KR20160119624A - 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거 f22 균주 및 이의 용도 - Google Patents

식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거 f22 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주, 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물기생선충을 방제하는 방법 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 및 이의 용도{Aspergillus niger F22 strain having nematocidal activity against plant parasitic nematode and uses thereof}
본 발명은 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주, 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물기생선충을 방제하는 방법 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다
국내 주요 원예작물 및 과채류 시설재배지에서 피해를 입히는 대표적인 선충으로는 뿌리혹선충(root-knot nematode)을 포함하는 식물기생성선충(plant-parasitic nematode)이 알려져 있으며 특히, 시설하우스 토양 내 뿌리혹선충에 의한 농작물 피해가 심각하다. 식물기생선충은 가해 양상 및 기주에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.) 아엽선충(Aphalenchoides spp.) 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 왜화선충(Tylenchorhychus spp.), 감귤선충(Rotylenchulus spp.) 등이 있다. 농업에서 중요한 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica) 및 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 등이 있다.
현재 식물기생선충에 대한 방제법으로는 재배법 방제, 물리적 방제 그리고 화학적 방제가 있다. 재배적 방제에는 담수, 휴경, 건토, 깊이갈이, 객토, 벼 윤작 재배, 저항성 품종 등이 있으며, 물리적 방제에는 열처리(스팀, 건열, 온탕침법), 태양열 소독 등이 사용되며 화학적 방제에는 카보입제, 포스치아제이트(선충탄) 등의 화학 약제를 살포하여 선충을 방제하고 있다. 재배적 방제의 경우 지역 조건 및 재배 작물에 따라 적용이 어렵거나 고비용이 소요되는 단점이 있으며, 저항성 품종은 특이 작물에 제한되어 실용성이 낮다. 화학약제의 경우 방제효과가 높으나 대부분 유기인제 및 카바메이트계로 토양 잔류시 독성이 높고 환경오염 뿐만 아니라 작물의 성장에 유익한 토양 내 유용미생물의 무분별한 살균작용에 의해 피해가 가중되고 토양을 점차 척박하게 하는 원인이 된다. 따라서, 농약의 사용으로 인한 환경오염 문제, 생태계 파괴, 인축에 대한 위험성 등과 같은 문제점과 친환경적 농산물에 대한 수요의 증가로 인해 농약의 사용을 지양하고 있다. 또한, 토양 훈증제로 선충 방제에 주로 사용되던 메틸브로마이드(methyl bromide)의 오존층 파괴 문제로 인한 농약의 사용이 금지될 예정이다(Caboni et al. (2013) J. Agric. Food Chem. 61, 1794-1803). 따라서 이를 대체할 수 있는 환경에 보다 안전한 살선충제의 개발이 요구되고 있다.
근래에 환경 친화적으로 식물기생선충을 방제하는 방법 중 미생물을 이용하는 방법이 있다. 미생물은 생장하면서 다양한 2차 대사산물을 생산하거나 식물병원균에 직접 작용하여 다양한 항균 및 살충 활성을 갖는다는 연구가 수행되었다(Zhao et al. (2014) Antagonistic action of Bacillus subtillis strain SG6 on Fusarium graminearum. PLoS one. 9(3), e92486). 따라서 다양한 미생물 배양액에 대해 살선충 활성 스크리닝을 통해 활성을 갖는 균주를 선발하고 이를 이용하여 식물기생선충병을 방제하는 균주를 개발하는 연구가 계속 진행 중이다.
