JP2005500413A - 土壌を処理するための微生物及びそれらを獲得する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、土壌処理に適切な生きている微生物を含有する製品、様々な気候及び自然環境下で増殖する微生物、並びに当該製品を生産する手段、更には、当該製品で土壌及び植物を処理するための方法に関連する。更に詳細には、本発明は前記製品を、以下に規定した微生物又はその混合物から調製する手段に関連する。更に、本発明は、使用される微生物を生産する手段にも関連する。本発明の目的は微生物それら自身でもある。さらに詳細には、本発明は、以下の微生物を１種類以上含有する製品、更には先の微生物及びそれらの生産物を含有し、当該植物の環境中で増殖及び生存する製品で土壌及び植物の処理をするための手段に関連する。その微生物とは：アゾスピリラム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）ssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）ssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）var. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザ（Bacillus polymyxa）var. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）var. M３２６１７（NCAIM ／P／B００１３０１）である。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、土壌処理に適切な生きている微生物を含有する製品、様々な気候及び自然環境下で増殖する微生物、並びに当該製品を生産する方法、更には、当該製品により土壌及び植物を処理する手段にも関連する。
【０００２】
更に詳細には、本発明は以下に規定した任意の微生物、又はそれらの混合物から前記製品を生産する手段に関連する。
【０００３】
更に本発明は、使用される微生物の培養物を構築する手段に関連する。本発明の目的は、微生物それら自身でもある。
【０００４】
更に詳細には、本発明は、微生物アゾスピリラム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense） ssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）ssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９１）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）var. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザ（Bacillus polymyxa）var. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）var. M３２６（NCAIM ／P／B００１３０１）、を１種類以上含む製品により土壌及び植物を処理する手段、更には、当該植物の環境中で増殖し且つ生存する製品であって、列挙した微生物及びそれらの生産物を含有する製品により、土壌及び植物を処理する手段に関連する。
【背景技術】
【０００５】
技術背景
土壌の天然環境は植物及び微生物の自己調節生態系であり、自然環境下では前者の存在が後者の存在を決定する。進化の過程で発達した平衡は、人間活動（大幅な耕作、自然及び人工的な肥沃化、植物保護剤の使用など）によって、その構造と機能において様変わりしており、不測の変化が生じる可能性がある。所定の栽培植物を至適に栽培するために必要な微生物集団を様々な土壌上及び様々な気候環境下で発生させるためには、長年に渡る選択時間が必要である。しかし、好ましい微生物集団の決定微生物（determinant microorganism）を土壌中へと輸送することはでき、そして至適栽培をするために必要な環境を１〜２日以内で作り出すことができる。この結果により、自然生態系に有害な混乱を伴うことなく高い収率がもたらされる。経済的観点から重要な所定の植物の環境中で生存する有用且つ優先的な微生物は、研究室での試験によって特定でき、そしてこれらを産業上の方法によって別々に増幅、生産でき、そして適切な割合で土壌中に戻すことができる。
【０００６】
土壌及び微生物の生態系における重要な調和が見出されて良い。微生物の数は様々であり、そして様々な種が、生息する植物の根系の周辺環境（リソスフィア（rhysosphere））及び発芽種子の周辺環境（スパーマトスフィア（spermatosphere））において、これらから一層離れた環境においてよりも同定されて良い。根の環境における微生物の増殖は多くの因子によって影響を受ける。これらの因子は、地域、土壌の質、微生物集団の組成、及び気候環境に依存する。
【０００７】
土壌中で発見される炭素源は、太陽エネルギーを使用すること、そして光合成によって、主要な状態になりそして圧倒的多数になることが発見されている。
【０００８】
窒素循環は、炭素循環よりも一層複雑である。窒素の変換により、生物学的及び化学的なプロセスが効果を有する。自然界では、いわゆる不活性な状態の気体状窒素が優占的にあり、そしていわゆる固定化された窒素（硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア）は限られた量において存在している。
【０００９】
窒素ガスの鉱化については、最初に生物学的窒素結合が原因となる。１ha以上では、分子状窒素の量が６〜７×１０8ｔになるので、これは窒素固定のために尽きることのないソースを意味する。専門家の注目は、窒素を結合する生物の方、即ち、分子上窒素をアンモニアへと還元できる生物の方へと向けられている。何故なら、特に、これら微生物の知識及びそれらの特性を十分に使用することにより、環境にやさしい方法で確実に、世界中の飢饉を消滅させることができるからである。
【００１０】
ある窒素結合細菌は遊離生存状態で窒素を固定化するが、多くの細菌は、窒素を他の高等植物と結合せしめてのみ固定化できる。
【００１１】
リンの循環は、窒素の循環とは対照的に、実際に自然環境下では閉鎖されている。この入りと出は同一であり、その流れは僅かであり、空気がリンで汚染されることはないだろう。最後に、この元素は水中、海に蓄積し、このうちの僅かのみが（鳥糞石などの形態で）大地へと帰る。
【００１２】
土壌の生きている細胞中で、リンは有機化合物中に蓄積し、これらの鉱化は高速（３〜８g／m2／年）で行われる。生じるリン化合物の溶解度−植物に対するそれらのアクセス可能性−は異なっており、平均１kgの各土壌中で検出できる４００〜１２００mgのリンのうちたった５％のみが使用可能である。所定のリン化合物の回転率は５００〜２０００年である。
【００１３】
いくつかの加リン酸分解性微生物群を土壌中へ輸送することによって、植物に対してアクセス可能ではない錯リン化合物を溶液中にもたらすことができる。もし微生物が土壌「機能」にもたらされ、そして土壌の鉱物成分が十分になれば、リン酸塩を含有する肥料の使用が不要になるあるかあるいはそれは大幅に減らされて良い。
【００１４】
植物は生長するために、−特に作物の熟する時に−多量のカリウムを必要とする。植物の耕作者は、土壌にカリウム成分を伴う肥料を供給することによってカリウムをもたらす。このような肥料は、カリウムイオンを放出する微生物を使うことによってカリウム鉱物から提供されて良い。
【００１５】
植物に関して、土壌中で増殖する微生物が生理的活性を有する化合物を生合成する。これらの中で最も重要な化合物は：植物ホルモンの、オーキシン（インドール−３−酢酸）、エチレン、ジベレリン、カイネチンなどである。いくつかのシュードモナス群は、僅かな量の鉄の存在下で鉄を収集できるいわゆるシデロフォアを生産する。この結果、他の植物病原性細菌及び真菌は、シデロフォアの故に鉄イオンを使用できないので、鉄を欠くことにより阻害作用を受ける。一方で、これらシデロフォアは、鉄を結合し、これらを植物に対して直接供給するので、鉄を欠く土壌において植物の生長を有意に刺激する。
【００１６】
上記を解決するために、いくつかの技術種類が考えられており；いくつかの微生物は全詳細を特定の刊行物中に記載されている。
【００１７】
ハンガリー人の発明者は、粉末化された硝化培養物（ハンガリー国特許HU第１４３.３９１号）、アゾバクター・クロオコカム（Azobacter chroococcum）培養物の製剤とリヒゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）の培養物（ハンガリー国特許HU第１８８.４３４号）、藻培養物（ハンガリー国特許HU第１９５.０６８号）及び再度アゾバクター・クロオコカム、並びにバチルス・メガテリウム微生物の培養物製剤（ハンガリー国特許HU第２０７.７５１号）を開示した。アゾバクター・クロオコカムは寄託番号００２３８で寄託されており、バチルス・メガテリウムは識別番号NCAIM／P／B１１４０である。更に詳細には、ハンガリー国特許HU１８８．４３４号及びHU２０７．７５１号中で、前記著者らは、上記の寄託された微生物の混合物の結果による発酵について記載している。ハンガリー国特許HU２１３１６３号によれば、前記著者らは、HU２０７．７５１の微生物の培養法をカルボキシメチルセルロースにより完成した。ハンガリー人の発明者は、HU１６７１／９６においてアゾスピリラム・リポフェルム（Azospirillum lipoferum）ssp.、アゾバクター・ビネランジsp．、シュードモナス・フルオレセンスspp.及びバチルス・メガテリウムssp.微生物を含む培養物を記載している。
【００１８】
上記の手段において適用された微生物の用途及び効果は、様々な組成の土壌中での様々な培養環境下、様々な気候環境下で短期間に渡ってのみ生存し、様々な植物の環境及びリソスフィアが常に至適条件を生み出すとは限らない、事実によって制限されている。
【発明の開示】
【００１９】
発明の開示
本発明の基本的な目的は、植物栽培及び経済的観点から好ましい効果のものであり、そして同時に様々な土壌及び植物中で生存、増殖しそしてそれらの好ましい効果を様々な土壌中及び様々な植物に対して、様々な気候及び栽培条件下で及ぼすことができるような土壌微生物培養物の調製である。
【００２０】
前記微生物を増殖及び生存せしめることが、土壌の構造、温度条件及び植物の周辺環境に応じて様々に、植物の生長、窒素の固定化、リン酸塩の流動化、植物の生長刺激、土壌構造の改良に好ましい影響を及ぼすという驚くべきことが、研究室で培養された場合に発見されている。様々な微生物群が、シエルノズジョム（ciernozjom）土壌、腐蝕質含有率が低い土壌、黄土、国において又は例えば粘土質土壌環境中でそれらの効果を発揮する。驚くべきことであるが、我々の実験の過程で様々な植物のリソスフィア中、又はその近隣で増殖することができ、そしてそこでそれらの効果を長期に渡り発揮することができる微生物群もいることが明らかになった。
【００２１】
従って、栽培を考えた場合に、経済的観点から重要である所定の植物の環境中で好ましい効果を有するような微生物を単離するための実験が行われた。加えて、カリウムイオンを流動化できる微生物を単離するための実験及び微生物−土壌中から単離されて突然変異手段により研究室で変化した−微生物であって、土壌中に戻された時に低温でも増殖することができ、並びに効果を−当業者も驚くべきほどであるが−それらの効果を発揮するような微生物を単離するための実験も行われた。
【００２２】
更に、我々は、実験の過程において、驚くべき方法で多糖類を生産する所定の微生物で農業の観点から好ましい構造に土壌を変化せしめ、これによって干ばつ耐性が向上することを述べている。
【００２３】
我々の実験を要約すると、窒素、リン、カリウムを植物へと伝達し、植物生長ホルモンを生合成し、土壌構造を改良せしめる多糖類を生合成し、そして播種期に、そしてより寒い国で増殖でき、並びに様々な土壌及び植物中でそれらの効果を発揮できるような微生物を単離することがわれわれの目的であった。更に我々は、製剤であって、その内容微生物が、植物の環境中、リソスフィア中又は直接植物細胞の中で、極めて重要な元素を固定化及び流動化せしめることによって、並びに所定の植物環境中で植物生長因子及び多糖類を生産することによって、所定の植物又は植物のファミリーの生長を促し、その結果、我々が、環境を保護する態様で、肥料の使用を抑えることができるようような製剤を生産することを目的とした。
【００２４】
本発明の目的は、列挙された微生物に関する増殖手段、これらを含む製剤、更には当該微生物を含む製剤の適用、そして具体的には当該微生物の適用である。
【００２５】
本発明は標的製剤を生産するための認識に基づいており、アゾスピリラム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウス（Micrococcus roseus）ssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム （Bradyrhizobium japonicum）var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）及びストレプトミセス・アルブス（Streptomyces albus）var.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）の微生物が最も都合良く、それらは播種期の低温にて増殖でき、植物に対して窒素を供給し、リン酸、カリウム、生合成された生長ホルモン及び多糖類を流動化せしめる。それ故に我々はこれらを単離してこれらの増殖手段を作り上げた。
【００２６】
