KR100577717B1 - 작물생장을 촉진시키는 미생물 바실러스 메가테리움kr076(kacc91049) 및 이를 함유하는 미생물 제제 - Google Patents
작물생장을 촉진시키는 미생물 바실러스 메가테리움kr076(kacc91049) 및 이를 함유하는 미생물 제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 화학비료를 대신하여 식물의 생장을 돕는 미생물 균주인 서열번호 1의 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면, 본 발명은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하여 공중질소를 고정하고 식물의 생장을 촉진시키며, 식물 병원균의 생장을 억제하는 미생물 균주인 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 및 이를 포함하는 미생물 제제에 관한 것이다.
바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) * 공중질소 고정 * 식물생장 촉진 * 미생물 비료
Description
도 1은 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)의 분리작업 광경을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도2b는 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)의 전자현미경 사진이다.
도 3은 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)이 식물뿌리 내부에 정착한 것을 촬영한 사진이다.
도 4는 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)의 미생물 기탁증이다.
본 발명은 화학비료를 대신하여 식물의 식물의 생장을 돕는 미생물 균주인 서열번호 1의 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면, 본 발명은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하여 공중질소를 고정하고 식 물의 생장을 촉진시키며, 식물 병원균의 생장을 억제하는 미생물 균주인 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 및 이를 포함하는 미생물 제제에 관한 것이다.
농업에서 비료는 작물의 수량을 결정짓는 중요한 농자재이나 지나치게 많이 사용할 경우, 하천수의 부영양화, 지하수의 수질오염, 토양양분의 불균형, 및 작물의 생육불량 등의 원인으로 작용하여 작물의 수량감소는 물론 작물의 품질하락을 야기할 수 있다. 그러나, 산업의 발달 및 다양화로 인해 농경지 면적이 감소되고 있기 때문에 작물의 생산성을 높이기 위한 비료의 사용은 불가피한 것이며, 이에 따라 기존의 화학비료보다 친환경적인 기능성 농자재의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.
한편, 토양미생물을 이용한 농작물의 재배는 콩과식물에서 광범위하게 이루어지고 있으며, 이 때 주로 사용되는 미생물이 콩과작물과 공생관계를 갖는 라이조비움(Rhizobium; 뿌리혹박테리아)이다. 토양미생물 중에서 기주식물과 완전한 공생관계를 갖지 않으면서 식물의 생장을 촉진시키는 미생물은 1980년 Kloepper 등에 의해서 식물 생장-촉진 리조박테리아[Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR)]로 이름 붙여졌으며, 여기에는 공중질소를 고정하는 아조스퍼릴럼 속균[Azospirrilum (Okon, 1985)], 슈도모나스 속균[Pseudomonas (Kloepper 등, 1980)], 바실러스 속균[Bacillus (Backman 등, 1994)] 등이 대표적인 미생물로 포함된다. 이러한 식물생장촉진미생물은 공중질소의 고정(Boddy와 Dobereiner, 1995), 식물생장촉진 호르몬의 생산, 식물의 양분흡수 촉진(Hallmann 등, 1997) 및 식물의 병발생 억제(Pleban 등, 1995) 등의 여러 가지 기능에 의해서 식물의 생장 을 돕는 것으로 알려져 있다. 식물의 생장을 돕는 다양한 식물생장촉진미생물의 작물접종효과는 벼에서 19∼60%(Baldani, 2000) 증수된 것을 비롯하여, 토마토(Kloepper와 Schroth, 1981), 콩(Polonenko 등, 1987; Dashti 등, 1998), 밀(Freitas와 Germida, 1990), 사탕무우(Suslow와 Schrith, 1982) 등에서도 확인되었으며, 이들 식물생장 촉진 미생물의 실용화 연구는 계속해서 진행되고 있다.
또한, Ward 등(1992)은 토양에 서식하는 미생물 중에서 분류 및 동정된 것은 전체 종의 5%이하라고 하였고, Young(1992)은 공중질소를 고정하는 미생물만도 100종 이상이라 하였으며, Torisvik 등(1990)은 토양에는 인위적으로 배양되지 않는 세균이 매우 많다고 하였다. 따라서, 이미 발견된 유용미생물보다 기능면에서 뛰어난 미생물 균주가 발견될 가능성은 매우 높다.