한편, 한국공개특허 제2006-0002789호에서는 '살선충제'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0116562호에서는 '바실러스 벨레젠시스 G341 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 61개의 곰팡이 중에서 실험실 조건 내에서 식물기생선충 유충에 대한 치사활성을 보이며, 토마토 작물을 이용한 온실조건에서도 뿌리혹선충병 발생을 현저히 억제하는 균주가 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주(KCTC 12771BP)임을 확인하였다. 또한 액상수화제(SC), 액상현탁제(SM), 흡착식입제(흡착식 GR), 조립식입제(조립식 GR) 및 분말수화제(WP)의 5가지 기초 제형으로 조제하여 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제활성을 조사하였을 때 분말수화제에서 가장 우수한 방제가를 보이는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 균주는 식물기생선충 방제에 대한 생물농약으로 화학농약을 대신할 수 있고, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물기생선충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
여 발명의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주는 시험관 내(in vitro)에서 뿐만 아니라 토마토 뿌리혹선충병에 대한 온실내 실험에서도 농도 의존적으로 살선충 활성을 나타냄으로서 식물기생선충 방제제로의 개발 가능성이 매우 높다고 판단된다. 본 균주의 경우 분말수화제 제형을 하여 처리하였을 때에도 우수한 방제 효과를 나타냄으로서 이후 최적 발효공정 및 제제 최적화를 진행할 경우 신규한 미생물 살선충제인 생물농약으로 화학농약을 대신할 수 있다. 따라서 본 발명의 균주는 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 선발균주의 배양여액을 농도별로 처리하여 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)에 대한 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 선발균주의 배양여액 10% 처리시 치사한 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)의 모습을 무처리구와 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 선발균주의 ITS 영역(A) 및 26S RNA(B) 서열을 이용한 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주의 배양배지별 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거 F22 균주의 배양여액 처리시 토마토 뿌리혹선충병의 방제활성을 포트 실험 후 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거 F22 균주의 배양여액 10배 희석액 처리시 토마토 식물 뿌리의 모습을 무처리구와 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 배양액을 이용한 기초 제형의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제가를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 분말수화제 100배와 50배 희석액 처리구의 토마토 식물 뿌리의 모습을 무처리구와 아바멕틴(Abamectin, 올스타) 3,000배 처리구와 함께 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 당근뿌리혹선충과 소나무재선충에 대한 아스퍼질러스 나이거 F22 균주 배양여액의 농도에 따른 살선충 활성을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주를 제공한다.
본 발명에서는 61개의 곰팡이 중에서 특정 균주 배양여액이 실험실 조건내에서 식물기생선충 유충에 대한 치사활성을 보였으며 토마토 작물을 이용한 온실조건에서도 뿌리혹선충병 발생을 현저히 억제하는 것을 확인하였는데, 상기 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주로 동정되었다. 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주는 한국생명공학연구원에 2015년 3월 18일자로 기탁하였다.(기탁번호: KCTC 12771BP)
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 또는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)일 수 있으며, 바람직한 상기 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 가장 바람직한 식물기생선충은 토마토뿌리혹선충과(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 또는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 미생물제제는 액상수화제(SC), 액상현탁제(SM), 흡착식입제(흡착식 GR), 조립식입제(조립식 GR) 또는 분말수화제(WP)일 수 있고, 가장 바람직하게는 분말수화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물제제는 상기와 같은 균주들을 상기와 같은 배양조건에서 배양하여 제조된 배양액을 포함하는 것으로서 항균 미생물농약, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제에서, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주 또는 이의 배양액을 액상 및 분말화의 형태로서 당 업계에서 사용되는 공지의 방법에 의해 다양하게 변형하여 사용이 가능하나, 바람직하게 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주의 배양액 또는 농축액을 전분, 조단백질 또는 암석분과 같은 담체에 흡착 건조시키는 것이 좋다. 본 발명의 균주의 배양액 또는 농축액과 혼합하여 사용될 수 있는 담체는 당 업계에서 사용되는 어떠한 담체도 될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 담체로서 사용될 수 있는 것들에는 쌀, 밀, 옥수수, 보리, 콩, 조, 수수, 기장, 메밀 등 곡류, 감자 등의 괴경류, 고구마, 카사바 등의 괴근류, 또는 이들의 가공물(예컨대, 분말), 이들로부터 유래된 전분과 그 유도체 등이 포함된다. 그밖에 한천, 젤라틴, 팩테이트(폴리갈락투로닌산염), 키토산, 카복시메틸 셀룰로즈 및 그의 유도체, 겔라이트, 천연왁스, 천연 검, 카올린, 벤토나이트 등의 점토 광물, 또는 지오라이트 등과 같은 규조토 물질이 사용될 수 있다. 이러한 각종 담체들은 개별적으로 사용될 수 있으며, 혹은 2 이상의 담체들을 적당비율로 혼합하여 개선된 물성의 담체를 얻을 수도 있다. 상기와 같은 담체들을 사용할 경우 미생물에 의하여 대사되어 영양원이 될 수 있고, 이들 담체들은 점성이 매우 높아 식물의 표면에 대한 점착성이 증가되어 좋다.
