KR102248558B1 - 식물 병원성 진균에 항진균활성을 갖는 균주 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 및 이의 용도 - Google Patents

식물 병원성 진균에 항진균활성을 갖는 균주 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하고, 이를 통해 식물 병원성 진균을 방제하는 방법을 제공하고자 한다.

Description

식물 병원성 진균에 항진균활성을 갖는 균주 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 및 이의 용도{Paenibacillus polymyxa JE201 with antifungal activity against phytopathogenic fungi and uses thereof}
본 발명은 식물 병원성 진균 방제용 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 식물 병원성 진균의 방제 방법에 관한 것이다.
현재 상용화되어 있는 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물 생육 증진 등의 효과를 가지고 있는 미생물 제제가 있으며 현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 숫자도 줄어들고 있는 실정이므로 이를 대체할 수 있는 미생물 제제가 요구되고 있다.
취나물을 재배하는 농가에서 가장 큰 피해가 발생하는 병으로는 점무늬병이 있는데, 이를 방제하기 위해 사용되는 스트로빌루린계 농약의 경우 2015년 잔류농약 검사에서 가장 많이 검출된 농약으로서, 이를 대체할 수 있는 친환경적 방제를 할 수 있는 균주 개발이 필요하였다.
본 발명에서는 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하고, 이를 통해 식물 병원성 진균을 방제하는 방법을 제공하여 스트로빌루린계 농약과 같은 기존의 화학 농약 및 비료를 대체하고자 한다.
본 발명에서는, 식물 병원성 진균 방제용 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 전라북도 정읍에서 분리된 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물은 취나물인 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 병원성 진균은 셉토리아 속(Septoria sp.), 알터나리아 속(Alternaria sp.), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 아쿠타튬(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 및 스템필리움 속 (Stemphylium sp.) 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주일 수 있다.
본 발명에서는, 상기 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명에서는, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주를 포함하는 미생물 제제, 및 상기 균주의 배양액을 포함하는 미생물 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원성 진균의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 전라북도 정읍에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물은 취나물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 병원성 진균은 셉토리아 속(Septoria sp.), 알터나리아 속(Alternaria sp.), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 아쿠타튬(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 및 스템필리움 속 (Stemphylium sp.) 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 처리하는 단계는 상기 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 미생물 제제 중 어느 하나 이상을 침지, 관주 또는 분무하는 방식으로 처리하는 단계일 수 있다.
본 발명은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 이용하여, 식물 재배시 사용되는 화학적 농약의 처리 횟수를 줄일 수 있다.
또한, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 이용하여, 식물 점무늬병에 대한 농가의 피해 감소시킬 수 있다.
유기농 식물 재배 시 페니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa) JE201 균주를 사용함에 따라, 생산량을 높일 수 있다.
또한, 점무늬병 뿐만 아니라 다른 식물병에 대해서도 넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내어 범용적으로 사용이 가능하다.
도 1은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 16S rRNA 염기서열을 통한 계통유전학적인 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 취나물 잎을 채취한 후 취나물 잎의 표면을 세척한 사진이다.
도 4는 고압멸균기(Autoclave)에서 멸균한 후에 페트리디쉬에 치상한 사진이다.
도 5는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 셉토리아 속(Septoria sp.) 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 배양 배지의 종류에 따른 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주의 생육 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 배지의 pH에 따른 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생육을 나타낸 것이다.
도 8은 배양 온도에 따른 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생육을 나타낸 것이다.
도 9는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 취나물 잎배지에 획선으로 도말한 사진이다.
도 10a는 탈지유한천(Skim Milk Agar)에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 프로테아제(Protease)활성을 나타낸 것이다.
도 10b는 CMC(carboxymethylcellulose)배지에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 셀룰라아제(Cellulase)활성을 나타낸 것이다.
도 11은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 배양한 배양액의 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아억제 효과를 나타낸 것이다.
도 12a는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 처리한 배양액에서, 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아상태를 관찰하여 나타낸 것이다.
도 12b는 무처리(control)한 배양액에서, 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아상태를 관찰하여 나타낸 것이다.