그러나, 현재까지는 식물생장을 촉진하는 근권미생물로 분류되는 토양미생물 중에서 특정 미생물의 한 종(Species)이 공중질소 고정, 식물 생장-촉진 호르몬 분비 및 식물의 병 발생 억제 등의 기능을 동시에 갖는 균주에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 우리 나라 토양에 서식하는 토양미생물 중에서 벼 뿌리 표면과 내부에 정착하는 특성이 있는 식물근권세균 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049)이 단일 종으로서 공중질소 고정, 식물 생장-촉진 호르몬 분비 및 식물의 병 발생 억제 등의 기능을 동시에 갖는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였 다.
따라서, 본 발명의 목적은 공중질소 고정, 식물 생장-촉진 호르몬 분비 및 식물의 병 발생 억제 등의 기능을 갖는 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주의 2차 대사산물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049) 균주를 유효성분으로 하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하여 공중질소를 고정하고 식물의 생장을 촉진시키며, 식물 병원균의 생장을 억제하는 미생물 균주인 서열번호 1의 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 및 이를 포함하는 미생물 제제에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 의한 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주는 양끝이 둥근 막대기 모양을 하고 있고 크기는 1.5∼2.0×0.8∼1.0㎛이며 편모를 가지고 있다(도 2). 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주를 피디비(PDB)배지에서 24시간 배양하면 폴리-베타-옥시부티레이트(Poly-β-oxybutyrate)가 집적된다. 그람(Gram) 양성세균인 KR076 균주는 생육환경에 따라서는 포자를 형성하고 호흡대사를 하며 카탈라아제(Catalase) 활성을 갖는다. 또한, KR076 균주는 분자질소(N2)를 고정하고, 7% 염화나트륨(NaCl) 용액에서 생장이 불가능하며 리트머스 밀크(Litmus milk) 반응에서는 무색을 나타낸다. KR076 균주는 배지에 첨가된 탄소원이 Glucose, Arabinose, Xylose, Galactose, Fructose, Lactose, Sucrose, Mannitol 등일 때는 생장과정에서 산을 생산하고, 탄소원이 Citrate, Ramnose, Dextrine, Sorbitol, Starch 등일 때는 생장과정에서 알카리를 생성한다. 반면, Dulcitol과 Glycerol 첨가배지에서는 생장하지 못한다. 또한, KR076 균주는 식물뿌리 표면에 서식하면서 뿌리조직 내부에 들어가 정착하는 특성을 갖는다(도 3). 토양미생물 KR076 균주의 생리, 생화학적 특성을 하기 표 1에 표시하였다.
구 분 | 주요 특성 | 구 분 | 주요 특성 | ||
균주 모양 | 막대기(Rod) 모양 | 균주 크기( μm) | 1.5-2.0 X 0.8-1.0 | ||
편모 | 있음 | 폴리-베타-부티레이트 (poly-β-oxybutyrate) 생성 | 피디비(PDB) 배지에서 배양후 생성 | ||
포자 | 있음 | 그람(Gram) 염색 | + | ||
호기적 대사 | + | 혐기적 대사 | - | ||
공중질소 고정 | + | 카탈라제(Catalase) 활성 | + | ||
리트머스 밀크(Litmus milk) 반응 | 무색 반응 | 탈질반응 | + | ||
전분 가수분해력 | - | 카제인 가수분해력 | - | ||
리파아제(Lipase) 활성 | - | 4℃에서의 생장력 | + | ||
7% 염화나트륨(NaCl) 액 생장 | - | ||||
탄소원 이용반응 | 글루코스(Glucose) | 산생성 | 탄소원 이용반응 | 말토스(Maltose) | 산생성 |
아라비노스(Arabinose) | 산생성 | 만니톨(Mannitol) | 산생성 | ||
자일로스(Xylose) | 산생성 | 솔비톨(Sorbitol) | 알카리 생성 | ||
락토오스(Lactose) | 산생성 | 두시톨(Dulcitol) | 생육불가 | ||
갈락토스(Galactose) | 산생성 | 글리세롤(Glycerol) | 생육불가 | ||
프락토스(Fructose) | 산생성 | 덱스트린(Dextrin) | 알카리 생성 | ||
람노스(Ramnose) | 알카리 생성 | 전분(Starch) | 알카리 생성 | ||
수크로스(Sucrose) | 산생성 | 시트레이트(Citrate) | 알카리 생성 |
[참고예 1] KR076 균주의 염기서열 분석
