KR102085764B1

KR102085764B1 - 식물 생장 촉진 및 식물병 방제 활성을 갖는 슈도모나스 플레코글로시시다 ang14 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102085764B1
Application number: KR1020190000418A
Authority: KR
Inventors: 장정수; 김지윤; 김희숙; 박혜정; 이송민; 김점두리; 이문현
Original assignee: 이문현; 이광희; 주식회사 엔젤
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2020-03-09

Abstract

본 발명은 식물 생장 촉진 및 식물병 방제 활성을 갖는 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주(KFCC 11808P)는 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성을 가지므로, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 식물 생장 촉진 및 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물 생장 촉진 및 식물병 방제 활성을 갖는 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주 및 이의 용도{Pseudomonas plecoglossicida ANG14 having activities of promoting plant growth and controlling plant disease, and uses thereof}

본 발명은 식물 생장 촉진 및 식물병 방제 활성을 갖는 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물 성장 촉진 근권세균(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)은 식물의 근권에 존재하면서 식물에 성장을 촉진하는 토양 미생물로, 식물의 성장과 발달에 직·간접적으로 도움을 준다(Glick B. R. et al. J. Theor. Biol. 190(1): 63-68, 1998). 인산은 식물의 광합성 작용, 에너지 전달, 신호전달, 고분자물질의 생합성 등 모든 주요 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 필수영양소이며, PGPR 균주는 인산을 가용화하여 식물 성장에 직접적으로 도움을 줄 수 있다. 또한, 대기 중의 질소는 생물체가 이용할 수 없는 형태로 존재하지만 PGPR 균주는 이를 생물체가 이용할 수 있는 질산염 형태로 변화시켜 질소원을 제공함으로써 식물 성장에 도움을 준다.

한편, 사이드로포어(siderophore)는 식물 성장에 필수 원소인 철 이온에 특이적으로 결합하는 물질로 직접적으로 식물 성장에 도움을 주는 물질이면서 식물병원균이 철 이온을 흡수하는 것을 경쟁적으로 저해함으로써 식물병원균의 생육을 억제할 수 있는 물질이다. 따라서, PGPR 균주는 사이드로포어를 생성함으로써 식물 성장에 도움을 줌과 동시에 식물병 방제 효과를 나타낼 수도 있다. 또한, PGPR 균주는 식물성 호르몬의 일종인 IAA(indole-3-acetic acid) 등을 생성하여 직접적으로 식물 성장에 도움을 주며, 간접적으로는 항생물질, 용균효소, 전신유도내성 등을 통해 식물이 성장하는데 도움을 주는 것으로 알려져 있다.

식물성 호르몬인 에틸렌(ethylene)은 농업 품질관리에 중요한 역할을 해 왔으며, 식물이 성장 및 발달을 하는 동안에는 에틸렌의 수준은 0.05 ㎕/L로 낮은 편이지만, 식물이 노화되는 과정 또는 열매가 익어가는 기간에는 100 ㎕/L 이상의 고농도 에틸렌이 합성된다. 적정량의 에틸렌은 식물 성장의 초기 단계에서 발아와 성장에 도움을 주지만, 고농도의 에틸렌은 뿌리 신장의 저해를 일으키는데, 극심한 온도 변화, 수분, 자외선, 질병과 같은 환경 스트레스에 빈번하게 노출되면 에틸렌의 농도가 증가되며, 노화와 세포 손상이 가속화된다. PGPR 균주에 의해 생성되는 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate) 탈아미노효소(deaminase)는 에틸렌의 전구체인 ACC를 암모니아와 알파-케토부티레이트(α-ketobutyrate)로 분해하여 에틸렌의 농도를 낮춤으로써 환경 스트레스를 완화시켜 식물의 성장 촉진에 도움을 준다.