上記の意味において、我々は１９９８〜１９９９年にヨーロッパにおいて、土壌及び所定の植物の根の環境から微生物を単離し、それらの窒素固定化、リン酸塩及びカリウムの流動化、多糖類生産及び植物ホルモンを生合成する能力をin vitroで試験し、選定の微生物を系統的に同定し、突然変異処理によって２０℃未満の温度で非常に良く増殖するような変異体を調製し、これらを培養するために、増殖技術を作り出し、そしてそれらの培養物から製剤を作製し、そしてそれらの植物の生長及び収率に対する効果を温室及びフィールド実験によって証明した。
【００２７】
アゾスピリラム、アゾトバクター、ブリジルヒゾビウム、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス及びミクロコッカスの種並びに亜種が単離された。
【００２８】
少なくとも、公知のアゾスピリラム種は、グラム陰性の、様々に着色する、土壌中ミクロアエロフィル（micro-aerofil）環境（酸素存在率が１〜２％）下で生存し、植物の根系と密接に関係し、空気の窒素をアンモニアへと還元し、次いでそれを植物中へと移すことができる微生物である。ある群は植物ホルモンをも生合成できる。
【００２９】
アゾスピリラム群は、様々な土壌におけるヨーロッパの様々な耕作地で生長したダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ及び干草畑の草の根の環境から単離された。土壌試料に由来する細菌懸濁はNfb（II）培養培地及びMM培養培地（組成は以下に示されている）上に分散され、そして微好気条件下で培養された。７２時間後、アゾスピリラム培養物が同定された。このアゾスピリラム培養物は、他の小さな細菌及び真菌培養物とは異なり、約３mmのサイズに到達する。
【００３０】
アゾスピリラム培養物が、液体MM及びNb（II）軟寒天培地（組成は以下に示されている）中で対数的に増殖する場合、アゾスピリラム細胞の形態学的特性を示す。この細胞はウィロイドでありそしてS字形態であり、そしてそのサイズは１〜２×２〜４μmである。それらは増殖するためにビオチンを必要とした。顕微鏡観察によれば、それらは素早く移動できる。それらの移動性はそれらの極毛によるものでありうる。それらはそれらの細胞中に、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸粒、及びカロチンを蓄積することができる。赤みがかった変色は、老化培養（ageing culture）によって説明されて良い。それらが増えるためにそれらは有機酸の、例えば、マレイン酸、乳酸、ピロラセミ酸及びブタン二酸を使用できうる。空気中の窒素の固定化を微好気環境下で行う。極端な環境下、例えば、干ばつの場合、低もしくは高い値のpH、窒素もしくは炭素源の欠乏において、細胞は鞭毛の無いポリ−β−ヒドロキシ酪酸粒を含み且つ莢膜多糖類により囲まれている、のう胞へと変換するであるだろう。多くの微生物が使用する炭素源は種に関して様々であり：A.アマゾネンセ（Amazonense）はグルコース+サッカロース+イノシトール（inozitol）+であり、A.ブラシレンセ（Brasilense）はグルコース+サッカロース及びイノジトール（−）であり、A.イラケンセ（Irakense）はグルコース（＋）及びサッカロース（＋）を使用するがイノジトール（−）を使用せず、最後にA.リポフェラム（Lipoferum）はグルコースのみを使用する。窒素を伴わない培地において、炭素源使用の範囲は大幅に異なり、従って、上記の４種を識別できる。我々が単離した微生物の炭素源使用範囲はATCC２９．７３１A.リポフェラム、A.アマゾネンセ、A.ブラシレンセ及びA.イラケンセ新基準標本（Holt、J.G.ら、Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 、第9版、１９９４）とは幾分異なる。典型群とは対照的に、これらは軟寒天中（これは以下に記載されている）、３．５%の塩化ナトリウムの存在下で適切に増殖し、それらの顕微鏡像は培養の様々な時期において異なり、それらの色素生産は、例えばポテト抽出寒天において一層強力である。
【００３１】
単離されたアゾスピリラムのいくつかは、種アゾスピリラム・リポフェラム、アゾスピリラム・アマゾネンセ、アゾスピリラム・ブラシレンセ並びに種アゾスピリラム・イラケンセに近く、我々はアゾスピリラム・ブラシレンセ群の１つを選択する一方これらの種に対して更なる実験を行った。
【００３２】
上記の土壌試料から、アゾトバクター微生物がNfb（II）軟寒天上で選択培養により単離され、次いで、MM及びFjodorov培地上分散されることによって、そして我々の亜種の１つがその窒素固定化能力に基づいて選択されて更なる実験のために保存された。前記群の細胞は球状形態の多形態（pleiomorph）である。酸素の存在下でこれらは素早く動く。これらはグラム陰性である。これらは窒素を伴わない培地上で適切にラムノース及びメソイノシトールを使用し蛍光の黄緑色の色素を生産する。
【００３３】
周知のように、リゾビウム（Rhizobioum）は、マメ科の根上で根粒を形成し、次いで植物細胞の中で、これらが直接、固定された窒素を植物へと移動せしめるようになる。様々なマメ科植物が様々なリゾビウム種と連絡し、ダイズはブラジルヒゾビウム群と連絡する。このことは、かかる、穀物を収穫した後には死滅するリゾビウム種に独特であり、即ち、それは土中で多量に維持されないので、この群を土壌処理のために用いることは賢明である。我々は、ブラジルヒゾビウム群を７月１３日に、Szeged−Kiskundorozsmaに近いSubasaのダイズプランテーションから単離した。黄土で生長する植物から十分に生長した植物が選択され、そしてその根から十分に生長した根粒が切り外された。実施例に示されているようにして単離された微生物の好冷変異体は寄託された。
【００３４】
我々が収集した試料において、我々はリン酸を流動化する微生物を探索し、そして系統学的観点から選択の微生物を試験した。一部の微生物はシュードモナスであり、その他はバチルス種であることが明らかになった。
【００３５】
シュードモナスはグラム陰性の、厚みの薄い形態の好気性細胞であり、これらは大部分の培地上で蛍光色素を生産し、これらは腐生菌である。カロチンの生産は確認されず、これらは４０℃を超える温度で増殖することは無い。ゼラチン寒天上では液状化が確認される。我々の群によってグルコースが使用され、デンプンは使用されていない。蛍光シュードモナス群の変異体は系統的に密接な関係があるが、所定の系統的異種が我々の微生物と典型的群の間で確認され、即ち、我々の微生物−シュードモナスの特徴の−は適切にグルコース、ガラクトース、酢酸、マルトース、グリセリン及びピロラセミ酸を使用する。それは、フルクトース、D−アラビノース、マルトース、ラクトース、デンプン及びイヌリンを使用しない。しかし、これらは典型群とは対照的に、キシロース、サッカロース上で増殖でき、そしてある程度ソルビトール上で増殖できる。それらは単一の炭素源としてグリシンを使用する。
【００３６】
上記に基づいて、我々の微生物の１つが種シュードモナス・フルオレセント（Pseudomonas fluorescent）として同定され、そしてそれはビオーバー(Biovar)III 群に属する変異体に近いところに位置することが発見された。我々は、この群をシュードモナス・フルオレセントssp.と命名した。
【００３７】
系統的特長に基づき、不溶性リン酸塩を溶解せしめることができるバチルス細胞のうちで、いくつかがバチルス・ポリミザであることが分かり、あるものはバチルス・メガテリウムであることが分かった。いくつかの群が更なる実験のために選択された。
【００３８】
カリウム鉱物から、カリウムイオンを流動化せしめることができる微生物を単離するために、カリウム、長石及びモスクバイト（muscovite）を含有する物質の表層から微生物を単離し、次いで固体状のカリウムを伴わない培地上で実施例に示されたような試験をし、カリウムの流動化を証明した。実施例に示された手段の突然変異処理手段を適用することで、ストレプトミセス・フィジクロフィリック（Streptomyces psychrophilic）として同定された微生物が生産されて寄託された。
【００３９】
我々は、系統学的、形態学的試験及びリボソームDNS試験の後に、ミクロコッカス・ロセウスであることが分かり、そして植物試験の過程で非常に有利な効果を示した微生物を単離した。この微生物の群の１つは寄託されており、その群は研究室にて形質転換されていた。
【００４０】
本発明は、土壌中に接種された好ましい効果を有する微生物が、秋及び早春における気候条件下並びにより寒冷な気候の国での気候条件下における播種及び植物最初の生長の時に、可能な限り速く増殖することができるという事実にも基づいている。従って、上記に従い微生物は、実施例４に示したように処理され、単離されて維持されていた。次いで、公認された手段によって、低温にて増殖する突然変異体及び変異体も誘導されNational Selection of Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託された。
【００４１】
本発明は、適用することにより植物栽培の収率が増加するような製剤及び手段に言及する。生産は、様々な耕作地、様々な植物の環境から単離されて試験された微生物であって、所定の植物ファミリーの環境中で長期に渡り生存し、様々な土壌中、低温でも増殖する微生物を培養すること、並びに当該培養物を含む製剤を対応する植物、種子、又はこれらの耕作地にもたらすことによって達成されている。本発明によれば、前記製剤は土壌、植物又は植物の種子を以下の微生物の１種類以上を含む製剤で処理することに使用されて良い。その微生物とは： アゾスプリウム・ブラシレンセssp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセントvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１２．．）及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１２．．）である。
【００４２】
処理の結果、植物の生長が加速するであるだろうし、これらは一層病原耐性になるであるだろうし、土壌構造及び植物の水分供給が改善され、そして肥料の使用を減らすかあるいは肥料を全く使用せずとも高い収率がもたらされるであるだろう。
【００４３】
本発明の手段の最も重要な利点の１つとは、それを、植物栽培の過程で実行することによって、窒素、リン酸塩、及びカリウムをベースとする肥料の使用が事実上不要になるかあるいはかなりの程度で削減することができることである。肥料の環境汚染効果が明らかになっている。微生物細胞中で生合成される、植物の生長を促す化合物は、処理された植物の生長、根の生長を加速せしめ、そして同時にこれにより植物の水分供給が改善されるであるだろうし、供給された微生物が植物病原微生物の増殖を抑制し、我々のいくつかの微生物の細胞中でのポリ多糖類合成により土壌構造及び水分バランス及び特に土壌の寿命が好ましく改善される。本発明の製剤、それらの作製及び適用は、同じ目的及び用途の公知の製剤及び調製手段とは対照的に、様々な土壌から単離された、経済的に重要な耕作植物に対して所定の特異的な効果を発揮する様々な微生物の使用、様々な効果に基づいている。その微生物は、秋及び早春の低温並びにより寒冷な気候の地域でも増殖できる。
【００４４】
本発明の微生物は、炭素源として例えば、グルコース、デンプン、サッカロース、もしくは糖蜜、窒素源として、コーン浸出液（corn steep liquor）、カゼイン、イーストエクストラクトもしくはアンモニウム塩、更なる他の無機塩及び微量元素のイオンを解離する塩を含有する培地上で培養できるが、専門家のための証明として、任意の同化可能な炭素源及び窒素源、無機塩が、本発明の細菌を増殖せしめるために用いることは可能である。
【００４５】
本発明の微生物を含む培養物は、処理される土壌に対して又は植物に対して栽培のために用いられる環境中に直接添加されて良いが、微生物の生物学的可能性を維持する製剤、これらの中で特に、細菌を粘着力により種子に対して固定化する担体を含有する製剤も調製されて良い。土壌へともたらされる微生物の量は５×１０11〜５×１０15細胞／haで様々であり、そして好適な細胞量は１０12〜１０13である。
【００４６】
Budapest Agreementの観念から、我々は、様々な植物環境から単離し同定した、低温でも増殖できる微生物をNational Collection of Agicaltural and Industrial Micro-organismsに寄託し、ここでそれらは以下のような寄託番号で登録されている。
アゾスプリウム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、
アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、
シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、
バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、
バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、
ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、
ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及び、
ストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）
【００４７】
本発明の目的は寄託された群及びそれらの人工及び天然の突然変異体、変異体又は任意の公知の方法で得られた上記の微生物の群系統にも及ぶ。
【００４８】
我々は、以降、本発明を保護する範囲を限定することなく、例によって本発明を説明する。
【００４９】
例において、特に断らない限り、％は重量パーセントで表されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
様々な土壌からそして様々な植物の環境から空気の窒素を固定化する微生物を単離してそれらの窒素固定化能力を証明する