본 발명은 균주 또는 균주 배양액을 건조법으로 얻어진 건조 산물 및 이를 포함하는 생물농약도 포함할 수 있다. 상기 건조 산물은 수화제(WP), 고상제(GM), 입상수화제(WG), 입제(GR), 분제(DP) 및 종자처리수화제(WS)로 이루어진 군에서 선택된 제형으로 생물 농약을 제조할 수 있다. 이러한 생물농약 제제는 기존 액상 제형에 비해 안정성 및 이화학성이 우수하며, 식물병 방제 처리로 사용할 수 있다.
생물 농약에서 수화제는 분상으로서 물에 희석하였을 때 수화되는 농약의 제형을, 고상제는 미생물 배양액을 고상의 물질에 혼합하거나 흡착시킨 제제로 분제, 입제 및 수화제에 해당되지 않는 제형을 의미한다. 또한, 입상 수화제는 과립상으로서 물에 희석하여 사용되는 농약의 제형을, 상기 입제는 입상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 상기 분제는 분상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 종자처리수화제는 분상으로서 종자에 처리하기 전에 수화시켜 현탁액으로 사용되는 농약의 제형을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주, 흡습제로서 화이트카본(white carbon), 습윤제로서 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 분산제로서 소듐 리그노설포네이트 및 증량제로서 카올린으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 중량% 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주, 1 중량% 화이트카본(white carbon), 1 중량% 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 1 중량% 소듐 리그노설포네이트 및 87 중량% 카올린으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 액상수화제는 식물기생선충을 방제하기 위해 사용된다. 본 발명의 미생물제제를 이용하여 식물기생선충을 방제하기 위해서는 미생물제제를 물을 이용하여 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 살포할 수 있다. 본 발명의 액상수화제를 물에 희석하는 경우 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 103 내지 105 cfu/ml, 바람직하게는 104 cfu/ml 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물기생선충을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 식물기생선충을 방제하는 방법으로는 본 발명의 균주를 배양한 배양액 또는 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주의 배양 방법 및 미생물 제제의 제조 방법은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 균주의 배양은 MEB(Malt extract broth) 배지, PDB(Potato dextrose broth) 배지, CDB(Czapek Dox broth) 배지 또는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 상기 균주를 배양한 후 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법을 이용하여 토마토뿌리혹선충 유충 현탁액에 10% 농도로 배양액을 처리하여 3일 후 살선충 활성을 조사한 결과, PDB 배지에서 94%의 방제활성을 보여 가장 높은 살선충 활성을 보였으며, 따라서 PDB를 최적 배지로 선정하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 살선충 활성을 갖는 균주의 선발 및 살선충 활성 분석
우수한 살선충 활성을 갖는 사상균의 선발을 위해 본 발명자는 61개의 사상 미생물 배양여액을 분양받아 살선충 활성 스크리닝을 수행하였다. 구체적으로, 뿌리혹선충에 감염된 토마토 식물의 뿌리를 수돗물로 씻어내 이물질을 제거하였다. 그런 다음 잘씻은 뿌리를 1cm 이하 간격으로 자른 후 믹서기에 넣고 뿌리가 잠길 정도로 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hyphochlorite) 용액을 넣은 후 1분 동안 마쇄하였다. 그리고 이를 65㎛ 체에 걸러 뿌리 찌꺼기를 걸러내고 그것을 통과한 알들을 25㎛ 체에 수집한 후 멸균수로 여러번 씻어 주었다. 수확한 뿌리혹선충 알의 농도는 실체현미경을 통해 측정하였다.