본 발명의 목적은 식물 생장 촉진 및 식물병 방제 활성을 갖는 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생장 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주(KFCC 11808P)는 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성을 가지므로, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 식물 생장 촉진 및 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 ANG4(A), 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14(B), ANG35(C) 및 ANG36(D) 균주의 인산 가용화능을 평가한 사진이다.
도 2는 8종 균주(ANG4, 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 및 ANG36)의 IAA(indole-3-acetic acid) 생성능을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 ANG4(A), 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14(B), ANG16(C), ANG25(D), ANG28(E), ANG34(F), ANG35(G) 및 ANG36(H) 균주의 사이드로포어(siderophore) 생성능을 평가한 사진이다.
도 4는 pH 범위(A) 및 염(NaCl) 농도(B)에 따른 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 생장 정도를 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 계통도이다.
도 6은 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 주사전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM) 사진이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가질 수 있다.

상기 균주는 토양 또는 식물 뿌리로부터 분리된 것일 수 있다.

상기 균주는 식물 생장 촉진 활성을 가질 수 있고, 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.

상기 균주의 식물 생장 촉진 활성은 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성에 의한 것일 수 있다.

상기 균주의 식물병 방제 활성은 사이드로포어 생성능에 의한 것일 수 있다.

상기 균주는 20 내지 50℃에서 생장할 수 있고, pH 5 내지 10에서 생장할 수 있으며, 염(NaCl) 농도가 0 내지 10%인 배지에서 생장할 수 있다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 균주는 토양 또는 식물 뿌리로부터 분리된 것일 수 있다.

또한, 상기 균주는 식물 생장 촉진 활성을 가질 수 있고, 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.

상기 배양물은 상기 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주를 배양한 배양액 또는 이를 물리적 방법으로 여과한 것일 수 있다.

상기 조성물은 상기 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물에 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조될 수 있다.

제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.

계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.

다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필) 및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

상기 식물 생장 촉진용 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물일 수 있다.

상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나, 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 것일 수 있다.

상기 조성물을 식물체에 직접 살포하는 방법으로 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다.

상기 조성물을 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하는 방법으로 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포(액체 처리제의 관개(irrigation), 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다.

상기 식물병 방제용 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 대한민국 각지의 토양 및 식물 뿌리로부터 66종의 균주를 분리하고, 분리한 균주들에 대하여 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성을 평가하여 8종 균주들을 선별하고, 이들의 생장조건을 확인하여 넓은 범위의 온도, pH 및 염 농도 조건에서 생장할 수 있는 ANG14 균주를 최종적으로 선별하였다(표 1 내지 3, 및 도 1 내지 4 참조).

또한, 본 발명자들은 선별된 ANG14 균주를 동정하여 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주로 명명하고 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁하였으며, 상기 균주의 형태학적 및 생리학적 특성을 확인하였다(표 4 내지 6, 및 도 5 및 6 참조).

따라서, 본 발명의 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주(KFCC 11808P)는 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성을 가지므로, 식물 생장 촉진 및 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

토양으로부터 신규 균주들의 분리

근권(rhizosphere) 토양으로부터 신규 균주들을 분리하기 위하여, 신라대학교 인근 야산(부산광역시, 대한민국), 대저 토마토 밭(부산광역시), 기장군 배 밭(부산광역시), 창원시 인근 야산 및 텃밭(대한민국), 제주시 노리매 공원 및 인근 해변(대한민국)의 7 지점으로부터 토양과 식물 뿌리들을 각각 채취하였다. 채집된 토양과 뿌리를 음지에서 2일간 풍건하였으며, 식물 뿌리들을 포함하는 토양 시료 각 1 g을 9 mL의 멸균된 생리식염수에 현탁하였다. 각 현탁액을 연속적으로 희석하여 각 25 개의 농도로 만든 후, 6 가지 평판 배지(BA(bennet agar), GMSA(glucose minimal salts agar), PDA(potato dextrose agar), TSA(tryptic soy agar), ATA(actinomycetes isolation agar), 및 HV(humic-vitamin agar))에 0.1 mL씩 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 채집한 식물 뿌리로부터 내생진균류를 분리하기 위하여, 각 식물 뿌리 시료를 계면활성제(Tween 80)와 표백제(perchloric acid 1.0%)로 살균처리하고 멸균수로 세척한 후 초음파처리(sonication)하였다. 초음파처리된 뿌리 시료를 상기 각 6 가지 평판 배지에 올려서 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 미생물이 자란 배지 상에서 형태나 색깔이 다른 콜로니(colony)를 계대 배양하여 66종의 균주를 분리하였다.