アゾスピリラム種はグラム陰性の様々に着色する細菌であり、微好気環境（１〜２％の酸素存在）下で空気の窒素をアンモニアへと還元することができ且つそれらを植物のために利用できる。
【００５１】
アゾスピリラム種を様々な土壌試料（腐植、黄土、塩質、褐色及び黒色土壌）から、様々な植物（穀類、ヒマワリ、トウモロコシ、草など）の根の環境から単離した。化学誘引物質の、例えば、有機酸及び糖が走化性によってアゾスピリラム群を引き付ける。細菌は、鞭毛の役立ちによって根の方へと移動しそして到達し、コロニー化する。
【００５２】
所定の土壌試料の１０倍、１００倍、１，０００倍及び１０，０００倍の希釈物を滅菌蒸留水により作製し、懸濁１００〜１００μlをMM及びNfb（II）軟寒天が入っているペトリ皿上に塗布した。前記MM培地の組成は以下のとおりである。
【表１】
【００５３】
次いで、グルコースをMM培地の他の成分とは個別にオートクレーブで滅菌（１２１℃、３０分）し、６０℃の温度に冷ました後に混合した。滅菌培地を、１Nの滅菌NaOH溶液によりpHに７．４に調節した。
【００５４】
Nfb（II）培地の組成は以下のとおりである。
【表２】
【００５５】
培地を1NのKOH溶液でpH６．８に調節した。
※微量元素溶液の組成は以下のとおりである。
【表３】
※※ビタミン溶液の組成は以下のとおりである。
【００５６】
培地中へもたらされMMプレート上で発見される微生物を嫌気性細菌恒温相中に置いて、恒温相の空気空間を窒素で交換し、次いで、十分な量の空気で還流するとともに、酸素濃度を１．６％にセットした。次いで、プレートを３２℃の温度でインキュベートし、７２時間後にアゾスピリラム微生物を同定した。系統希釈に対応して、１０倍希釈懸濁物を塗布したプレート上では、連続的に細菌の領域が広がっていった一方で、１０，０００倍希釈した懸濁は、全体に３０〜５０の培養物が広がっていた。他の小細菌とは異なり、アゾスプリラム培養物及び真菌培養物は約３mmのサイズに到達した。培養物のうちいくつかは、形態的にアゾスプリラム培養物に類似していた。我々は、これらのうちいくつかのを更に研究した。
【００５７】
Nfb（II）軟寒天培養物を、第一に全アゾスピリラムが増殖し、そして形態的特長を確認できる、好気生物恒温相中、上記培地中及び上記培養環境下に置いた。
【００５８】
MM培地及びNfb（II）培地から獲得した様々なアゾスピリラム細菌群を、微生物学的な習慣に応じて、１次細菌培養物を、１つの培養物につき、完全Tag培地上で２回広げる方法で増殖せしめた。アゾスピリラム細菌群を、１つの培養物につき２回、液体Tag培地において広げることよって精製し、群培養物で保存した。−８０℃における微生物懸濁を群培養物とみなしそして全ての実験をこの培養物から開始した。
【００５９】
Tag培地の組成は以下のとおりである。
【００６０】
滅菌後、以下の化合物の水溶液を、以下のような最終濃度で添加した。
０．１M、CaCl2×６H2O ０．１％、
０．１M、MgCl2×６H2O ０．１％、
グルコース（個別に滅菌した） ０．２％
【００６１】
滅菌後、培地のpHを７．０〜７．２に調節した。
【００６２】
根のコロニー形成は簡単な実験で検出できる。滅菌パーライト（１５cmの直径の容器）及び同数（１×１０10細胞／容器）の細胞中に播いた、アゾスプリラム細菌で処理したトウモロコシ及びコムギ植物の根上では、顕微鏡計測に基づき、コントロールにおけるよりも、本質的に一層のアゾスプリラム細胞を検出した。根のコロニー化は特異的認識機構に基づき行われる。コロニー化の過程で、アゾスプリラム細胞は根のマトリクスに侵入し、そしてこれらはそこで−それらの窒素固定化作用により−主要植物に必要な窒素の一部を補うことができる（連合窒素固定化）。このことは、我々の研究室における実験の過程でアゾスピリラム群を接種されたトウモロコシ及びコムギの緑色の部分（green mass）の生長がより早いことによって明らかになっており、その結果の詳細を後ほど記載している。アゾスプリラムは植物ホルモン及び生長を促す物質をも生産する。これらの物質及びそれらの主要植物に対する好ましい効果は、発芽効率の増加によりそして強力な植物生長、そして研究室環境下で行った実験により明らかにできる。
【００６３】
単離されたアゾスプリラム種の形態的特長は、本説明の幅広い部分にて見出される。
【００６４】
窒素を伴わないMM培地における選択的培養ではなく、Nfb（II）軟寒天上での選択的培養で、アゾスプリラム微生物を耕作地土壌試料から単離した。これらの群が、系統学的特徴及び炭素源利用スペクトル、空気中の分子状窒素をSW５−０１−０７と同じく大きい程度で固定化することに基づき、アゾスプリラム・ブラシレンセであることを発見し、次いで、後に記載したように、低温度でも増殖し、多糖類を生合成する変異体を単離し、これらうち１つを寄託した。
【００６５】
アゾトバクター群を単離するために、組成を先に示したNfb（II）培地及びMM培地の使用に加えて、土壌試料を、アゾトバクターが特徴的形態学的特性を示すFjodorov培地でも培養した。Fjodrov培地の組成は以下のとおりである。
【表４】
【００６６】
滅菌する前に前記培地のpHを1NのNaOH溶液で７．０に調節した。
【００６７】
Nfb（II）軟寒天上での選択的培養、次いで、窒素を伴わないMM培地及びFjodrov培地上での選択的培養で、アゾトバクター微生物を耕作地土壌試料から単離した。これらの群は、系統学的特徴及び炭素源利用スペクトル、空気中の分子状窒素をSW６５−０１−３４で記録されたのと同じく大きい程度で固定化することに基づき、アゾトバクター・ビネランジであることを発見し、次いで、後に記載したように低温度で増殖する変異体を単離し、我々はこれらのうち１つを寄託した。
【００６８】
アゾスプリラム群及びアゾトバクター群の窒素固定化能力をアセチレン還元法によっても特定した。前記方法（Dilworth M J、J.Biochem. Biophys.Acta ２７５、２８５、１９９６）に従い、アセチレンを注入器によって閉鎖された皿における培養物中に注入し、そして１２時間インキュベーションした後、ガス混合物０．２５mlをPerkin−ElmerガスクロマトグラフのPropak Nカラム中に注入した。前記ガス混合物のアセチレン及びエチレン濃度を水素炎イオン化検出器によって測定した。アセチレン及びエチレンのピークの高さから、それは完全にニトロゲナーゼの酵素複合体活性により行われていることが分かった。我々のアゾスピリラム群及びアゾトバクター群は、１５〜８５nmolの量のアセチレンを１時間以内にエチレンへと還元した。
【００６９】
ブラジルヒゾビウム群をブラジルヒゾビウム群を７月１３日に、Szeged−Kiskundorozsmaの近くに位置するSubasaのダイズ植物から単離した。黄土で生長する植物から十分に生長した植物を選択し、そしてその根から十分に生長した根粒を切り外した。根粒を滅菌蒸留水で洗浄し、押しつぶし、そして粒子を生理食塩水中で懸濁せしめた。懸濁から、無菌条件下で希釈系を調製し、そして完全培地上に広げた。インキュベーションの４８時間後に、増殖する培養物の窒素固定化能力をいわゆる共生植物試験によって、以下のようにして特定した。それは：市販の牧草（medic）（Medicago Sativa）の種子表層を、７２℃の温度で２時間の熱処理をしそして２０％Hypo溶液により慎重にリンスすることによって滅菌し、そして１％寒天を含む蒸留水培地中で発芽させた。苗木を１．５％Gibson 斜角（oblique）寒天（後の記載を参照のこと）上に置き、温室で１週間に渡り飼育した。この１週齢の植物に各細菌培養物の細胞を接種し更に８週間に渡り温室で飼育した。非常に至適な生長を示すこの３つの植物（根の上の部分の乾燥重量が３〜５mgのコントロールの植物とは対照的に、２２〜２６mgである。）に属する群から、３つを選択し、そして形態学的及び系統学的観点から重要なその特性に基づき、我々はそれらをブラジルヒゾビウム・ジャポニカvar.PH−２−１−３と命名した。
【００７０】
実施例２．
リン酸塩及びカリウム可溶化微生物の単離
土壌試料を世界の様々な所から収集し、当該試料の懸濁水をTag培地（上記を参照のこと）上に広げた。次いで、シュードモナス培養物及びバチルス培養物の単離した物質及び細胞形態を試験した。
【００７１】
微生物学の実際に従って、１次細菌培養を１つの培養物につき数回、完全Tag培地上に広げることによって、様々なシュードモナス群及びバチルス群を精製した。細菌群を増殖せしめ、そして液体及び固体Tag培地中に広げることにより精製して保存した。
【００７２】
微生物のリン酸塩流動化特性を、改変Pikovskaya（HP）及び１０％リン酸三カルシウム及びグルコース（０．２％）を補足した、１％のヒドロキシアパタイトを含有するNutrient Agar（Ooxid）培地において試験した。
【００７３】
実験の過程で使用した培地の組成は以下のとおりである。
改変Pikovskaya培地：
【００７４】
以下の化合物の溶液を前記培地に対して滅菌後に添加した。
２０mg／１００ml、FeSO4×７H2O １％、
４０mg／１００ml、MnSO4×７H2O １％、
当該培地を滅菌する前にpHを７．２に調節した。
Naoxg：＋０．２%のグルコースの製造説明書に従い調製したNutrient agar（Oxoid）
【００７５】
Pikovskaya（HP）培地での予備実験の過程で選択した群のリン酸塩可溶化能力を試験している間、３０℃の温度で、３〜４日以内に増殖した培養物が２９mm及び３８mmの溶液リング（solution ring）を作り出した。Tag斜角寒天から獲得した同群の細胞懸濁を１mlの蒸留水と伴に１０％リン酸三カルシウムを補足したNaoxgプレート上に作られた穴に滴下した（０．１ml／穴）。培養物を３０℃の温度でインキュベートし、２〜３日以内で十分目立つ溶液リングを確認した。これらのサイズは、シュードモナス群を使用して詳細に試験した場合、２４mmであり、そして我々がバチルス群を使用した場合は２６mmであり、平均サイズは３４mmと見積もった。
【００７６】
各シュードモナス群及びいくつかのバチルス群が強力なリン酸可溶化特性を有していることが明らかになった。両方の無機リン酸塩を担持する変異体は、溶液中で良く検出でき、従ってこれらは優れたリン酸塩可溶化特性を有するといえる。
【００７７】
それらの系統学的特性及び炭素利用スペクトルに基づき、試験により選択された１４のシュードモナス微生物及び２５のバチルス微生物が、シュードモナス・フルオレセンス及びバチルス・ポリミザ並びにバチルス・メガテリウムであることを発見し、それらを、順にSW−１−１−１４、SW１７−１−１５及びM３２−１−１０の印をつけ、次いで、後に記載したように、低温でも増殖しそして大量に多糖類を生合成する変異体も単離して寄託した。
【００７８】
先に示した組成のPikovskaya（HP）培地から塩化カリウムを除き、そしてヒドロキシアパタイトの代わりに微細粉末中に破砕した１％のFledspar及びmica schistを加えたことが違うこと以外は、カリウムイオンを流動化せしめる微生物の単離を上記のようにして達成した。
【００７９】
鉱物を水中で完全に不溶性にするかあるいは溶液中で部分的に不溶性にする微生物培養物の周辺では、透明な領域が形成されるだろう。
【００８０】
これらのいくつかを選択し、そして系統学的特長、形態学的特長及び炭素利用スペクトルに基づきバチルス及びストレプトミセスであることを発見した。我々の１５の群に１−０１５−０００３のような番号を付け、次いで、後に記載したように、低温でも増殖する変異体を単離し、これらの１つを寄託している。
【００８１】
実施例３
シデロフォア及び植物ホルモンを生産する微生物の単離
実施例１及び２に記載のようにして単離した群のシデロフォア及び植物ホルモンを生産する能力を、KingB培地を使用することによって試験した。この組成は以下のとおりである。
【００８２】
培地を滅菌する前に水酸化ナトリウム溶液でpHを７．２に調整した。
【００８３】
シデロフォアを生産するシュードモナス群は鉄イオンを固定化し、そしてそれらは鉄が乏しい土壌中でも植物に対してもそれらを輸送する。更に、これらはいくつかの植物病原微生物、例えば、エルウィナ・カラトボラ（Erwina caratovora）の増殖を阻害する。何故ならこれらは、固定化された鉄を利用できないからである。我々は、大腸菌（Esherichia coli）MC１０６１群の増殖を阻害することによってシデロフォア生産を試験した。寒天培養に由来する２つの群の細胞懸濁を蒸留水で調製し、次いで、鉄を伴わないKingBプレートと鉄を含有する（１μMのFeCl3×７H2O）KingBプレート（３０〜５０μl）上に滴下し、４８時間に渡り温度２８℃で培養し、しかる後に、Tag寒天から獲得した大腸菌MC１０６１培養物をプレートに塗布し、そして更なる２８時間に渡り温度２８℃でインキュベートし続けた。培養物の周辺では、様々な阻害地帯が確認できる。４つの実験の平均の結果を表１に示している。ネガティブコントロールとしてバチルス・メガテリウムを、ポシティブコントロールとしてシュードモナス・フルオレセンス（を使用した）。
【表５】
【００８４】
mob４及びポジティブコントロール群によるシデロフォア生産を試験する過程で、鉄イオンの存在下では消える多くの阻害地帯が確認された。
【００８５】
先に述べたように、いくつかのシュードモナス群は植物ホルモンを生産する。選択した微生物を、これらが上記のTag培地中でジベレリン酸を生合成することができるかどうか試験した。試験を標準ジベレリン酸A（Sigma）を使用し、（４０□g／ml）のシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Merck）によって行った。酢酸エチルによる培養物の抽出を、２倍の体積の炭酸水素ナトリウムでの抽出後に行い、次いで、pH２．５の溶液中、酢酸エチルで再度行った。抽出の蒸発残さ中で、スポットのRf値が標準に近い以下の群を発見した。
【表６】
【００８６】
SW１−１−６及びM３２−１−９と印をした群を選択した（これらはホルモンを約３〜１５□g／ml生産する）。
【００８７】