61개의 곰팡이 배양여액의 살선충 활성 스크리닝은 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법으로 조사하였다. 각 홀에 50마리의 뿌리혹선충 유충 현탁액을 45㎕ 넣은 다음 배양여액 10%를 처리하였으며, 시료 처리 3일 후 아래와 같은 식을 이용하여 살선충 활성을 조사하였다. 실험은 3반복을 수행하였으며 무처리 대조구로 멸균수 10%를 사용하였고, 대조약제로 아바멕틴(Abamectin)을 치사 농도인 1㎍/㎖로 사용하였다.
살선충 활성(%)= [죽어있는 선충의 수/(살아있는 선충의 수 + 죽어있는 선충의 수)] ×100
그 결과, 도 1에서와 같이 F22 균주는 배양여액 10% 처리시 100%의 완벽한 살선충 활성을 보였으며, 5% 처리시에도 96%로 강력한 살선충 활성을 보였다. 시료 처리시 선충 유충은 일자로 뻗은 상태로 움직임이 없었으며, 반면에 무처리구에서는 유충이 유연한 곡선 형태로 움직임이 있어 살아있음을 알 수 있었다(도 2). 한편, 대조약제로 사용된 아바멕틴(abamectin) 처리구는 1㎍/㎖ 수준에서 95%의 살선충 활성을 보였다.
실시예 2. 균주의 동정
우수한 살선충 활성을 갖는 F22 균주는 PDB 배지에서 25℃, 150 rpm 조건으로 7일 동안 배양하였다. F22 균주를 동정하기 위하여 ITS(internal transcribed spacer) 영역의 염기서열과 26S rRNA 영역의 염기서열 결정 및 분석을 수행하였다. 구체적으로, DNeasy Plant mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였으며, 이를 PCR 주형으로 사용하였다. F22 균주의 ITS 영역 염기서열 분석에는 ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3' : 서열번호 1)과 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' : 서열번호 2) 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 26S rRNA 영역 부분 염기서열 분석에는 NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3' : 서열번호 3)과 NL4(5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3' : 서열번호 4) 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.
F22 균주의 ITS 영역과 26S rRNA 영역을 PCR로 증폭한 후, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 분석된 곰팡이 균주의 염기서열은 미국 브로드연구소의 데이터베이스 검색을 통해 등록된 균주와의 서열과 비교하였으며, 염기서열 비교 결과 가장 높은 유사도를 나타내는 균주를 기준으로 균주를 동정하였다. 그 결과, 도 3과 같이 두 영역 모두 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)와 그룹지어졌으며 ITS 영역은 99.8%, 26S rRNA 영역은 98%의 유사도를 보여 F22 균주를 아스퍼질러스 나이거로 동정하였다.
실시예 3. 최적의 배지 선발
F22 균주의 살선충 활성 물질 생산을 위한 최적 배지를 선정하기 위해 일반적으로 곰팡이 배양에 사용되는 6가지 배지를 이용하여 배양배지별 살선충 활성을 조사하였다. F22 균주의 6가지 배양배지에 균사조각(직경, 6 mm) 5개를 접종하여 25℃, 150rpm 조건에서 7일 동안 진탕 배양하였으며 실험에 사용한 6가지 배지는 다음과 같다. MEB(Malt extract broth) 배지, PDB(Potato dextrose broth) 배지, CDB(Czapek Dox broth) 배지, SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지, V8 쥬스 배지, CV8 쥬스 배지(Clarified V8 쥬스 배지, 캠벨수프컴퍼니). 상기와 같은 6가지 배지를 이용한 F22 균주 배양액은 멸균한 가아제로 여과하여 배양여액을 얻었으며,이를 앞서 설명한 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법을 이용하여 뿌리혹선충 유충 현탁액에 10% 농도로 처리하여 3일 후 살선충 활성을 조사하였다. 그 결과 도 4에서와 같이 PDB 배지에서 94%의 방제활성을 보여 가장 높은 살선충 활성을 보였으며, 따라서 PDB를 최적 배지로 선정하였다.