실험예 1. 분리한 균주들의 인산 가용화능 확인

토양 내 인산을 가용화하면 식물 생장을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 실시예 1에서 분리한 균주들의 난용성 인산 가용화능을 측정하였다.

구체적으로, 0.5% 칼슘 포스페이트(calcium phosphate)가 첨가된 고체 PVK(pikopvskaya) 아가(agar) 배지 중앙을 코르크 보러(cork borer)로 잘라낸 뒤, 실시예 1에서 순수 분리된 전배양 균주를 각각 20 ㎕씩 접종하였다. 접종 후 30℃에서 4일간 배양하면서 배지에 클리어 존(clear zone)의 형성 유무를 조사하여 난용성 인산의 가용화능을 판정하였다.

그 결과, 클리어 존의 지름이 0.5 cm 이상 나타난 균주는 ANG4, ANG14, ANG35 및 ANG36의 4종 균주로 확인되었다(도 1).

실험예 2. 분리한 균주들의 질소 고정화능 확인

대기 중의 질소를 고정하여 생물체가 이용할 수 있는 질산염 형태로 질소원을 제공하면 식물 생장에 도움을 줄 수 있으므로, 상기 실시예 1에서 분리한 균주들의 질소 고정화능을 측정하였다.

구체적으로, 질소 고정세균 분리용 NFB(Nitrogen Free Bromothymol blue) [(HO₂CCH₂CH(OH)CO₂H 5.0 g, K₂HPO₄0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.01 g, NaCl 0.02 g, FeSO₄·7H₂O 0.05 g, Na₂MoO₄0.002 g, MnSO₄·7H₂O 0.01 g, CaCl₂0.01 g, KOH 4.0 g, 2.0 mL Bromothymol Blue/1L 0.5% alcohol, agar 1.75 g, pH 6.8] 배지를 이용하였다. 상기 배지는 무기염 및 탄소원만 함유하고 질소원은 결핍되어 있어 대기 중의 질소를 고정할 능력이 있는 균주만이 생장할 수 있는 선택배지이다. 시험관에 NFB 배지 5 mL를 넣고 실시예 1에서 분리된 전배양 균주를 루프(loop)로 접종하여 30℃에서 2일간 배양하면서 배지 색이 파란색으로 변할 경우 해당 균주가 대기 중의 질소를 고정하여 생장할 수 있는 균주인 것으로 판단하였다.

균주명	질소 고정화능
ANG4	++
ANG14	++
ANG16	++
ANG25	+
ANG28	+
ANG34	+
ANG35	+
ANG36	+

+: 중간 정도의 질소 고정화능; 및

++: 강한 질소 고정화능

그 결과, ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 및 ANG36의 8종 균주가 질소 고정화능이 있음을 확인하였다(표 1).

실험예 3. 분리한 균주들의 IAA(indole-3-acetic acid) 생성능 확인

IAA는 식물생장 호르몬으로 식물의 신장을 촉진시키고 뿌리 신장 및 과실 형성 등을 촉진하므로, 상기 실시예 1에서 분리한 균주들의 IAA 생성능을 측정하였다.

구체적으로, 0.1%의 트립토판(tryptophan)을 첨가한 KB(King's B) 배지에 실시예 1에서 분리된 전배양 균주를 접종하여 30℃에서 130 rpm으로 2일간 배양하였다. 배양된 배양액을 원심분리(10,000 rpm, 15분)하여 상층액을 분리한 후, 살코프스키 시약(Salkowski's reagent; 35% HClO₄ 50 mL, 0.5 M FeCl₃ 1 mL)을 1:2 (v/v)의 비율로 첨가하고, 분홍색이 발색되는 동안 상온에서 30분간 정치하였다. 이후 흡광 광도계를 이용하여 530 nm에서 각 혼합액의 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 IAA를 이용하여 상기와 같은 방법으로 실험한 후 검량선을 작성하여 상기 각 반응액 내의 IAA의 농도를 환산하였다.