全体に渡り記載した群を系統学的な観点から試験して同定した。
【００８８】
実施例４
細胞外多糖類を生産する微生物の単離
４A．ブラジルヒゾビウムの選択
ブラジリヒゾビウムPH−２−１−３群を、１％グルコース及び１％サッカロースを含有するTag培地（上記を参照のこと）中で広げ、そして培養物周辺の多糖類（粘液）量を分析した。多糖類を生合成するPH２−１−１及びPH２−１−２群を選択した。
【００８９】
４ B ．バチルスの単離
バチルスM３２−１−１０及びSW１７−１−１５群を、１％グルコース及び１％サッカロースを含有するTag培地（上記を参照のこと）に広げ、そして培養物周辺の多糖類（粘液）量を分析した。M３２−１−６．８及び１０及びSW１７−１−７．１１及び多糖類を合成する１５群を選択した。
【００９０】
ミクロコッカス・ロセウスであることが分かった単離された微生物は、グルコース及びサッカロースを含有する完全培地上で、培養培地を粘性の物質に変化せしめる多量の多糖類を生合成している。
【００９１】
我々の試験によって選択された群は、公知の構造の、サクシノグリカン（succinoglucone）型の水溶性の多糖類を生合成している。
【００９２】
実施例５．
寒冷耐性微生物の単離
実施例１〜４により選択した微生物を、突然変異を引き起こす薬剤及び放射線で処理した。蒸留水で調製した微生物の懸濁を０．０１、０．１、１．０、１０及び１００□g／mlニトロソグアニジンで１、３、５、１０及び３０分に渡り処理した。この処理に続き、細胞の懸濁を遠心し、蒸留水で２度洗浄し、次いで、細胞をTag培養培地上に広げた。微生物１０9／mlを含有する蒸留水細胞懸濁に、１０cm離れたところから１５WのUVランプの下で１、３、５、１０及び３０分に渡り細胞を維持することによって処理を繰り返した。細胞懸濁をTag培地上に様々な希釈率で広げた。
【００９３】
Tag培地を１８℃で１９２時間に渡りインキュベートし、しかる後に、１８℃でインキュベートしたTag斜角寒天上で最大の培養物を単離した。
【００９４】
以下の増殖した培養物をコントロールにして且つ維持した。
【００９５】
単離されたものの中で、選択され且つ寒冷耐性の微生物を分離して寄託した。
アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、
アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、
シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、
バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、
バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、
ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、
ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及び、
ストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）
【００９６】
実施例６
微生物の培養
６．A完全培養培地上での培養
Tag培養培地から斜角寒天培養物を調製し、次いで、３０℃の温度で４８時間に渡りインキュベートした。アゾスピリラム、アゾトバクター、バチルス、ブラジルヒゾビウム、シュードモナス、ストレプトミセス又はミクロコッカス培養物を以下の組成の−Ta1i−と命名した培養培地中に接種した。
【表７】
【００９７】
培養培地１００〜１００mlずつを５００mlのErlenmeyerフラスコに入れ、そして１２１℃の温度で３０分に渡り滅菌した。この滅菌培養培地に斜角寒天培養により増殖した微生物を接種し、培養物の培養を６０円回転／分で動く回転テーブル上で、温度２５℃にて、２３６分に渡り行った。次いで、以下の組成のTa１f主発酵培地中へ接種した接種物から５％の量を用いて、顕微鏡試験により増殖を確認した。
【表８】
【００９８】
Erlenmeyerフラスコ中で培養培地／１００mlを滅菌し、そしてグロス体積１０l且つネット体積５lの実験室発酵槽中の培養培地／１００mlを、上記の環境下で滅菌した。
【００９９】
フラスコ内に置いた培養物を回転テーブル上で培養し、一方で発酵槽中においた培養物を細胞数／mlが−細菌に依存して−４×１０8〜１．３×１０9の値に到達する場合、しかもv／vばっ気すること及び３６０回／分で回転する二重入口（dubole inlet）を伴うターボミキサーを２４時間に渡り操作することによる通常の方法において培養した。
【０１００】
より多くの量で培養物を調製するために、１０lの培養物を、上記の組成のTa１i培養培地により、前記発酵条件下で調製し、次いで、滅菌したTa１i培養培地１００l及びTa１f培養培地１００ｌを各５−５lずつ接種した。この培養を上記発酵環境下で２４時間に渡り続け、次いで、土壌において、Ta１f培養培地により増殖した培養物、Ta１i培養培地により増殖した培養物５０lを用い、１０００lの滅菌Ta１f培養培地を接種した。次いで、培養を上記発酵環境下で２４時間に渡り行い、検査後、培養物をすぐに使用できるようにした。異常に強く発泡する場合には、０．０１％のポリプロピレングリコールを抗発泡剤として添加した。
【０１０１】
６B．半最小培養培地による培養
実施例６に示した手段を繰り返した。Ta１f培養培地の代わりに、以下の組成のTaf２培養培地を使用したことが違う。
【表９】
【０１０２】
培養が完了した後、細菌によるが、培養物は、１〜７×１０8細胞／mlを含む。
【０１０３】
実施例７
土壌構造の改良実験及び植物栽培実験
７A．土壌構造を改良する実験
Somlyoszigetに近いDanubeにて回収した砂質土壌とEsztergomから回収した粘土質土壌を９０×９０cmのトレーに置いた。その層厚は２５cmであった。砂質土壌をトレーあたり１０gの硝酸アンモニウム及び５ｇのリン酸カルシウムで処理した。トウモロコシをトレーに、種１０４粒／トレーで播いた。我々は評価時に、５つの最大に生長した植物及び５つの最も生長しなかった植物のデータを考慮しなかった。蒸留水で洗浄した後に温度４５℃で２日乾燥せしめた根の重量を測定した。Ｎｏ．１のトレーはその後水分が豊富であり、Ｎｏ．２のトレーは播種時に水が豊富であったがその後は水が全くなった。「a」の印をつけたトレーに、多糖類を生合成する微生物を、１ｍ2に対して各細菌１０8細胞で接種した。その微生物群の培養物とは、National Collection of Agricultural and Industrial Micro-organisms、に寄託している、実施例６により調製した、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）及びブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）である。「b」の印をつけたトレーは、微生物で処理しなかった。
【０１０４】
表３において、播種後３３日で得られた結果を示している。この結果は、１つの植物に対して計測された平均値で示している。
【表１０】
【０１０５】
表４において、水を与えなかった砂質土壌及び粘土質土壌（トレーＮｏ．２）の崩壊及び亀裂の程度を示している。崩壊の程度とは、我々は、土壌片の多くがペーパーシート上で散乱し且つ僅かに揺する過程では分解しない、２mm未満（−）、２〜５mm（＋）、又は５mm以上（＋＋）の断片を意味する。土壌表層の亀裂の程度を、亀裂がない場合を＋＋、僅かに細い亀裂を＋に印し、一方で干ばつ土壌の破壊の特徴の、亀裂の大きな線の存在を−のように印している。
【表１１】
【０１０６】
表３及び表４のデータから、多糖類を生合成する微生物の存在が植物の生長を向上せしめ且つ好ましい土壌構造にすることが分かった。
【０１０７】
７.Bフィールド実験
実験を２０００年に、Mosonmagyarovar UniversityのImprovement and Cultivation Technological Stationのランダム区画配置において、微生物混合物１０l／haを用い、繰り返し４回行った。
【０１０８】
実験土壌の種類：砂質土壌領域、厚さ：１２０〜１４０cm、含水率２．４%、降水：乏しい
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【０１０９】
実施例８
本発明の微生物を含有する製剤の調製
８A．微生物混合物の調製
実施例６により調製した、培養物アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）を、至適に等しい割合で混合しそして５l〜５０l／ha、至適には１２l／ha当量の割合で処理する土壌中に、１年のうち霜の降りない任意の時期、至適には３月〜１０月に適用した。
【０１１０】
８.B単子葉植物を処理するための製剤
実施例６の手段に従い製剤を作製した。以下の微生物を使用したことが実施例６とは異なる。その微生物は：アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）である。
【０１１１】
８．C 双子葉植物を処理するための製剤
実施例６の方法に従った。以下の微生物を使用したことが実施例６とは異なる。その微生物は：アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar.SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar.M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）であり、本発明の製剤を調製した。
【０１１２】
８D．凍結条件下で乾燥した製剤の作製
実施例６の微生物懸濁水から２lを、Gelman SPA凍結装置中で装置の製造説明書に従い凍結乾燥せしめた。乾燥微生物粉末をそれ自身で使用するかあるいは使用次第では、炭酸カルシウム、デンプン、グルコース、又はセルロースと、１：１〜１：１００の割合で混合し、次いで製剤を使用する時迄、４〜１０℃の温度で保存した。
【０１１３】
８Ｅ．担体を含有する製剤の調製
至適に、実施例６の培養培地により調製した培養物を等しい割合の有機肥料、ダイズ粉（一般には４メッシュ粒サイズ）、メチルセルロース又は片栗粉（patato starch）などと、製剤が微生物を、５×１０8〜１０10、至適には５×１０9含有するように調製した。次いで、湿製剤又は４０℃未満の温度で乾燥せしめた製剤を、２及び２０kg／haの量、至適には５kg／haの量において、処理する土壌中に適用した。至適に、１０13微生物細胞／haを土壌中に組み込んだ。
【０１１４】
要約
本発明の目的は、植物の生長を向上せしめ且つ収率を高めるために微生物で土壌を処理するための製品及び手段、当該製品を作製するための手段、当該製品の基礎として働き、低温で増殖し、多糖類を生合成する微生物株、及びこれらを生産するための手段である。本発明の微生物細胞又はそれらの化合物の１つは、土壌にへと移されるかあるいは植物の種子に固定化されるだろう。
【０１１５】
本発明の手段により、製品が土壌中に移されるだろう。この製品は、土壌細菌群を１種類以上含有する。その細菌群は、空気中の窒素を植物が利用できる化合物へと転換する、鉱物化したリン酸塩化合物及びカリウム化合物を可溶化する、そして植物の生長を向上せしめる物質を生合成する、土壌の構造に至適な影響を与える多糖類を生産する、様々な土壌から単離されて研究室で改変され、従って十分な収率に到達し、実際上は高価な肥料の使用を排除する細菌群である。
【０００１】
発明の分野
本発明は、土壌処理に適切な生きている微生物を含有する製品、様々な気候及び自然環境下で増殖する微生物、並びに当該製品を生産する方法、更には、当該製品により土壌及び植物を処理する手段にも関連する。
【０００２】
更に詳細には、本発明は以下に規定した任意の微生物、又はそれらの混合物から前記製品を生産する手段に関連する。
【０００３】
更に本発明は、使用される微生物の培養物を構築する手段に関連する。本発明の目的は、微生物それら自身でもある。
【０００４】
更に詳細には、本発明は、微生物アゾスピリラム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense） ssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）ssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９１）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）var. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザ（Bacillus polymyxa）var. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）var. M３２６（NCAIM ／P／B００１３０１）、を１種類以上含む製品により土壌及び植物を処理する手段、更には、当該植物の環境中で増殖し且つ生存する製品であって、列挙した微生物及びそれらの生産物を含有する製品により、土壌及び植物を処理する手段に関連する。
【背景技術】
【０００５】
技術背景
土壌の天然環境は植物及び微生物の自己調節生態系であり、自然環境下では前者の存在が後者の存在を決定する。進化の過程で発達した平衡は、人間活動（大幅な耕作、自然及び人工的な肥沃化、植物保護剤の使用など）によって、その構造と機能において様変わりしており、不測の変化が生じる可能性がある。所定の栽培植物を至適に栽培するために必要な微生物集団を様々な土壌上及び様々な気候環境下で発生させるためには、長年に渡る選択時間が必要である。しかし、好ましい微生物集団の決定微生物（determinant microorganism）を土壌中へと輸送することはでき、そして至適栽培をするために必要な環境を１〜２日以内で作り出すことができる。この結果により、自然生態系に有害な混乱を伴うことなく高い収率がもたらされる。経済的観点から重要な所定の植物の環境中で生存する有用且つ優先的な微生物は、研究室での試験によって特定でき、そしてこれらを産業上の方法によって別々に増幅、生産でき、そして適切な割合で土壌中に戻すことができる。