실시예 4. 균주 배양여액의 토마토 뿌리혹선충병 방제활성
아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 균주 배양여액을 이용하여 토마토 뿌리혹선충병에 대한 포트실험을 수행하였다. 직경 9.5cm 크기의 플라스틱 포트에 멸균한 모래 400 g을 담은 후, 상토에 파종하여 온실에서 3주 동안 생육한 '서광'(몬산토코리아) 품종의 토마토를 이식하였다. 앞서 설명했던 방법으로 뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리로부터 알을 수거하여 각 포트당 10,000 마리의 알을 접종하였다. 그런 다음 PDB 배지에서 25℃, 150 rpm 조건으로 7일 동안 진탕 배양한 F22 균주 배양액을 멸균된 가아제로 여과하여 배양여액을 얻었으며 이를 멸균수를 이용하여 10배와 100배 희석하여 토마토 뿌리 주변에 일주일 간격으로 2회 토양관주 처리하였다. 대조구로 올스타(a.i. Abamectin 1.8%) 3,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로 멸균수를 처리하였다. 실험은 5반복을 수행하였으며, 선충 알 접종 6주 후 식물체의 뿌리를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 Taylor and Sasser (1978, Identification and Control of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, North Carolina State University: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, p 111) 방법에 따라 뿌리혹 지수를 조사하였다. 뿌리혹 지수는 0-5단계 (0은 0%, 1은 1-20%, 2는 21-40%, 3은 41-60%, 4는 61-80%, 5는 81-100%)를 적용하여 조사하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 F22 균주 배양여액의 10배 희석액에서 71%의 방제활성을 보였으며, 식물의 왕성한 생장이 관찰되었다. 이와 같이 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 균주는 토마토 뿌리혹선충병 방제에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 판단되었다.
실시예 5. 아스퍼질러스 나이거( A. niger ) F22 균주를 이용한 기초 제제의 뿌리혹선충병 방제활성 조사
1. 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 균주의 기초 제형 제조
F22 균주의 배양액을 이용하여 기초 제형을 개발하기 위해 액상제(Suspecsion Concentrate; SC, Suspension Microbial; SM) 2종, 입상제(흡착식 Granule; GR, 조립식 Granule; GR) 2종, 분말수화제(Wettable Powder; WP) 1종의 제형을 조제하였다.
① 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 액상수화제(Suspecsion Concentrate, SC) 제형 제조
가) 제조 처방전: 아래 표 1과 같이 최종 처방하여 제조하였다.
아스퍼질러스 나이거 F22 액상수화제(SC) 제형 제조 처방전
Role Composition Input(%) Form
원제 아스퍼질러스 나이거 F22 SD 파우더 10.0 갈색 액상
계면활성제 습윤/분산제 3.0 무색 액상
보조제 보존제 1.5 연황색 분상
부동제 5.0 무색 액상
증점제 0.2 황색 분상
증량제 증량제 rest 무색 분상
Total 100.0 -
나) 제조 공정도
1) 습식분쇄부(50%)
계면활성제를 물에 충분히 분산 후, 아스퍼질러스 나이거 배양액을 분쇄 후 이를 혼합하였다. 거품 발생시 소포제를 소량씩 나누어 삽입하였다.
2) 증점부(50%)
부동제에 증점제를 균일하게 분산시킨 다음, 방부제 및 물 첨가 후 고르게 교반하였다.
3) 제품부 혼합공정
습식분쇄부와 증점부를 적정비율(추천 50:50)로 혼합하여 조제하였다.
② 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 액상현탁제(Suspension Microbial, SM) 제형 제조
가) 제조 처방전: 아래 표 2와 같이 최종 처방하여 제조하였다.