그 결과, ANG14 균주가 96.76 ㎍/mL의 IAA를 생성하였고, ANG16 및 ANG28 균주도 각각 40.84 ㎍/mL 및 46.99 ㎍/mL의 IAA를 생성하였으며, ANG4 및 ANG25 균주가 각각 20.02 ㎍/mL의 IAA를 생성하여 우수한 IAA 생성능을 나타내었다(도 2).

실험예 4. 분리한 균주들의 사이드로포어(siderophore) 생성능 확인

사이드로포어는 철 이온에 특이적으로 결합하여 식물 생장에 직접적으로 도움을 주며, 식물병원균의 철 이온 흡수를 방해하여 생육을 억제하므로, CAS 블루 아가 방법(chrome azurol S blue agar plate assay)을 이용하여 상기 실시예 1에서 분리한 균주들의 사이드로포어 생성능을 측정하였다.

구체적으로, 60.5 mg의 CAS를 50 mL의 증류수에 녹이고, 10 mL의 Fe(Ⅲ) 용액(FeCl₃.6H₂O 27 mg, HCl 83.3 ㎕/100 mL 증류수)을 첨가하고, 72.9 mg의 HDTMA(hexa decyltrimethyl ammonium bromide)를 40 mL의 증류수에 녹인 후 첨가하여 CAS 지시용액을 준비하였다. 증류수 900 mL에 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 20.0 g, K₂HPO₄ 1.5 g, MgSO₄·7H₂O 1.5 g, 글리세롤(glycerol) 10.0 mL 및 1.5% 아가를 넣고 상기 CAS 지시용액을 섞어서 pH를 6.8로 맞춘 후 멸균하였다. 멸균된 CAS 블루 아가 플레이트 중앙을 코르크 보러를 이용하여 잘라낸 뒤, 실시예 1에서 분리된 전배양 균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양시키면서 푸른색 배지에서 주황색 원(orange halo)의 생성 유무를 관찰하여 사이드로포어 생성능을 측정하였다.

그 결과, ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 및 ANG36의 8종 균주를 접종한 각 배지에서 지름 1 cm 이상의 주황색 원이 나타나 사이드로포어 생성능이 있음을 확인하였다(도 3).

실험예 5. 분리한 균주들의 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate) 탈아미노효소(deaminase) 활성 확인

ACC 탈아미노효소는 식물 생장을 억제하는 에틸렌(ethylene)의 전구체인 ACC를 암모니아와 알파-케토부티레이트(α-ketobutyrate)로 분해함으로써 식물 생장에 도움을 줄 수 있으므로, 상기 실시예 1에서 분리한 균주들의 ACC 탈아미노효소 활성을 측정하였다.

구체적으로, 시험관에 5 mL의 TSB(tryptic soy broth) 배지를 넣고 실시예 1에서 분리한 전배양 균주를 각각 접종하여 30℃에서 130 rpm으로 48시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 DF(Dworkin-Foster) 염(salt) 배지(KH₂PO₄ 4 g/L, Na₂HPO₄ 6 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L, FeSO₄ 0.001 g/L, H₃BO₃ 0.00001 g/L, MnSO₄·H₂O 0.0001 g/L, ZnSO₄ 0.00007 g/L, CuSO₄ 0.00005 g/L, MoO₃ 0.00001 g/L, 글루코스(glucose) 2.0 g/L, C₆H₁₂O₇ 2.0 g/L, C₆H₈O₇2.0 g/L, pH 7.3)로 두 차례 세척하고 질소원으로 3 mM ACC가 첨가된 DF 염 배지에 접종하여 30℃에서 130 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 대조구로는 질소원으로 아무것도 첨가하지 않은 DF 염 배지를 사용하였고, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 ACC를 첨가한 배지에서 생장한 균체의 증가 정도를 확인하여 ACC 탈아미노효소 활성을 측정하였다.