【０００６】
土壌及び微生物の生態系における重要な調和が見出されて良い。微生物の数は様々であり、そして様々な種が、生息する植物の根系の周辺環境（リソスフィア（rhysosphere））及び発芽種子の周辺環境（スパーマトスフィア（spermatosphere））において、これらから一層離れた環境においてよりも同定されて良い。根の環境における微生物の増殖は多くの因子によって影響を受ける。これらの因子は、地域、土壌の質、微生物集団の組成、及び気候環境に依存する。
【０００７】
土壌中で発見される炭素源は、太陽エネルギーを使用すること、そして光合成によって、主要な状態になりそして圧倒的多数になることが発見されている。
【０００８】
窒素循環は、炭素循環よりも一層複雑である。窒素の変換により、生物学的及び化学的なプロセスが効果を有する。自然界では、いわゆる不活性な状態の気体状窒素が優占的にあり、そしていわゆる固定化された窒素（硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア）は限られた量において存在している。
【０００９】
窒素ガスの鉱化については、最初に生物学的窒素結合が原因となる。１ha以上では、分子状窒素の量が６〜７×１０8ｔになるので、これは窒素固定のために尽きることのないソースを意味する。専門家の注目は、窒素を結合する生物の方、即ち、分子上窒素をアンモニアへと還元できる生物の方へと向けられている。何故なら、特に、これら微生物の知識及びそれらの特性を十分に使用することにより、環境にやさしい方法で確実に、世界中の飢饉を消滅させることができるからである。
【００１０】
ある窒素結合細菌は遊離生存状態で窒素を固定化するが、多くの細菌は、窒素を他の高等植物と結合せしめてのみ固定化できる。
【００１１】
リンの循環は、窒素の循環とは対照的に、実際に自然環境下では閉鎖されている。この入りと出は同一であり、その流れは僅かであり、空気がリンで汚染されることはないだろう。最後に、この元素は水中、海に蓄積し、このうちの僅かのみが（鳥糞石などの形態で）大地へと帰る。
【００１２】
土壌の生きている細胞中で、リンは有機化合物中に蓄積し、これらの鉱化は高速（３〜８g／m2／年）で行われる。生じるリン化合物の溶解度−植物に対するそれらのアクセス可能性−は異なっており、平均１kgの各土壌中で検出できる４００〜１２００mgのリンのうちたった５％のみが使用可能である。所定のリン化合物の回転率は５００〜２０００年である。
【００１３】
いくつかの加リン酸分解性微生物群を土壌中へ輸送することによって、植物に対してアクセス可能ではない錯リン化合物を溶液中にもたらすことができる。もし微生物が土壌「機能」にもたらされ、そして土壌の鉱物成分が十分になれば、リン酸塩を含有する肥料の使用が不要になるあるかあるいはそれは大幅に減らされて良い。
【００１４】
植物は生長するために、−特に作物の熟する時に−多量のカリウムを必要とする。植物の耕作者は、土壌にカリウム成分を伴う肥料を供給することによってカリウムをもたらす。このような肥料は、カリウムイオンを放出する微生物を使うことによってカリウム鉱物から提供されて良い。
【００１５】
植物に関して、土壌中で増殖する微生物が生理的活性を有する化合物を生合成する。これらの中で最も重要な化合物は：植物ホルモンの、オーキシン（インドール−３−酢酸）、エチレン、ジベレリン、カイネチンなどである。いくつかのシュードモナス群は、僅かな量の鉄の存在下で鉄を収集できるいわゆるシデロフォアを生産する。この結果、他の植物病原性細菌及び真菌は、シデロフォアの故に鉄イオンを使用できないので、鉄を欠くことにより阻害作用を受ける。一方で、これらシデロフォアは、鉄を結合し、これらを植物に対して直接供給するので、鉄を欠く土壌において植物の生長を有意に刺激する。
【００１６】
上記を解決するために、いくつかの技術種類が考えられており；いくつかの微生物は全詳細を特定の刊行物中に記載されている。
【００１７】
ハンガリー人の発明者は、粉末化された硝化培養物（ハンガリー国特許HU第１４３.３９１号）、アゾバクター・クロオコカム（Azobacter chroococcum）培養物の製剤とリヒゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）の培養物（ハンガリー国特許HU第１８８.４３４号）、藻培養物（ハンガリー国特許HU第１９５.０６８号）及び再度アゾバクター・クロオコカム、並びにバチルス・メガテリウム微生物の培養物製剤（ハンガリー国特許HU第２０７.７５１号）を開示した。アゾバクター・クロオコカムは寄託番号００２３８で寄託されており、バチルス・メガテリウムは識別番号NCAIM／P／B１１４０である。更に詳細には、ハンガリー国特許HU１８８．４３４号及びHU２０７．７５１号中で、前記著者らは、上記の寄託された微生物の混合物の結果による発酵について記載している。ハンガリー国特許HU２１３１６３号によれば、前記著者らは、HU２０７．７５１の微生物の培養法をカルボキシメチルセルロースにより完成した。ハンガリー人の発明者は、HU１６７１／９６においてアゾスピリラム・リポフェルム（Azospirillum lipoferum）ssp.、アゾバクター・ビネランジsp．、シュードモナス・フルオレセンスspp.及びバチルス・メガテリウムssp.微生物を含む培養物を記載している。
【００１８】
上記の手段において適用された微生物の用途及び効果は、様々な組成の土壌中での様々な培養環境下、様々な気候環境下で短期間に渡ってのみ生存し、様々な植物の環境及びリソスフィアが常に至適条件を生み出すとは限らない、事実によって制限されている。
【発明の開示】
【００１９】
発明の開示
本発明の基本的な目的は、植物栽培及び経済的観点から好ましい効果のものであり、そして同時に様々な土壌及び植物中で生存、増殖しそしてそれらの好ましい効果を様々な土壌中及び様々な植物に対して、様々な気候及び栽培条件下で及ぼすことができるような土壌微生物培養物の調製である。
【００２０】
前記微生物を増殖及び生存せしめることが、土壌の構造、温度条件及び植物の周辺環境に応じて様々に、植物の生長、窒素の固定化、リン酸塩の流動化、植物の生長刺激、土壌構造の改良に好ましい影響を及ぼすという驚くべきことが、研究室で培養された場合に発見されている。様々な微生物群が、シエルノズジョム（ciernozjom）土壌、腐蝕質含有率が低い土壌、黄土、国において又は例えば粘土質土壌環境中でそれらの効果を発揮する。驚くべきことであるが、我々の実験の過程で様々な植物のリソスフィア中、又はその近隣で増殖することができ、そしてそこでそれらの効果を長期に渡り発揮することができる微生物群もいることが明らかになった。
【００２１】
従って、栽培を考えた場合に、経済的観点から重要である所定の植物の環境中で好ましい効果を有するような微生物を単離するための実験が行われた。加えて、カリウムイオンを流動化できる微生物を単離するための実験及び微生物−土壌中から単離されて突然変異手段により研究室で変化した−微生物であって、土壌中に戻された時に低温でも増殖することができ、並びに効果を−当業者も驚くべきほどであるが−それらの効果を発揮するような微生物を単離するための実験も行われた。
【００２２】
更に、我々は、実験の過程において、驚くべき方法で多糖類を生産する所定の微生物で農業の観点から好ましい構造に土壌を変化せしめ、これによって干ばつ耐性が向上することを述べている。
【００２３】
我々の実験を要約すると、窒素、リン、カリウムを植物へと伝達し、植物生長ホルモンを生合成し、土壌構造を改良せしめる多糖類を生合成し、そして播種期に、そしてより寒い国で増殖でき、並びに様々な土壌及び植物中でそれらの効果を発揮できるような微生物を単離することがわれわれの目的であった。更に我々は、製剤であって、その内容微生物が、植物の環境中、リソスフィア中又は直接植物細胞の中で、極めて重要な元素を固定化及び流動化せしめることによって、並びに所定の植物環境中で植物生長因子及び多糖類を生産することによって、所定の植物又は植物のファミリーの生長を促し、その結果、我々が、環境を保護する態様で、肥料の使用を抑えることができるようような製剤を生産することを目的とした。
【００２４】
本発明の目的は、列挙された微生物に関する増殖手段、これらを含む製剤、更には当該微生物を含む製剤の適用、そして具体的には当該微生物の適用である。
【００２５】
本発明は標的製剤を生産するための認識に基づいており、アゾスピリラム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウス（Micrococcus roseus）ssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム （Bradyrhizobium japonicum）var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）及びストレプトミセス・アルブス（Streptomyces albus）var.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）の微生物が最も都合良く、それらは播種期の低温にて増殖でき、植物に対して窒素を供給し、リン酸、カリウム、生合成された生長ホルモン及び多糖類を流動化せしめる。それ故に我々はこれらを単離してこれらの増殖手段を作り上げた。
【００２６】
上記の意味において、我々は１９９８〜１９９９年にヨーロッパにおいて、土壌及び所定の植物の根の環境から微生物を単離し、それらの窒素固定化、リン酸塩及びカリウムの流動化、多糖類生産及び植物ホルモンを生合成する能力をin vitroで試験し、選定の微生物を系統的に同定し、突然変異処理によって２０℃未満の温度で非常に良く増殖するような変異体を調製し、これらを培養するために、増殖技術を作り出し、そしてそれらの培養物から製剤を作製し、そしてそれらの植物の生長及び収率に対する効果を温室及びフィールド実験によって証明した。
【００２７】
アゾスピリラム、アゾトバクター、ブリジルヒゾビウム、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス及びミクロコッカスの種並びに亜種が単離された。
【００２８】
少なくとも、公知のアゾスピリラム種は、グラム陰性の、様々に着色する、土壌中ミクロアエロフィル（micro-aerofil）環境（酸素存在率が１〜２％）下で生存し、植物の根系と密接に関係し、空気の窒素をアンモニアへと還元し、次いでそれを植物中へと移すことができる微生物である。ある群は植物ホルモンをも生合成できる。
【００２９】
アゾスピリラム群は、様々な土壌におけるヨーロッパの様々な耕作地で生長したダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ及び干草畑の草の根の環境から単離された。土壌試料に由来する細菌懸濁はNfb（II）培養培地及びMM培養培地（組成は以下に示されている）上に分散され、そして微好気条件下で培養された。７２時間後、アゾスピリラム培養物が同定された。このアゾスピリラム培養物は、他の小さな細菌及び真菌培養物とは異なり、約３mmのサイズに到達する。
【００３０】
アゾスピリラム培養物が、液体MM及びNb（II）軟寒天培地（組成は以下に示されている）中で対数的に増殖する場合、アゾスピリラム細胞の形態学的特性を示す。この細胞はウィロイドでありそしてS字形態であり、そしてそのサイズは１〜２×２〜４μmである。それらは増殖するためにビオチンを必要とした。顕微鏡観察によれば、それらは素早く移動できる。それらの移動性はそれらの極毛によるものでありうる。それらはそれらの細胞中に、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸粒、及びカロチンを蓄積することができる。赤みがかった変色は、老化培養（ageing culture）によって説明されて良い。それらが増えるためにそれらは有機酸の、例えば、マレイン酸、乳酸、ピロラセミ酸及びブタン二酸を使用できうる。空気中の窒素の固定化を微好気環境下で行う。極端な環境下、例えば、干ばつの場合、低もしくは高い値のpH、窒素もしくは炭素源の欠乏において、細胞は鞭毛の無いポリ−β−ヒドロキシ酪酸粒を含み且つ莢膜多糖類により囲まれている、のう胞へと変換するであるだろう。多くの微生物が使用する炭素源は種に関して様々であり：A.アマゾネンセ（Amazonense）はグルコース+サッカロース+イノシトール（inozitol）+であり、A.ブラシレンセ（Brasilense）はグルコース+サッカロース及びイノジトール（−）であり、A.イラケンセ（Irakense）はグルコース（＋）及びサッカロース（＋）を使用するがイノジトール（−）を使用せず、最後にA.リポフェラム（Lipoferum）はグルコースのみを使用する。窒素を伴わない培地において、炭素源使用の範囲は大幅に異なり、従って、上記の４種を識別できる。我々が単離した微生物の炭素源使用範囲はATCC２９．７３１A.リポフェラム、A.アマゾネンセ、A.ブラシレンセ及びA.イラケンセ新基準標本（Holt、J.G.ら、Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 、第9版、１９９４）とは幾分異なる。典型群とは対照的に、これらは軟寒天中（これは以下に記載されている）、３．５%の塩化ナトリウムの存在下で適切に増殖し、それらの顕微鏡像は培養の様々な時期において異なり、それらの色素生産は、例えばポテト抽出寒天において一層強力である。
【００３１】
単離されたアゾスピリラムのいくつかは、種アゾスピリラム・リポフェラム、アゾスピリラム・アマゾネンセ、アゾスピリラム・ブラシレンセ並びに種アゾスピリラム・イラケンセに近く、我々はアゾスピリラム・ブラシレンセ群の１つを選択する一方これらの種に対して更なる実験を行った。
