将所述有机材料在约600℃加热至少10分钟，来制备所述碳化的有机材料。

12.权利要求6的方法，所述方法还包括：

c.从所述生长培养基分离所述火烧顶极微生物。

13.权利要求6的方法，所述方法还包括：

c.从在所述生长培养基中产生的所述火烧顶极微生物，分离单一株。

14.一种从土壤样品分离火烧顶极微生物的方法，所述方法包括：

a.将所述土壤样品与水混合，获得液体悬浮液；

b.使所述液体悬浮液沸腾；

c.用沸腾的悬浮液等分试样，接种生长培养基；和

d.维持所述生长培养基，以允许所述火烧顶极微生物在所述培养基中的营养生长。

15.权利要求14的方法，所述方法还包括：

e.从所述生长培养基分离所述火烧顶极微生物。

16.权利要求14的方法，所述方法还包括：

e.从在所述生长培养基中产生的所述火烧顶极微生物，分离单一株。

17.一种包含火烧顶极微生物的组合物，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，且产生在约600℃的温度存活的孢子。

18.权利要求17的组合物，其中从碳化的有机材料、土壤或其混合物，分离所述火烧顶极微生物。

19.权利要求18的组合物，其中所述火烧顶极微生物根据权利要求6或14中任一项的方法制备。

20.权利要求17的组合物，其中所述火烧顶极微生物为广义杆菌(Bacillus sensu lato)。

21.权利要求20的组合物，其中所述火烧顶极微生物包含HAB7、AC9或其组合。

22.一种分离的火烧顶极微生物，所述火烧顶极微生物为需氧菌，且产生在约600℃的温度存活的孢子。

23.权利要求22的分离的火烧顶极微生物，其中从木炭、土壤或其混合物中分离所述火烧顶极微生物。

24.一种分离的火烧顶极微生物，所述微生物命名为HAB7或AC9。

25.一种鉴别能促进植物生长的火烧顶极微生物的方法，所述方法包括：

a.用含有火烧顶极微生物孢子的碳化有机材料，接种生长培养基；

b.将所述生长培养基温育，以允许所述孢子开始营养生长，因此产生所述火烧顶极微生物；

c.从在步骤b中产生的所述火烧顶极微生物，分离单一株；

d.测定所述单一株促进植物生长的能力；和

e.鉴别促进植物生长的火烧顶极微生物株。

26.权利要求25的方法，其中所述碳化的有机材料为碳化的植物材料。

27.权利要求26的方法，其中所述碳化的植物材料为木炭。

28.权利要求27的方法，其中所述木炭为豆科灌木木炭或杏仁木炭。

29.权利要求25的方法，其中所述碳化的有机材料为碳化的海洋废物。

30.权利要求25的方法，其中通过将所述有机材料在约600℃加热至少10分钟，来制备所述碳化的有机材料。

31.一种鉴别能促进植物生长的火烧顶极微生物的方法，所述方法包括：

a.将含有火烧顶极微生物孢子的土壤样品与水混合，获得液体悬浮液；

b.使所述液体悬浮液沸腾；

c.用沸腾的悬浮液等分试样，接种生长培养基；

d.将所述生长培养基温育，以允许所述孢子开始营养生长，因此产生所述火烧顶极微生物；

e.从在步骤d中产生的所述火烧顶极微生物，分离单一株；

f.测定所述单一株促进植物生长的能力；并鉴别促进植物生长的火烧顶极微生物株。

32.一种刺激植物生长和生产力的方法，所述方法包括使植物的栽培变种在补充至少一种火烧顶极微生物的植物栽培培养基中生长，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，并产生在约600℃的温度存活的孢子。

33.权利要求32的方法，其中所述植物栽培培养基也补充碳化的植物材料。

34.一种提高植物产品的营养素或植物化学成分含量的方法，所述方法包括使植物的栽培变种在补充至少一种火烧顶极微生物的植物栽培培养基中生长，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，并产生在约600℃的温度存活的孢子。