균주명	ACC 탈아미노효소 활성
ANG4	+
ANG14	+
ANG16	+
ANG25	+
ANG28	+
ANG34	+
ANG35	+
ANG36	+

+: 중간 정도의 ACC 탈아미노효소 활성

그 결과, ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 및 ANG36의 8종 균주는 ACC만을 질소원으로 첨가한 DF 염 배지에서 생장할 수 있음을 확인하여, ACC 탈아미노효소 활성이 있음을 알 수 있었다(표 2).

실험예 6. 선별된 8종 균주들의 생장조건 확인

상기 실험예 1 내지 5를 통하여 인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC 탈아미노효소 활성을 갖는 8종 균주(ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 및 ANG36)를 선별하여 다양한 온도, pH 및 염 농도에서의 생육능을 확인하였다.

구체적으로, 시험관에 전배양 배지로 5 mL TSB 배지를 넣고 선별된 8종 균주의 전배양액을 각각 20 ㎕씩 접종하여 배양한 후 본 배양의 접종균으로 이용하였다. 10 내지 50℃의 온도, 4 내지 12의 pH, 0 내지 10%의 염(NaCl) 농도 조건에서 2일간 본 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 균주를 접종하지 않은 TSB 배지의 흡광도를 대조구로 사용하였고, 모든 실험 조건에서 균주의 접종량은 동일하게 하였다.

균주명	온도 범위(℃)	pH 범위	염 농도 범위(%)
ANG4	20 ~ 40	4 ~ 10	0 ~ 10
ANG14	20 ~ 50	5 ~ 10	0 ~ 10
ANG16	20 ~ 35	5 ~ 10	0 ~ 6
ANG25	20 ~ 35	5 ~ 9	0 ~ 3
ANG28	20 ~ 40	5 ~ 9	0 ~ 6
ANG34	20 ~ 40	5 ~ 9	0 ~ 4
ANG35	20 ~ 40	5 ~ 9	0 ~ 4
ANG36	20 ~ 40	5 ~ 9	0 ~ 4

그 결과, 온도 및 염 농도 조건에 있어서는 ANG14 균주가, pH 및 염 농도 조건에 있어서는 ANG4 균주가 가장 넓은 범위의 조건에서 생육할 수 있음을 확인하였다(표 3 및 도 4). 다양한 환경 스트레스 요인에 따른 활용성을 고려하여 넓은 범위의 온도, pH 및 염 농도 조건에서 생육이 가능한 ANG14 균주를 최종적으로 선별하였다.

실험예 7. ANG14 균주의 동정

상기 실험예 6에서 선별한 ANG14 균주의 분류학적 동정을 위하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.

7-1. ANG14 균주의 16S rRNA 유전자 구간의 분리 및 정제

분리된 ANG14 균주의 균체를 TSB 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. DNA 추출 키트를 이용하여 회수한 균체로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 2.5 유닛(unit)의 DNA 중합효소(i-StarTaq^TM DNA polymerase, iNtRON Biotechnology, 대한민국), DNA 시료 5 ㎕, 2.5 mM의 dNTPs 각 4.0 ㎕, 10 pmol의 프라이머(primer), 버퍼(pyrobest buffer) 5.0 ㎕, 및 멸균 증류수를 혼합하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 프라이머는 하기 표 4의 범용 프라이머(universal primer)를 사용하였고 표 5의 반응 조건으로 PCR을 수행하였다.

프라이머명	서열(5'→3')	서열번호
27F	AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG	2
1492R	GGT ATC CTT GTT ACG ACT T	3

구분	온도(℃)	시간	사이클 수
사전 변성	94	5분	1
변성(denaturation)	94	1분	30
어닐링(annealing)	55	1분
신장(extension)	72	1분
최종 신장	72	10분	1

증폭된 PCR 산물을 EtBr(ethidium bromide)로 15분 동안 염색한 후, 1.0% 아가로스 젤(agarose gel)에서 확인하였으며, PCR 정제 키트(Millipore PCR cleanup kit, Millipore, 미국)를 이용하여 정제하였다.