【００３２】
上記の土壌試料から、アゾトバクター微生物がNfb（II）軟寒天上で選択培養により単離され、次いで、MM及びFjodorov培地上分散されることによって、そして我々の亜種の１つがその窒素固定化能力に基づいて選択されて更なる実験のために保存された。前記群の細胞は球状形態の多形態（pleiomorph）である。酸素の存在下でこれらは素早く動く。これらはグラム陰性である。これらは窒素を伴わない培地上で適切にラムノース及びメソイノシトールを使用し蛍光の黄緑色の色素を生産する。
【００３３】
周知のように、リゾビウム（Rhizobioum）は、マメ科の根上で根粒を形成し、次いで植物細胞の中で、これらが直接、固定された窒素を植物へと移動せしめるようになる。様々なマメ科植物が様々なリゾビウム種と連絡し、ダイズはブラジルヒゾビウム群と連絡する。このことは、かかる、穀物を収穫した後には死滅するリゾビウム種に独特であり、即ち、それは土中で多量に維持されないので、この群を土壌処理のために用いることは賢明である。我々は、ブラジルヒゾビウム群を７月１３日に、Szeged−Kiskundorozsmaに近いSubasaのダイズプランテーションから単離した。黄土で生長する植物から十分に生長した植物が選択され、そしてその根から十分に生長した根粒が切り外された。実施例に示されているようにして単離された微生物の好冷変異体は寄託された。
【００３４】
我々が収集した試料において、我々はリン酸を流動化する微生物を探索し、そして系統学的観点から選択の微生物を試験した。一部の微生物はシュードモナスであり、その他はバチルス種であることが明らかになった。
【００３５】
シュードモナスはグラム陰性の、厚みの薄い形態の好気性細胞であり、これらは大部分の培地上で蛍光色素を生産し、これらは腐生菌である。カロチンの生産は確認されず、これらは４０℃を超える温度で増殖することは無い。ゼラチン寒天上では液状化が確認される。我々の群によってグルコースが使用され、デンプンは使用されていない。蛍光シュードモナス群の変異体は系統的に密接な関係があるが、所定の系統的異種が我々の微生物と典型的群の間で確認され、即ち、我々の微生物−シュードモナスの特徴の−は適切にグルコース、ガラクトース、酢酸、マルトース、グリセリン及びピロラセミ酸を使用する。それは、フルクトース、D−アラビノース、マルトース、ラクトース、デンプン及びイヌリンを使用しない。しかし、これらは典型群とは対照的に、キシロース、サッカロース上で増殖でき、そしてある程度ソルビトール上で増殖できる。それらは単一の炭素源としてグリシンを使用する。
【００３６】
上記に基づいて、我々の微生物の１つが種シュードモナス・フルオレセント（Pseudomonas fluorescent）として同定され、そしてそれはビオーバー(Biovar)III 群に属する変異体に近いところに位置することが発見された。我々は、この群をシュードモナス・フルオレセントssp.と命名した。
【００３７】
系統的特長に基づき、不溶性リン酸塩を溶解せしめることができるバチルス細胞のうちで、いくつかがバチルス・ポリミザであることが分かり、あるものはバチルス・メガテリウムであることが分かった。いくつかの群が更なる実験のために選択された。
【００３８】
カリウム鉱物から、カリウムイオンを流動化せしめることができる微生物を単離するために、カリウム、長石及びモスクバイト（muscovite）を含有する物質の表層から微生物を単離し、次いで固体状のカリウムを伴わない培地上で実施例に示されたような試験をし、カリウムの流動化を証明した。実施例に示された手段の突然変異処理手段を適用することで、ストレプトミセス・フィジクロフィリック（Streptomyces psychrophilic）として同定された微生物が生産されて寄託された。
【００３９】
我々は、系統学的、形態学的試験及びリボソームDNS試験の後に、ミクロコッカス・ロセウスであることが分かり、そして植物試験の過程で非常に有利な効果を示した微生物を単離した。この微生物の群の１つは寄託されており、その群は研究室にて形質転換されていた。
【００４０】
本発明は、土壌中に接種された好ましい効果を有する微生物が、秋及び早春における気候条件下並びにより寒冷な気候の国での気候条件下における播種及び植物最初の生長の時に、可能な限り速く増殖することができるという事実にも基づいている。従って、上記に従い微生物は、実施例４に示したように処理され、単離されて維持されていた。次いで、公認された手段によって、低温にて増殖する突然変異体及び変異体も誘導されNational Selection of Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託された。
【００４１】
本発明は、適用することにより植物栽培の収率が増加するような製剤及び手段に言及する。生産は、様々な耕作地、様々な植物の環境から単離されて試験された微生物であって、所定の植物ファミリーの環境中で長期に渡り生存し、様々な土壌中、低温でも増殖する微生物を培養すること、並びに当該培養物を含む製剤を対応する植物、種子、又はこれらの耕作地にもたらすことによって達成されている。本発明によれば、前記製剤は土壌、植物又は植物の種子を以下の微生物の１種類以上を含む製剤で処理することに使用されて良い。その微生物とは： アゾスプリウム・ブラシレンセssp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセントvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１２．．）及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１２．．）である。
【００４２】
処理の結果、植物の生長が加速するであるだろうし、これらは一層病原耐性になるであるだろうし、土壌構造及び植物の水分供給が改善され、そして肥料の使用を減らすかあるいは肥料を全く使用せずとも高い収率がもたらされるであるだろう。
【００４３】
本発明の手段の最も重要な利点の１つとは、それを、植物栽培の過程で実行することによって、窒素、リン酸塩、及びカリウムをベースとする肥料の使用が事実上不要になるかあるいはかなりの程度で削減することができることである。肥料の環境汚染効果が明らかになっている。微生物細胞中で生合成される、植物の生長を促す化合物は、処理された植物の生長、根の生長を加速せしめ、そして同時にこれにより植物の水分供給が改善されるであるだろうし、供給された微生物が植物病原微生物の増殖を抑制し、我々のいくつかの微生物の細胞中でのポリ多糖類合成により土壌構造及び水分バランス及び特に土壌の寿命が好ましく改善される。本発明の製剤、それらの作製及び適用は、同じ目的及び用途の公知の製剤及び調製手段とは対照的に、様々な土壌から単離された、経済的に重要な耕作植物に対して所定の特異的な効果を発揮する様々な微生物の使用、様々な効果に基づいている。その微生物は、秋及び早春の低温並びにより寒冷な気候の地域でも増殖できる。
【００４４】
本発明の微生物は、炭素源として例えば、グルコース、デンプン、サッカロース、もしくは糖蜜、窒素源として、コーン浸出液（corn steep liquor）、カゼイン、イーストエクストラクトもしくはアンモニウム塩、更なる他の無機塩及び微量元素のイオンを解離する塩を含有する培地上で培養できるが、専門家のための証明として、任意の同化可能な炭素源及び窒素源、無機塩が、本発明の細菌を増殖せしめるために用いることは可能である。
【００４５】
本発明の微生物を含む培養物は、処理される土壌に対して又は植物に対して栽培のために用いられる環境中に直接添加されて良いが、微生物の生物学的可能性を維持する製剤、これらの中で特に、細菌を粘着力により種子に対して固定化する担体を含有する製剤も調製されて良い。土壌へともたらされる微生物の量は５×１０11〜５×１０15細胞／haで様々であり、そして好適な細胞量は１０12〜１０13である。
【００４６】
Budapest Agreementの観念から、我々は、様々な植物環境から単離し同定した、低温でも増殖できる微生物をNational Collection of Agicaltural and Industrial Micro-organismsに寄託し、ここでそれらは以下のような寄託番号で登録されている。
アゾスプリウム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、
アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、
シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、
バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、
バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、
ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、
ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及び、
ストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）
【００４７】
本発明の目的は寄託された群及びそれらの人工及び天然の突然変異体、変異体又は任意の公知の方法で得られた上記の微生物の群系統にも及ぶ。
【００４８】
我々は、以降、本発明を保護する範囲を限定することなく、例によって本発明を説明する。
【００４９】
例において、特に断らない限り、％は重量パーセントで表されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
様々な土壌からそして様々な植物の環境から空気の窒素を固定化する微生物を単離してそれらの窒素固定化能力を証明する
アゾスピリラム種はグラム陰性の様々に着色する細菌であり、微好気環境（１〜２％の酸素存在）下で空気の窒素をアンモニアへと還元することができ且つそれらを植物のために利用できる。
【００５１】
アゾスピリラム種を様々な土壌試料（腐植、黄土、塩質、褐色及び黒色土壌）から、様々な植物（穀類、ヒマワリ、トウモロコシ、草など）の根の環境から単離した。化学誘引物質の、例えば、有機酸及び糖が走化性によってアゾスピリラム群を引き付ける。細菌は、鞭毛の役立ちによって根の方へと移動しそして到達し、コロニー化する。
【００５２】
所定の土壌試料の１０倍、１００倍、１，０００倍及び１０，０００倍の希釈物を滅菌蒸留水により作製し、懸濁１００〜１００μlをMM及びNfb（II）軟寒天が入っているペトリ皿上に塗布した。前記MM培地の組成は以下のとおりである。
【表１】
次いで、グルコースをMM培地の他の成分とは個別にオートクレーブで滅菌（１２１℃、３０分）し、６０℃の温度に冷ました後に混合した。滅菌培地を、１Nの滅菌NaOH溶液によりpHに７．４に調節した。
【００５４】
Nfb（II）培地の組成は以下のとおりである。
【表２】
培地を1NのKOH溶液でpH６．８に調節した。
※微量元素溶液の組成は以下のとおりである。
【表３】
培地中へもたらされMMプレート上で発見される微生物を嫌気性細菌恒温相中に置いて、恒温相の空気空間を窒素で交換し、次いで、十分な量の空気で還流するとともに、酸素濃度を１．６％にセットした。次いで、プレートを３２℃の温度でインキュベートし、７２時間後にアゾスピリラム微生物を同定した。系統希釈に対応して、１０倍希釈懸濁物を塗布したプレート上では、連続的に細菌の領域が広がっていった一方で、１０，０００倍希釈した懸濁は、全体に３０〜５０の培養物が広がっていた。他の小細菌とは異なり、アゾスプリラム培養物及び真菌培養物は約３mmのサイズに到達した。培養物のうちいくつかは、形態的にアゾスプリラム培養物に類似していた。我々は、これらのうちいくつかのを更に研究した。
【００５７】
Nfb（II）軟寒天培養物を、第一に全アゾスピリラムが増殖し、そして形態的特長を確認できる、好気生物恒温相中、上記培地中及び上記培養環境下に置いた。
【００５８】
MM培地及びNfb（II）培地から獲得した様々なアゾスピリラム細菌群を、微生物学的な習慣に応じて、１次細菌培養物を、１つの培養物につき、完全Tag培地上で２回広げる方法で増殖せしめた。アゾスピリラム細菌群を、１つの培養物につき２回、液体Tag培地において広げることよって精製し、群培養物で保存した。−８０℃における微生物懸濁を群培養物とみなしそして全ての実験をこの培養物から開始した。
【００５９】
Tag培地の組成は以下のとおりである。
滅菌後、以下の化合物の水溶液を、以下のような最終濃度で添加した。
０．１M、CaCl2×６H2O ０．１％、
０．１M、MgCl2×６H2O ０．１％、
グルコース（個別に滅菌した） ０．２％
【００６１】
滅菌後、培地のpHを７．０〜７．２に調節した。
【００６２】
根のコロニー形成は簡単な実験で検出できる。滅菌パーライト（１５cmの直径の容器）及び同数（１×１０10細胞／容器）の細胞中に播いた、アゾスプリラム細菌で処理したトウモロコシ及びコムギ植物の根上では、顕微鏡計測に基づき、コントロールにおけるよりも、本質的に一層のアゾスプリラム細胞を検出した。根のコロニー化は特異的認識機構に基づき行われる。コロニー化の過程で、アゾスプリラム細胞は根のマトリクスに侵入し、そしてこれらはそこで−それらの窒素固定化作用により−主要植物に必要な窒素の一部を補うことができる（連合窒素固定化）。このことは、我々の研究室における実験の過程でアゾスピリラム群を接種されたトウモロコシ及びコムギの緑色の部分（green mass）の生長がより早いことによって明らかになっており、その結果の詳細を後ほど記載している。アゾスプリラムは植物ホルモン及び生長を促す物質をも生産する。これらの物質及びそれらの主要植物に対する好ましい効果は、発芽効率の増加によりそして強力な植物生長、そして研究室環境下で行った実験により明らかにできる。
【００６３】
単離されたアゾスプリラム種の形態的特長は、本説明の幅広い部分にて見出される。