KR076 균주의 염기서열 분석은 16S rDNA sequence 분석법으로 하였는데, 우선 16S rDNA 영역을 핵산증폭법(PCR : Polymerase Chain Reaction)으로 증폭시켜 pGEMT-T 벡터(vector)에 삽입한 후, 자동염기서열분석기 ABI3100 (Applied Biosystem, USA)로 염기서열을 분석하였다. 여기서 사용된 프라이머(primer)는 서 열번호 2의 fD1 (5'-agagtttgatggctcag-3') 및 서열번호 3의 rP2 (5'-acggctaccttgttacgactt-3')이었으며, primer의 양말단부위의 염기서열을 분석하기 위해 pUC/M13의 정방향 프라이머 (forward primer : 5'-gttttccca gtcacgac-3')(서열번호 4) 및 역방향 프라이머(reverse primer :5'-gcggataacaatttcacacagg-3')(서열번호 5)를 이용하였다. 또한, 내부의 염기서열 분석을 위해 4개의 프라이머를 이용하였다. 각각의 염기서열은 Escherichia coli 16S rDNA 염기서열 (GenBank No. J01695)의 순서에 따라 311∼330 부위의 염기서열인 16SP-1(5'-gccacactggaactgagacac-3'), 684∼703 부위의 염기서열인 16SP-2(5'-tgtagcg gtgaaatgcgtg-3'), 944∼963부위의 염기서열인 16SP-3 (5'-ggagcatgtgt tattcg-3) 및 1228∼1247 부위의 염기서열인 16SP-4 (5'-ctacacacgtg ctacaatgg-3')를 이용하였다.
KR076 균주의 16S rDNA 염기서열 분석 결과는 서열번호 1에 기재하였으며, GenBank library의 염기서열과 상동성을 조사한 결과, Bacillus megaterium과 99%이상의 높은 염기서열 상동성을 나타낸 반면, 기타의 종과는 98%이하의 비교적 낮은 염기서열 상동성을 나타내었으므로 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로 분류되었다. 따라서, 본 발명자들은 KR076 균주를 '바실러스 메가테리움 KR076' 균주로 명명하고 2003년 6월 11일 부로 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC91049를 부여 받았다.
본 발명에 의한 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주는 토양에서 직접 분리된 종래의 균주와 달리 식물의 뿌리, 특히 벼 뿌리에서 직접 분리하였기 때 문에 벼 등의 식물뿌리 내부에 정착하는 특성이 잘 재현되므로 작물에 접종되면 뿌리의 표면 또는 내부에서 자체 증식이 가능하며, 작물이 살아 있는 한 빗물 또는 건조로 인한 밀도감소가 적어 접종효과가 오래 지속될 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명에 의한 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주의 식물생장촉진력은 옥수수 뿌리를 균주 배양액의 50배 희석액에 1.5시간 침적하는 방법으로 접종했을 때, 뿌리신장이 21.3% 증가되는 것으로 나타났고, 공중질소 고정력은 72시간 실온배양 조건에서 표준균주 Herbaspirrilum seropedicae BR11175 및 Acetobacter diazotrophicus BR11281 보다 각각 1.02배, 143배 높았으며, 식물병원균인 리이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 등 2종의 사상균과 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 등 2종의 세균에 대하여 강한 생장억제 효과를 나타냈다.
본 발명에 의한 미생물 제제는 통상적인 방법으로 식물 생장 촉진용 또는 병원균 생장 억제용 제제로 제형화할 수 있으며, 그 제형에 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물생장촉진 유기비료로 제형화할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 미생물 제제를 식물생장 촉진용 제제로서 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 경우에는 상기 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049) 균주를 건조분말 g당 또는 액상비료 1㎖당 105 마리 이상으로 함유할 수 있다.
또 본 발명에 의한 미생물 제제를 병원균 생장 억제용 제제로 건조분말 형태 또는 액상형태로 제조할 경우에는, 상기 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주를 건조분말 g당 또는 액상 1㎖당 107 마리 이상 함유할 수 있으며, 상기 식물 생장 촉진용 제제로 제형화할 때 보다도 균주의 함량을 많게 사용하는 것이 특징이다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 반드시 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 토양미생물 KR076의 분리
무균적으로 발아시킨 볍씨 1립을 0.6% 아가로스(Agarose) 배지 위에 옮기고 벼 뿌리로부터 1∼2cm 거리에 균주를 분리할 토양시료 0.5g을 접종하여 28℃에서 48시간 항온처리한 후, 뿌리를 갈아서 현탁액으로 만든 다음 엘시(LC)배지에 도말하여 균주를 분리하였다. 분리된 KR076 균주는 도 1에 나타내었다.