7-2. 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 ANG14 균주의 동정

정제된 유전자의 염기서열과 기존의 세균과의 유사성을 NCBI의 BLAST를 이용하여 분석하였고, MEGA 7.0 프로그램의 NJ(Neighbor-joining) 알고리즘을 이용하여 계통분석을 수행한 후 계통도를 작성하였으며, 이 때 부트스트랩핑(bootstrapping)은 2,000 회 반복하였다.

그 결과, ANG14 균주는 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) 균주와 99%의 상동성을 가지는 것으로 나타났고, 이의 분류학적 위치를 도 5에 계통도로 나타내었다. 상기 ANG14 균주를 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주로 명명하고 2018년 11월 28일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁하였다.

실험예 8. 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 형태학적 특성 확인

슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주를 주사전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM)으로 촬영하여 형태학적 특성을 확인하였다.

그 결과, 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주는 간균(bacillus)의 형태를 가짐을 확인하였다(도 6).

실험예 9. 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 생리학적 특성 확인

슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주의 생리학적 특성을 확인하기 위하여, 상기 균주의 19종 효소 활성을 키트(API ZYM kit, Biomerieux, 프랑스)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.

번호	효소명	활성
1	Alkaline phosphatase	w
2	Esterase(C4)	+
3	Esterase lipase (C8)	+
4	Lipase(C14)	-
5	Leucine arylamidase	++
6	Valine arylamidase	+
7	Cysteine arylamidase	-
8	Trypsin	-
9	α-chymotrypsin	-
10	Acid phosphatase	++
11	Naphtol-AS-BI-Phosphohydrolase	+
12	α-galactosidase	-
13	β-galactosidase	-
14	β-glucuronidase	-
15	α-glucosidase	-
16	β-glucosidase	-
17	N-acetyl-β-glucosaminidase	-
18	α-mannosidase	-
19	α-fucosidase	-

++: 강한 효소 활성;

+: 중간 정도의 효소 활성;

w: 약한 효소 활성; 및

-: 효소 활성 없음

그 결과, 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주는 2종 효소(Leucine arylamidase 및 Acid phosphatase) 활성이 강하게 나타났고, 4종 효소(esterase, esterase lipase, valine arylamidase 및 naphtol-AS-BI-phosphohydrolase) 활성이 중간 정도로 나타났으며, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소 활성이 약하게 나타났다(표 6).

한국미생물보존센터

KFCC11808P

20181128

<110> LEE, MUN HYUN LEE, Kwang Hui ANGEL CO., LTD. <120> Pseudomonas plecoglossicida ANG14 having activities of promoting plant growth and controlling plant disease, and uses thereof <130> 2018P-12-009 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1403 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of Pseudomonas plecoglossicida ANG14 <400> 1 gcaagtcgag cggatgacgg gagcttgctc cttgattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60 cctaggaatc tgcctggtag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120 gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg 180 attagctagt tggtggggta atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg 240 atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300 aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc 360 ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcagtaag ctaatacctt gctgttttga 420 cgttaccgac agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg 480 tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggtttg ttaagttgga 540 tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctggcaagct agagtacggt 600 agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag 660 tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt caactagccg ttggaatcct 780 tgagatttta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840 gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900 gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatgcaga gaactttcca gagatggatt 960 ggtgccttcg ggaactctga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020 tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt 1080 gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140 tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca 1200 agccgcgagg tggagctaat ctcacaaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260 cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt 1320 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgcacca gaagtagcta 1380 gtctaacctt cgggaggacg gta 1403 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R <400> 3 ggtatccttg ttacgactt 19

Claims

인산 가용화능, 질소 고정화능, IAA((indole-3-acetic acid) 생성능, 사이드로포어 생성능 및 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate) 탈아미노효소(deaminase) 활성을 가지고,
20 내지 50℃, pH 5 내지 10 및 0 내지 10%의 염 농도에서 생장 가능하며,
서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는, 수탁번호 KFCC 11808P로 기탁된 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) ANG14 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 식물 생장 촉진 활성을 갖는, 슈도모나스 플레코글로시시다 ANG14 균주.
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제1항의 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물.
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제5항의 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생장 촉진 방법.
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