아스퍼질러스 나이거 F22 액상현탁제(SM) 제형 제조 처방전
Role Composition Input(%) Form
원제 아스퍼질러스 나이거 F22 배양액 10.0 갈색 액상
계면활성제 습윤/분산제 3.0 무색 액상
보조제 보존제 1.5 연황색 분상
부동제 5.0 무색 액상
증점제 0.2 황색 분상
증량제 증량제 rest 무색 분상
Total 100.0 -
나) 제조 공정도
1) 원제 혼합부(50%)
계면활성제를 물에 충분히 분산 후, 아스퍼질러스 나이거 F22 배양액을 분무건조하여 얻어진 분말과 혼합하였다. 거품 발생시 소포제를 소량씩 나누어 첨가하였다.
2) 증점부(50%)
부동제에 증점제를 균일하게 분산시킨 다음, 방부제 및 물 첨가 후 고르게 교반하였다.
3) 제품부 혼합공정
원제 혼합부와 증점부를 적정비율(추천 50:50)로 혼합하여 조제하였다.
③ 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 흡착식 입제(GR) 제형 제조
가) 제조 처방전: 아래 표 3과 같이 최종 처방하여 제조하였다.
아스퍼질러스 나이거 F22 흡착식 입제(GR) 제형 제조 처방전
Role Composition Input(%) Form
원제 아스퍼질러스 나이거 F22 배양액 10.0 황색 액상
증량제 입상규조토 rest 연황색 입상
Total 100.0 -
나) 제조 공정도
아스퍼질러스 나이거 F22 배양액과 입상규조토를 혼합액을 분무 드라이하여 조제하였다.
④ 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 조립식 입제(GR) 제형 제조
가) 제조 처방전: 아래 표 4와 같이 최종 처방하여 제조하였다.
아스퍼질러스 나이거 F22 조립식 입제(GR) 제형 제조 처방전
Role Composition Input(%) Form
원제 아스퍼질러스 나이거 F22 SD 파우더 10.0 황색 분상
계면활성제 분산제 2.5 연갈색 액상
습윤제 0.5 연황색 액상
보조제 붕괴제 1.5 흰색 분상
결합제 2.0 황색 분상
증량제 증량제-1 25.0 회색 분상
증량제-2 rest 백색 분상
Total 100.0 -
나) 제조 공정도
원제, 보조제 및 증량제를 균일하게 혼합하여 액상계면활성제에 적량의 물을 넣고 반죽한 후 조립, 건조, 선별하여 조제하였다.
⑤ 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 분말수화제(WP) 제형 제조
가) 제조 처방전: 아래 표 5와 같이 최종 처방하여 제조하였다.
아스퍼질러스 나이거 F22 분말수화제(WP) 제형 제조 처방전
Role Composition Input(%) Form
원제 아스퍼질러스 나이거 F22 SD 파우더 10.0 황색 분말
계면활성제 분산제-1 5.0 갈색 분상
분산제-2 1.0 흰색 분상
습윤제 3.0 흰색 액상
보존제 보존제 1.0 흰색 입상
증량제 증량제 rest 황색 분상
Total 100.0 -
나) 제조 공정도
원제, 계면활성제, 보조제, 증량제를 혼합 및 분쇄하여 조제하였다.