[실험예 1] 토양미생물 KR076의 공중질소고정력 검정
KR076 균주를 진공채혈관 내 5㎖의 반고체 LGI 배지에 접종한 후, 항온 배양하여 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography)로 아세틸렌 환원력(Hardy, 1970)을 측정하여 검정하였다. 결과는 하기 표 2에 표시하였다.
균 주 | 배양시간별 균주활성(umol C2H4/24㎖/0.5hr.) | |||
12hr | 24hr | 48hr | 72hr | |
Herbaspirillum seropedicaeBR11175 | 0.93 | 7.89 | 170.93 | 1025.44 |
Herbaspirillum rubrisublbicanBR11192 | 0.64 | 0.83 | 3.70 | 29.84 |
Acetobacter diazotrophicusBR11281 | 0.45 | 0.81 | 1.29 | 7.33 |
KR076 | 0.52 | 12.21 | 185.01 | 1049.49 |
상기 표 2에 표시된 바와 같이, 본 발명의 KR076 균주는 대조균주인 Herbaspirillum seropedicae BR11175, Herbaspirillum rubrisublbican BR11192 및 Acetobacter diazotrophicus BR11281 보다 우수한 공중질소고정력을 나타냈다.
[실험예 2] 토양미생물 KR076의 식물생장 촉진효과
KR076 균주의 식물생장촉진 효과를 측정하기 위하여, 조류인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)와 옥수수 유묘를 대상으로 실험하였다. 클로렐라 불가리스 접종시험은 하타(Hata) 배지의 온도가 50℃일 때, 액상의 배지 속에 클로렐라 불가리스를 혼합하여 샤레에 부어 배지를 굳힌 후, 반경 4㎜의 홈을 만들어 균주배양액 100㎕를 10반복으로 분주하였다. 처리된 조류는 광 조건하에서 5일간 배양 후, 생장반경을 조사하였다. 옥수수 유묘접종 시험은 옥수수 뿌리 끝 3㎜부위를 시험균주의 배양물 현탁액에 1.5시간 동안 담궈서 접종처리하고, 대조구의 유묘는 멸균한 미생물 배양액에 담근 다음, 옥수수 유묘를 플라스틱 상자 속의 습한 여과지에 치상하고 뿌리의 신장개시점에 있는 뿌리끝을 여지로 덮어 28℃에서 24시간 항 온 처리하여 새로이 신장된 뿌리의 길이를 10회 반복 측정함으로써 균주의 옥수수 생장촉진력을 검정하였다. 결과는 하기 표 3에 표시하였다.
조류(Clorella) 생장 (ㆈ, mm/5 days) | 옥수수 생장(무처리 대비 %) | ||
1:1 | 1:50 | ||
KR076 | 3 | -10 | +21.3 |
대조균주 Chryseobacterium sp. KR044 | 0 | 0 | +8 |
대조균주 Bacillus sp. KR091 | 0 | 0 | 0 |
상기 표 3에 표시된 바와 같이, KR076 균주는 접종 5일째 조류의 생장을 직경 3mm 촉진시키는 효과를 나타내었다. 옥수수 뿌리 생장을 측정한 경우에서는, 배양원액(4.5×109c.f.u/㎖)의 2배 희석 접종에 의해 무처리군에 비하여 10%의 뿌리신장 억제효과를 나타내었으나, 배양원액의 50배 희석접종시는 무처리군에 비하여 21.3%의 신장촉진 효과를 나타내었다.
[실험예 3] 토양미생물 KR076의 식물병원균 억제력
KR076 균주의 식물병원균 억제력은 PDA(Potato Dextrose Agar)에 병원성 곰팡이와 세균을 각각 접종하여 샤레에 옮겨 배지를 굳힌 다음, 반경 4㎜ 크기의 홈(well)을 만들고 여기에 액체의 감자배지에서 28℃ 조건으로 5일간 배양한 KR076 균주를 100㎕씩 접종하여 28℃ 조건에서 5일간 보관 한 다음, 근권세균의 병원균 생장저지범위를 측정하였다. 식물병원균의 접종은 곰팡이의 경우 1×106conidia/㎖ 농도로 5㎖, 세균성 병원균의 경우 1×108cfu/㎖ 농도로 5㎖를 각각 45℃의 PDA 배지 250㎖에 섞어서 잘 흔든 후 샤레 당 25㎖씩 3회 반복 분주하여 접종하였다. 결과는 하기 표 4에 표시하였다.