【００６４】
窒素を伴わないMM培地における選択的培養ではなく、Nfb（II）軟寒天上での選択的培養で、アゾスプリラム微生物を耕作地土壌試料から単離した。これらの群が、系統学的特徴及び炭素源利用スペクトル、空気中の分子状窒素をSW５−０１−０７と同じく大きい程度で固定化することに基づき、アゾスプリラム・ブラシレンセであることを発見し、次いで、後に記載したように、低温度でも増殖し、多糖類を生合成する変異体を単離し、これらうち１つを寄託した。
【００６５】
アゾトバクター群を単離するために、組成を先に示したNfb（II）培地及びMM培地の使用に加えて、土壌試料を、アゾトバクターが特徴的形態学的特性を示すFjodorov培地でも培養した。Fjodrov培地の組成は以下のとおりである。
【表４】
滅菌する前に前記培地のpHを1NのNaOH溶液で７．０に調節した。
【００６７】
Nfb（II）軟寒天上での選択的培養、次いで、窒素を伴わないMM培地及びFjodrov培地上での選択的培養で、アゾトバクター微生物を耕作地土壌試料から単離した。これらの群は、系統学的特徴及び炭素源利用スペクトル、空気中の分子状窒素をSW６５−０１−３４で記録されたのと同じく大きい程度で固定化することに基づき、アゾトバクター・ビネランジであることを発見し、次いで、後に記載したように低温度で増殖する変異体を単離し、我々はこれらのうち１つを寄託した。
【００６８】
アゾスプリラム群及びアゾトバクター群の窒素固定化能力をアセチレン還元法によっても特定した。前記方法（Dilworth M J、J.Biochem. Biophys.Acta ２７５、２８５、１９９６）に従い、アセチレンを注入器によって閉鎖された皿における培養物中に注入し、そして１２時間インキュベーションした後、ガス混合物０．２５mlをPerkin−ElmerガスクロマトグラフのPropak Nカラム中に注入した。前記ガス混合物のアセチレン及びエチレン濃度を水素炎イオン化検出器によって測定した。アセチレン及びエチレンのピークの高さから、それは完全にニトロゲナーゼの酵素複合体活性により行われていることが分かった。我々のアゾスピリラム群及びアゾトバクター群は、１５〜８５nmolの量のアセチレンを１時間以内にエチレンへと還元した。
【００６９】
ブラジルヒゾビウム群をブラジルヒゾビウム群を７月１３日に、Szeged−Kiskundorozsmaの近くに位置するSubasaのダイズ植物から単離した。黄土で生長する植物から十分に生長した植物を選択し、そしてその根から十分に生長した根粒を切り外した。根粒を滅菌蒸留水で洗浄し、押しつぶし、そして粒子を生理食塩水中で懸濁せしめた。懸濁から、無菌条件下で希釈系を調製し、そして完全培地上に広げた。インキュベーションの４８時間後に、増殖する培養物の窒素固定化能力をいわゆる共生植物試験によって、以下のようにして特定した。それは：市販の牧草（medic）（Medicago Sativa）の種子表層を、７２℃の温度で２時間の熱処理をしそして２０％Hypo溶液により慎重にリンスすることによって滅菌し、そして１％寒天を含む蒸留水培地中で発芽させた。苗木を１．５％Gibson 斜角（oblique）寒天（後の記載を参照のこと）上に置き、温室で１週間に渡り飼育した。この１週齢の植物に各細菌培養物の細胞を接種し更に８週間に渡り温室で飼育した。非常に至適な生長を示すこの３つの植物（根の上の部分の乾燥重量が３〜５mgのコントロールの植物とは対照的に、２２〜２６mgである。）に属する群から、３つを選択し、そして形態学的及び系統学的観点から重要なその特性に基づき、我々はそれらをブラジルヒゾビウム・ジャポニカvar.PH−２−１−３と命名した。
【００７０】
実施例２．
リン酸塩及びカリウム可溶化微生物の単離
土壌試料を世界の様々な所から収集し、当該試料の懸濁水をTag培地（上記を参照のこと）上に広げた。次いで、シュードモナス培養物及びバチルス培養物の単離した物質及び細胞形態を試験した。
【００７１】
微生物学の実際に従って、１次細菌培養を１つの培養物につき数回、完全Tag培地上に広げることによって、様々なシュードモナス群及びバチルス群を精製した。細菌群を増殖せしめ、そして液体及び固体Tag培地中に広げることにより精製して保存した。
【００７２】
微生物のリン酸塩流動化特性を、改変Pikovskaya（HP）及び１０％リン酸三カルシウム及びグルコース（０．２％）を補足した、１％のヒドロキシアパタイトを含有するNutrient Agar（Ooxid）培地において試験した。
【００７３】
実験の過程で使用した培地の組成は以下のとおりである。
改変Pikovskaya培地：
以下の化合物の溶液を前記培地に対して滅菌後に添加した。
２０mg／１００ml、FeSO4×７H2O １％、
４０mg／１００ml、MnSO4×７H2O １％、
当該培地を滅菌する前にpHを７．２に調節した。
Naoxg：＋０．２%のグルコースの製造説明書に従い調製したNutrient agar（Oxoid）
【００７５】
Pikovskaya（HP）培地での予備実験の過程で選択した群のリン酸塩可溶化能力を試験している間、３０℃の温度で、３〜４日以内に増殖した培養物が２９mm及び３８mmの溶液リング（solution ring）を作り出した。Tag斜角寒天から獲得した同群の細胞懸濁を１mlの蒸留水と伴に１０％リン酸三カルシウムを補足したNaoxgプレート上に作られた穴に滴下した（０．１ml／穴）。培養物を３０℃の温度でインキュベートし、２〜３日以内で十分目立つ溶液リングを確認した。これらのサイズは、シュードモナス群を使用して詳細に試験した場合、２４mmであり、そして我々がバチルス群を使用した場合は２６mmであり、平均サイズは３４mmと見積もった。
【００７６】
各シュードモナス群及びいくつかのバチルス群が強力なリン酸可溶化特性を有していることが明らかになった。両方の無機リン酸塩を担持する変異体は、溶液中で良く検出でき、従ってこれらは優れたリン酸塩可溶化特性を有するといえる。
【００７７】
それらの系統学的特性及び炭素利用スペクトルに基づき、試験により選択された１４のシュードモナス微生物及び２５のバチルス微生物が、シュードモナス・フルオレセンス及びバチルス・ポリミザ並びにバチルス・メガテリウムであることを発見し、それらを、順にSW−１−１−１４、SW１７−１−１５及びM３２−１−１０の印をつけ、次いで、後に記載したように、低温でも増殖しそして大量に多糖類を生合成する変異体も単離して寄託した。
【００７８】
先に示した組成のPikovskaya（HP）培地から塩化カリウムを除き、そしてヒドロキシアパタイトの代わりに微細粉末中に破砕した１％のFledspar及びmica schistを加えたことが違うこと以外は、カリウムイオンを流動化せしめる微生物の単離を上記のようにして達成した。
【００７９】
鉱物を水中で完全に不溶性にするかあるいは溶液中で部分的に不溶性にする微生物培養物の周辺では、透明な領域が形成されるだろう。
【００８０】
これらのいくつかを選択し、そして系統学的特長、形態学的特長及び炭素利用スペクトルに基づきバチルス及びストレプトミセスであることを発見した。我々の１５の群に１−０１５−０００３のような番号を付け、次いで、後に記載したように、低温でも増殖する変異体を単離し、これらの１つを寄託している。
【００８１】
実施例３
シデロフォア及び植物ホルモンを生産する微生物の単離
実施例１及び２に記載のようにして単離した群のシデロフォア及び植物ホルモンを生産する能力を、KingB培地を使用することによって試験した。この組成は以下のとおりである。
培地を滅菌する前に水酸化ナトリウム溶液でpHを７．２に調整した。
【００８３】
シデロフォアを生産するシュードモナス群は鉄イオンを固定化し、そしてそれらは鉄が乏しい土壌中でも植物に対してもそれらを輸送する。更に、これらはいくつかの植物病原微生物、例えば、エルウィナ・カラトボラ（Erwina caratovora）の増殖を阻害する。何故ならこれらは、固定化された鉄を利用できないからである。我々は、大腸菌（Esherichia coli）MC１０６１群の増殖を阻害することによってシデロフォア生産を試験した。寒天培養に由来する２つの群の細胞懸濁を蒸留水で調製し、次いで、鉄を伴わないKingBプレートと鉄を含有する（１μMのFeCl3×７H2O）KingBプレート（３０〜５０μl）上に滴下し、４８時間に渡り温度２８℃で培養し、しかる後に、Tag寒天から獲得した大腸菌MC１０６１培養物をプレートに塗布し、そして更なる２８時間に渡り温度２８℃でインキュベートし続けた。培養物の周辺では、様々な阻害地帯が確認できる。４つの実験の平均の結果を表１に示している。ネガティブコントロールとしてバチルス・メガテリウムを、ポシティブコントロールとしてシュードモナス・フルオレセンス（を使用した）。
【表５】
mob４及びポジティブコントロール群によるシデロフォア生産を試験する過程で、鉄イオンの存在下では消える多くの阻害地帯が確認された。
【００８５】
先に述べたように、いくつかのシュードモナス群は植物ホルモンを生産する。選択した微生物を、これらが上記のTag培地中でジベレリン酸を生合成することができるかどうか試験した。試験を標準ジベレリン酸A（Sigma）を使用し、（４０□g／ml）のシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Merck）によって行った。酢酸エチルによる培養物の抽出を、２倍の体積の炭酸水素ナトリウムでの抽出後に行い、次いで、pH２．５の溶液中、酢酸エチルで再度行った。抽出の蒸発残さ中で、スポットのRf値が標準に近い以下の群を発見した。
【表６】
SW１−１−６及びM３２−１−９と印をした群を選択した（これらはホルモンを約３〜１５□g／ml生産する）。
【００８７】
全体に渡り記載した群を系統学的な観点から試験して同定した。
【００８８】
実施例４
細胞外多糖類を生産する微生物の単離
４A．ブラジルヒゾビウムの選択
ブラジリヒゾビウムPH−２−１−３群を、１％グルコース及び１％サッカロースを含有するTag培地（上記を参照のこと）中で広げ、そして培養物周辺の多糖類（粘液）量を分析した。多糖類を生合成するPH２−１−１及びPH２−１−２群を選択した。
【００８９】
４ B ．バチルスの単離
バチルスM３２−１−１０及びSW１７−１−１５群を、１％グルコース及び１％サッカロースを含有するTag培地（上記を参照のこと）に広げ、そして培養物周辺の多糖類（粘液）量を分析した。M３２−１−６．８及び１０及びSW１７−１−７．１１及び多糖類を合成する１５群を選択した。
【００９０】
ミクロコッカス・ロセウスであることが分かった単離された微生物は、グルコース及びサッカロースを含有する完全培地上で、培養培地を粘性の物質に変化せしめる多量の多糖類を生合成している。
【００９１】
我々の試験によって選択された群は、公知の構造の、サクシノグリカン（succinoglucone）型の水溶性の多糖類を生合成している。
【００９２】
実施例５．
寒冷耐性微生物の単離
実施例１〜４により選択した微生物を、突然変異を引き起こす薬剤及び放射線で処理した。蒸留水で調製した微生物の懸濁を０．０１、０．１、１．０、１０及び１００□g／mlニトロソグアニジンで１、３、５、１０及び３０分に渡り処理した。この処理に続き、細胞の懸濁を遠心し、蒸留水で２度洗浄し、次いで、細胞をTag培養培地上に広げた。微生物１０9／mlを含有する蒸留水細胞懸濁に、１０cm離れたところから１５WのUVランプの下で１、３、５、１０及び３０分に渡り細胞を維持することによって処理を繰り返した。細胞懸濁をTag培地上に様々な希釈率で広げた。
【００９３】
Tag培地を１８℃で１９２時間に渡りインキュベートし、しかる後に、１８℃でインキュベートしたTag斜角寒天上で最大の培養物を単離した。
【００９４】
以下の増殖した培養物をコントロールにして且つ維持した。
【００９５】
単離されたものの中で、選択され且つ寒冷耐性の微生物を分離して寄託した。
アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、
アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、
シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、
バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、
バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、
ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、
ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及び、
ストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）
【００９６】
実施例６
微生物の培養
６．A完全培養培地上での培養
Tag培養培地から斜角寒天培養物を調製し、次いで、３０℃の温度で４８時間に渡りインキュベートした。アゾスピリラム、アゾトバクター、バチルス、ブラジルヒゾビウム、シュードモナス、ストレプトミセス又はミクロコッカス培養物を以下の組成の−Ta1i−と命名した培養培地中に接種した。
【表７】
培養培地１００〜１００mlずつを５００mlのErlenmeyerフラスコに入れ、そして１２１℃の温度で３０分に渡り滅菌した。この滅菌培養培地に斜角寒天培養により増殖した微生物を接種し、培養物の培養を６０円回転／分で動く回転テーブル上で、温度２５℃にて、２３６分に渡り行った。次いで、以下の組成のTa１f主発酵培地中へ接種した接種物から５％の量を用いて、顕微鏡試験により増殖を確認した。
【表８】
Erlenmeyerフラスコ中で培養培地／１００mlを滅菌し、そしてグロス体積１０l且つネット体積５lの実験室発酵槽中の培養培地／１００mlを、上記の環境下で滅菌した。
【００９９】