2. 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 균주 기초 제형을 이용한 토마토 뿌리혹선충병 방제 활성 조사
상기와 같이 조제한 액상수화제(SC), 액상현탁제(SM), 흡착식입제(흡착식 GR), 조립식입제(조립식 GR), 분말수화제(WP) 총 5가지 제제와 배양액의 생체 내(in vivo) 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제활성을 조사하였다. 구체적으로, 앞서 설명했던 방법으로 직경 9.5cm 플라스틱 포트에 멸균한 모래 400g을 넣고 온실에서 3주 동안 자란 토마토 유묘를 옮겨 심었다. 포트당 선충 10,000 알을 접종하였으며, 한시간 후 아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 배양액과 상기와 같이 조제한 5가지 제형을 입제를 제외한 제제의 경우 멸균수로 100배 및 50배 희석하여 포트당 20㎖씩 토양관주 하였으며, 입제의 경우 토양 혼화처리하였다. 시료의 처리는 일주일 간격으로 2회 처리하였으며 입제의 경우 2차 처리시에는 물에 현탁하여 처리하였다. 대조구로 올스타(a.i. Abamectin 1.8%) 3,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로 멸균수를 처리하였다. 실험은 5 반복을 수행하였으며, 선충 알 접종 6주 후 식물체의 뿌리를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 Taylor and Sasser (1978, Identification and Control of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, North Carolina State University: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, p 111) 방법에 따라 뿌리혹 지수를 조사하였다. 뿌리혹 지수는 0-5단계 (0은 0%, 1은 1-20%, 2는 21-40%, 3은 41-60%, 4는 61-80%, 5는 81-100%)를 적용하여 조사하였다.
그 결과, 도 7과 같이 F22 균주의 분말수화제(WP) 100배 및 50배의 처리구에서 각각 16%와 64%의 농도 의존적으로 높은 방제가를 나타내었다. 따라서 제품 개발시 분말수화제 제형으로 조제했을 때보다 우수한 방제활성을 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 6. 균주 배양여액의 다양한 당근뿌리혹선충과 소나무재선충에 대한 방제활성 분석
아스퍼질러스 나이거(A. niger) F22 균주의 다양한 식물기생선충병에 대한 방제활성을 조사하기 위해 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla)과 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 방제활성을 조사하였다.
당근뿌리혹선충과 소나무재선충은 서울대학교 응용생물학과 김영호 교수 연구실에서 유충을 분양받아 실험을 수행하였다. 당근뿌리혹선충과 소나무재선충 2령 유충은 100 마리/100㎕ 농도로 조제한 후 96-웰 마이크로플레이트에 80㎕의 선충 유충현탁액을 넣고 배양여액을 20㎕ 넣어 20% 농도로 처리하였다. 그런 다음 20% 처리구에서 20㎕를 취해 80㎕의 선충유충 현탁액이 들어있는 웰에 처리하여 1/4 희석된 5% 농도가 되도록 처리하였다. 이와 같은 방법으로 20%, 5%, 1% 농도로 선충 2령 유충에 대한 치사활성을 조사하였다. 시료 처리 후 당근뿌리혹선충과 소나무재선충은 25℃ 배양기에 보관한 다음 24시간 후 아래와 같은 식을 이용하여 살선충 활성을 조사하였다.
살선충 활성(%)= [죽어있는 선충의 수/(살아있는 선충의 수 + 죽어있는 선충의 수)]×100
그 결과, 아스퍼질러스 나이거 F22 균주는 배양여액 20%, 5%, 1% 처리시 당근뿌리혹선충에 대해 99.1%, 98.4%, 80.9%의 살선충 활성을 보였으며 소나무재선충의 경우 79.7%, 18.3%, 7.5%의 살선충 활성을 보였다. 따라서 아스퍼질러스 나이거 F22 균주는 토마토뿌리혹선충(M. incognita)뿐만 아니라 당근뿌리혹선충(M. hapla)과 소나무재선충(B. xylophilus)에도 우수한 살선충 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 특히 당근뿌리혹선충에 대해 강력한 살선충 활성을 갖는 것으로 확인되었다(도 9).
한국생명공학연구원 KCTC12771BP 20150318
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Claims (10)

  1. 식물기생선충에 대해 살선충 활성을 가지는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) F22 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 나이거 F22 균주는 기탁번호가 KCTC 12771BP인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 또는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 및 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 또는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)인 것을 특징으로 하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물 제제는 분말수화제로 제형화된 것을 특징으로 하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제.
  8. 제5항의 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물기생선충을 방제하는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 균주를 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 식물기생선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법.
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