균 주 | 식물병원성 곰팡이 | 식물병원성 세균 | ||
Rhizoctonia solani | Pythium | Erwinia carotovora3391 | Pseudomonas syringiae2314 | |
KR076 | 27.7±1.3 | 20.0±1.0 | 30.0±1.3 | 38.0±3.5 |
상기 표 4에 표시된 바와 같이, KR076 균주는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피시움(Pythium)과 같은 식물병원성 곰팡이, 및 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 및 슈도모나스 시린기에(Pseudomonas syringiae)와 같은 식물병원성 세균 등에 대해서 강력한 생장억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
[실험예 4] 토양미생물 KR076의 뿌리착생 경합력
시험균주의 식물뿌리 착생 경합력은 대조균주인 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) WCS 365와 시험균주를 벼(금오벼)와 무(Saxa nova) 뿌리에 동시에 접종하였을 때, 뿌리에 착생된 전체 균주 중에서 KR076 균주가 차지하는 비율로서 측정하였다. 결과는 하기 표 5에 표시하였다.
균 주 | 뿌리착생 밀도(105cfu/cm. root) | 뿌리착생 점유율(%) | ||
벼(금오벼) | 무(Saxa nova) | 벼(금오벼) | 무(Saxa nova) | |
KR076 | 4.05(261) | 71.2(167) | 72.3 | 62.5 |
Pseudomonas fluorescensWCS365 | 1.55(100) | 42.7(100) | 27.7 | 37.5 |
상기 표 5에 표시된 바와 같이, 토양미생물 KR076가 대조균주인 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) WCS 365에 비하여 뿌리착생 밀도와 뿌리착생 점유율에서 높은 수치를 나타내었다.
[실험예 5] 토양미생물 KR076의 농작물 접종효과 검정
본 발명의 식물생장촉진 토양미생물 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주의 농작물 접종효과를 알아보기 위하여, 상기 균주를 통상의 방법으로 배양한 배양물을 보리, 밀, 양배추, 수수 등에 접종하고, 각 작물의 수량을 측정하였다. 결과는 하기 표 6에 표시하였다.
작 물 | 수 량(kg/10a) | 증수율(%) | |
무접종 | 접종 | ||
보리(Omskii-90) | 272 | 302 | 11.0 |
밀(Voronezhskaya 8) | 302 | 355 | 17.5 |
양배추(Vyuga) | 380 | 418 | 10.0 |
수수(Zhemchug) | 479 | 896 | 87.1 |
토마토 (선영토마토, 파종 40일째 생체중) | 1.66g | 3.70g | 122.9 |
상기 표 6에 표시된 바와 같이, 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주를 접종함으로써 보리수량은 11%, 밀수량은 17.5%, 양배추 수량은 10%, 수수 수량은 87.1%, 토마토의 유묘생장은 122.9%씩 각각 향상되었으며, 이러한 결과에 따라 KRO76 균주가 실제 농작물의 수확량을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049)은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하여 공중질소를 고정하고 식물의 생장을 촉진시키며, 식물 병원균의 생장을 억제하는 것에 효과가 있음이 확인되었다. 따라서, 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049)을 통상적인 방법에 의하여 미생물 제제로 공급했을 경우, 수질 및 토양환경을 보존할 수 있을 뿐만 아니라 화학비료를 대체하여 작물의 수확량을 늘릴 수 있으며, 병원균으로부터 작물의 안전한 생육을 도울 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (7)
- 서열번호 1의 rDNA 염기서열을 가지는 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049) 균주.
- 제 1항 의한 바실러스 메가테리움 KR076(KACC91049) 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제.
- 제 2항에 있어서, 상기 미생물 제제는 화학비료 대체용 유기비료임을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 제 2항에 있어서, 상기 미생물 제제는 식물생장 촉진용임을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 제 2항에 있어서, 상기 미생물 제제는 병원균 생장 억제용임을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 제 2항에 있어서, 상기 미생물 제제는 바실러스 메가테리움 KR076 (KACC91049)의 2차 대사산물을 유효성분으로 더 함유함을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 제 2 항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 의한 미생물 제제를 토양 또는 식물에 처리하는 토양관리 및 식물의 재배방법.
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