35.权利要求34的方法，其中所述植物栽培培养基也补充木炭。

36.权利要求34的方法，其中所述营养素或植物化学成分为类黄酮或异类黄酮。

37.权利要求34的方法，其中所述营养素或植物化学成分为维生素。

38.权利要求34的方法，其中所述维生素为维生素E(α-生育酚或γ-生育酚)。

39.权利要求38的方法，其中与没有补充所述火烧顶极微生物的情况下生长的植物产品相比，在所述植物的所述产品中，α-生育酚的量提高至少1.3倍。

40.权利要求38的方法，其中与没有补充所述火烧顶极微生物的情况下生长的植物产品相比，γ-生育酚的量提高至少1.3倍。

41.权利要求34的方法，其中所述植物为橄榄树植物或杏树植物。

42.一种营养提高的植物产品，所述植物产品从根据权利要求34的方法生长的植物中收获。

43.权利要求42的营养提高的植物产品，所述植物产品为杏仁。

44.一种改善土壤促进植物生长性质的方法，所述方法包括将包含至少一种火烧顶极微生物的组合物施用至土壤，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，并产生在约600℃的温度存活的孢子。

45.一种将存在于第一土壤中的刺激植物生长的火烧顶极微生物重新安置到第二土壤中的方法，所述方法包括从在所述第一土壤中生长的植物获得木炭，并将所述木炭施用至所述第二土壤。

46.一种将存在于第一土壤中的刺激植物生长的火烧顶极微生物重新安置到第二土壤中的方法，所述方法包括从在所述第一土壤中生长的植物获得木炭，其中所述木炭含有所述火烧顶极微生物的孢子，用所述木炭接种生长培养基，以引发所述孢子的发芽和营养生长，产生所述火烧顶极微生物，并将产生的所述火烧顶极微生物施用至所述第二土壤。

47.一种将存在于第一土壤中的刺激植物生长的火烧顶极微生物重新安置到第二土壤中的方法，所述方法包括从在所述第一土壤中生长的植物获得木炭，其中所述木炭包含所述火烧顶极微生物的孢子，用所述木炭接种生长培养基，以引发所述孢子的发芽和营养生长，产生所述火烧顶极微生物，从所述火烧顶极微生物鉴别促进所述第一土壤的植物生长特性的微生物株，并将鉴别的微生物株施用至所述第二土壤。

48.一种将存在于第一土壤中的刺激植物生长的火烧顶极微生物重新安置到第二土壤中的方法，所述方法包括使所述第一土壤的液体悬浮液沸腾，用沸腾的液体悬浮液等分试样接种生长培养基，以引发其中所述火烧顶极微生物的孢子的发芽和营养生长，产生所述火烧顶极微生物，并将产生的火烧顶极微生物施用至所述第二土壤。

49.一种将存在于第一土壤中的刺激植物生长的火烧顶极微生物重新安置到第二土壤中的方法，所述方法包括使所述第一土壤的液体悬浮液沸腾，用沸腾的液体悬浮液等分试样接种生长培养基，以引发其中所述火烧顶极微生物的孢子的发芽和营养生长，产生所述火烧顶极微生物，从该火烧顶极微生物鉴别促进所述第一土壤的植物生长特性的微生物株，将鉴别的微生物株施用至所述第二土壤。

50.一种提高植物的生长和营养价值的方法，所述方法包括使植物栽培变种在补充碳化的植物材料的植物栽培培养基中生长。

51.一种改善土壤促进植物生长性质的方法，所述方法包括将碳化的植物材料施用至所述土壤。

52.权利要求50或51的方法，其中选择含有至少一种火烧顶极微生物的所述木炭，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，并产生在约600℃的温度存活的孢子。

53.一种刺激动物的免疫系统的方法，所述方法包括将权利要求42的植物产品提供给所述动物消费。

54.一种提高微生物菌丛和促进动物健康的方法，所述方法包括将权利要求42的植物产品提供给所述动物消费。

55.一种提高植物太阳能转换的方法，所述方法包括使植物栽培变种在补充至少一种火烧顶极微生物的植物栽培培养基中生长，所述火烧顶极微生物根据权利要求6-16中任一项的方法分离。

56.一种减少环境污染的方法，所述方法包括使植物栽培变种在补充至少一种火烧顶极微生物的植物栽培培养基中生长，所述火烧顶极微生物根据权利要求6-16中任一项的方法分离。

57.一种改善或恢复非农业用地中的土壤质量的方法，所述方法包括将包含至少一种火烧顶极微生物的组合物施用至所述土壤中，其中所述火烧顶极微生物为需氧菌，并产生在约600℃的温度存活的孢子。

58.权利要求57的方法，其中所述组合物为木炭。

59.权利要求57的方法，其中所述非农业用地为景观荒地、城市绿化带或高尔夫球场。

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