フラスコ内に置いた培養物を回転テーブル上で培養し、一方で発酵槽中においた培養物を細胞数／mlが−細菌に依存して−４×１０8〜１．３×１０9の値に到達する場合、しかもv／vばっ気すること及び３６０回／分で回転する二重入口（dubole inlet）を伴うターボミキサーを２４時間に渡り操作することによる通常の方法において培養した。
【０１００】
より多くの量で培養物を調製するために、１０lの培養物を、上記の組成のTa１i培養培地により、前記発酵条件下で調製し、次いで、滅菌したTa１i培養培地１００l及びTa１f培養培地１００ｌを各５−５lずつ接種した。この培養を上記発酵環境下で２４時間に渡り続け、次いで、土壌において、Ta１f培養培地により増殖した培養物、Ta１i培養培地により増殖した培養物５０lを用い、１０００lの滅菌Ta１f培養培地を接種した。次いで、培養を上記発酵環境下で２４時間に渡り行い、検査後、培養物をすぐに使用できるようにした。異常に強く発泡する場合には、０．０１％のポリプロピレングリコールを抗発泡剤として添加した。
【０１０１】
６B．半最小培養培地による培養
実施例６に示した手段を繰り返した。Ta１f培養培地の代わりに、以下の組成のTaf２培養培地を使用したことが違う。
【表９】
培養が完了した後、細菌によるが、培養物は、１〜７×１０8細胞／mlを含む。
【０１０３】
実施例７
土壌構造の改良実験及び植物栽培実験
７A．土壌構造を改良する実験
Somlyoszigetに近いDanubeにて回収した砂質土壌とEsztergomから回収した粘土質土壌を９０×９０cmのトレーに置いた。その層厚は２５cmであった。砂質土壌をトレーあたり１０gの硝酸アンモニウム及び５ｇのリン酸カルシウムで処理した。トウモロコシをトレーに、種１０４粒／トレーで播いた。我々は評価時に、５つの最大に生長した植物及び５つの最も生長しなかった植物のデータを考慮しなかった。蒸留水で洗浄した後に温度４５℃で２日乾燥せしめた根の重量を測定した。Ｎｏ．１のトレーはその後水分が豊富であり、Ｎｏ．２のトレーは播種時に水が豊富であったがその後は水が全くなった。「a」の印をつけたトレーに、多糖類を生合成する微生物を、１ｍ2に対して各細菌１０8細胞で接種した。その微生物群の培養物とは、National Collection of Agricultural and Industrial Micro-organisms、に寄託している、実施例６により調製した、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）及びブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）である。「b」の印をつけたトレーは、微生物で処理しなかった。
【０１０４】
表３において、播種後３３日で得られた結果を示している。この結果は、１つの植物に対して計測された平均値で示している。
【表１０】
表４において、水を与えなかった砂質土壌及び粘土質土壌（トレーＮｏ．２）の崩壊及び亀裂の程度を示している。崩壊の程度とは、我々は、土壌片の多くがペーパーシート上で散乱し且つ僅かに揺する過程では分解しない、２mm未満（−）、２〜５mm（＋）、又は５mm以上（＋＋）の断片を意味する。土壌表層の亀裂の程度を、亀裂がない場合を＋＋、僅かに細い亀裂を＋に印し、一方で干ばつ土壌の破壊の特徴の、亀裂の大きな線の存在を−のように印している。
【表１１】
表３及び表４のデータから、多糖類を生合成する微生物の存在が植物の生長を向上せしめ且つ好ましい土壌構造にすることが分かった。
【０１０７】
７.Bフィールド実験
実験を２０００年に、Mosonmagyarovar UniversityのImprovement and Cultivation Technological Stationのランダム区画配置において、微生物混合物１０l／haを用い、繰り返し４回行った。
【０１０８】
実験土壌の種類：砂質土壌領域、厚さ：１２０〜１４０cm、含水率２．４%、降水：乏しい
【表１２】
実施例８
本発明の微生物を含有する製剤の調製
８A．微生物混合物の調製
実施例６により調製した、培養物アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）を、至適に等しい割合で混合しそして５l〜５０l／ha、至適には１２l／ha当量の割合で処理する土壌中に、１年のうち霜の降りない任意の時期、至適には３月〜１０月に適用した。
【０１１０】
８.B単子葉植物を処理するための製剤
実施例６の手段に従い製剤を作製した。以下の微生物を使用したことが実施例６とは異なる。その微生物は：アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）である。
【０１１１】
８．C 双子葉植物を処理するための製剤
実施例６の方法に従った。以下の微生物を使用したことが実施例６とは異なる。その微生物は：アゾスピリラム・ブラシレンセspp.SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar.SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar.M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／P００１３０２）であり、本発明の製剤を調製した。
【０１１２】
８D．凍結条件下で乾燥した製剤の作製
実施例６の微生物懸濁水から２lを、Gelman SPA凍結装置中で装置の製造説明書に従い凍結乾燥せしめた。乾燥微生物粉末をそれ自身で使用するかあるいは使用次第では、炭酸カルシウム、デンプン、グルコース、又はセルロースと、１：１〜１：１００の割合で混合し、次いで製剤を使用する時迄、４〜１０℃の温度で保存した。
【０１１３】
８Ｅ．担体を含有する製剤の調製
至適に、実施例６の培養培地により調製した培養物を等しい割合の有機肥料、ダイズ粉（一般には４メッシュ粒サイズ）、メチルセルロース又は片栗粉（patato starch）などと、製剤が微生物を、５×１０8〜１０10、至適には５×１０9含有するように調製した。次いで、湿製剤又は４０℃未満の温度で乾燥せしめた製剤を、２及び２０kg／haの量、至適には５kg／haの量において、処理する土壌中に適用した。至適に、１０13微生物細胞／haを土壌中に組み込んだ。
【０１１４】
要約
本発明の目的は、植物の生長を向上せしめ且つ収率を高めるために微生物で土壌を処理するための製品及び手段、当該製品を作製するための手段、当該製品の基礎として働き、低温で増殖し、多糖類を生合成する微生物株、及びこれらを生産するための手段である。本発明の微生物細胞又はそれらの化合物の１つは、土壌にへと移されるかあるいは植物の種子に固定化されるだろう。
【０１１５】
本発明の手段により、製品が土壌中に移されるだろう。この製品は、土壌細菌群を１種類以上含有する。その細菌群は、空気中の窒素を植物が利用できる化合物へと転換する、鉱物化したリン酸塩化合物及びカリウム化合物を可溶化する、そして植物の生長を向上せしめる物質を生合成する、土壌の構造に至適な影響を与える多糖類を生産する、様々な土壌から単離されて研究室で改変され、従って十分な収率に到達し、実際上は高価な肥料の使用を排除する細菌群である。
Claims (10)
- 土壌及び植物の種子を処理するために適切な製剤であって、植物環境中、様々な土壌型において増殖することができる１又は複数の生きている微生物を含有し、好適には２０℃未満の低温、並びに好適にはpH５．0未満の低pHの土壌でも増殖する微生物として、National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託された微生物のアゾスピリラム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）ssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾバクター・ビネランジ（Azobacter vinelandi）ssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）var. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザ（Bacillus polymyxa）var. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）var. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウス（Micrococcus roseus）ssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカム （Bradyrhizobium japonicum）var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）及びストレプトミセス・アルブス（Streptomyces albus）var.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）の培養物を１種類以上、５×１０6〜１０11細胞／g、好適には１０7〜１０10細胞／gの量で、農業上の観点から農業上許容でき且つ当該微生物に対して無毒性の農業上許容できる湿もしくは乾燥担体と共に含有することを特徴とする製剤。
- 水及び／又はダイズ粉及び／又はデンプン及び／又はセルロース及び／又はグルコース又はそれらの誘導体を担体として含有する、請求項１に記載の製剤。
- 土壌及び植物種子を処理するために適切な製品並びに／又は植物環境中、様々な土壌型において、好適には２０℃未満の低温及び好適にはpH５．０未満の低pHでも増殖することができる、１もしくは複数の生きている微生物を含有する製剤を調製する方法であって、炭素源及び窒素源及び無機塩を含有する培養培地上で、National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託された、微生物のアゾスピリラム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニカムvar. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）及びストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）を１種類以上、５×１０7〜５×１０9／mlの細胞数に到達する迄別々にもしくは一緒に培養し、任意に、獲得した１又は複数の培養物を特定の割合で混合すること、又は任意に、当該培養物を担体上に沈着せしめるかあるいはそれと混合すること及び任意に、従来の方法で凍結乾燥することを特徴とする方法。
- 炭素源としてグルコース及び／又はサッカロース及び／又は糖液、窒素源として塩化アンモニウム及び／又は硝酸アンモニウム及び／又は硫酸アンモニウム及び／又はトウモロコシ浸出液（corn steep liquor）及び／又は、カゼイン水解物並びに無機塩として炭酸カルシウム、及びナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオンを解離する塩、及び微量元素が使用されている、請求項３に記載の方法。
- National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに以下の番号：
アゾスピリラム・ブラシレンセssp. SW５１（NCAIM ／P／B００１２９３）、
アゾトバクター・ビネランジssp. M６５７（NCAIM ／P／B００１２９２）、
シュードモナス・フルオレセンスvar. SW１１（NCAIM ／P／B００１２９６）、
バチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、
バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９１）、
ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）、
ブラジルヒゾビウム・ジャポニカムvar. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）及び、
ストレプトミセス・アルブスvar.０００３LP（NCAIM ／P／B００１３０１）、
で寄託された、２０℃未満の低温及びpH５でも至適に増殖する微生物。 - 土壌試料を、植物の環境から、所定の種類の土壌の上方（上部）４０cmから採取し、選定の微生物を同定し、突然変異因子による処理を適用し、そして低温でも増殖する変異体を単離することを特徴とする、請求項５に記載の微生物を調製する方法。
- 微生物細胞の、霜の降りない時期に、haあたり又は土壌中、１０10〜１０14、至適には１０11〜１０12の量での輸送を適用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製剤により土壌を処理する方法。
- 前記種子を前記微生物の１つ又はそれらの混合物を含有する液体製品で処理することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製剤により植物の種子を処理する方法。
- 微生物起源の多糖類、好適にはサクシノグリカン（succinoglucone）を生合成する微生物を土壌中に輸送することを特徴とする、土壌構造を改善又は維持する方法。
- 多糖類を生合成することができる微生物、至適にはバチルス・ポリミザvar. SW１７（NCAIM ／P／B００１２９５）、バチルス・メガテリウムvar. M３２６（NCAIM ／P／B００１２９２）、ミクロコッカス・ロセウスssp. A２１（NCAIM ／P／B００１２９４）又はブラジルヒゾビウム・ジャポニカム var. PH２５（NCAIM ／P／B００１３０２）を含有する製品を適用することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
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