도 13a 는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주만을 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13b는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 알터나리아 속(Alternaria sp.) KACC 42698 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13c는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea KACC 40574 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13d는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 콜레토트리쿰 아쿠타튬(Colletotrichum acutatum) KACC 40042 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13e는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) KACC 40032 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13f는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici) KACC 40157 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13g는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri) KACC 40196 균사를 5mm의 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13h는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 리족토니아 솔라니(Rhizoctonai solani) KACC 40101 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13i는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 스템필리움 속(Stemphylium sp.) KACC 42222 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 13j는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) KACC 40582 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 명세서에 개시된 실시예들을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고 자 한다. 상세한 설명, 도면들 및 청구항들에서 상술하는 예시적인 실시예들은 한정을 위한 것이 아니며, 기재된 실시예들과 다른 실시예들이 이용될 수 있으며, 여기서 개시되는 기술의 사상이나 범주를 벗어나지 않는 한 다른 변경들도 가능하다.
개시된 기술에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 개시된 기술의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 개시된 기술의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용된 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 개시된 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석 될 수 없다.
식물의 재배와 관련하여, 현재 유기질, 화학비료의 과다사용에 의해 토양의 오염, 연작장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등의 문제가 발생되어, 생산물의 품질저하, 농가의 소득 저하 등의 부작용이 나타나고 있다. 중요한 식물 영양분인 질소(N)는 이러한 화학 비료의 사용에 의해 공급되어 왔으나, 더 높은 수확량을 유지하기 위한 화학 비료의 과잉 이용은 낮은 투입으로 높은 생산성을 요하는 지속 가능한 농업의 원리에 반하는 문제점과, 환경적인 문제가 있었다.
이와 같은 문제를 해결하기 위하여 화학비료를 대체할 수 있는 수단으로, 농업환경 및 생태계 부담을 최소화하면서 안전한 먹거리를 해결하는 생물학적 방법이 요구된다. 이에 따라 본 발명에서는, 상기 생물학적 방법으로 식물 병원성 진균을 방제할 수 있는 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제는 식물에 작용하여 식물 병원성 진균을 방제한다.
본 명세서에서 "식물"은 식물계에 속하는 임의의 살아있는 유기체 (즉, 식물계 내의 임의의 속/종)를 지칭하여, 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼 및 녹조류와 같으나 이에 제한되지는 않는다. 따라서 미생물 제제가 적용될 수 있는 대표적인 식물로 고추, 브라시카, 구근 채소, 곡물, 시트러스, 목화, 조롱박, 과실 채소, 잎 채소, 콩과식물, 오일 종자 식물, 땅콩, 뿌리 채소, 괴경 채소, 구경 채소, 핵과류, 담배, 딸기 및 다른 장과류, 및 다양한 관상식물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에 있어서, 본 발명의 취나물에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 “배양액”은 균주를 배지에 접종하고 일정시간 배양하여 얻은 결과물로서, 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액, 상기 배양액, 여액, 상기 세포 파쇄액 등을 농축한 농축액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 생균제 또는 항균용 조성물은 고체배지 배양물, 또는 상기 배양액의 건조물 또는 추출물 등의 배양물을 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 나아가 적합한 부형제 또는 담체(열성유전자를 이형접합의 상태로 가지고 있는 개체)를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 미생물 제제는 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명의 미생물 제제는 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼, 녹조류, 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 식물 병원성 진균을 방제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물은 취나물일 수 있다. 그러나 상기 실시예의 식물에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 식물의 항진균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하며, 상기 미생물 제제를 이용하여, 식물 병원성 진균을 방제하는 방법을 제공한다.
도 1은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
상기 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시된다.
본 발명에서의 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 상기 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자 염기서열을 포함할 수 있다.
도 2는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 16S rRNA 염기서열을 통한 계통유전학적인 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 미생물 제제는, 식물의 항진균활성을 갖는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물에 당해 분야에서 식물에 처리하는 다른 임의의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일례로, 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 또는 식물 영양제는 화학물질 또는 박테리아의 또다른 균주 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이에 더해, 제초제, 살균제, 살충제, 비료를 더 포함할 수도 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물 성장 조절제에는 유익한 다른 미생물들, 미생물 활성물질 및 유기 비료가 포함될 수 있다. 이에 더해, 화학비료가 포함될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
식물에 항진균활성을 갖는 다른 미생물들에는 기존 균주인, 페니바실러스 렌티모버스(Paenibacillus lentimorbus), 스트렙토마이세스 코스타리카너스(Streptomyces costaricanus), 페니바실러스 페오리에(Paenibacillus peoriae), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및/또는 슈도모나스 오티티디스(Pseudomonas otitidis) 가 포함될 수 있다. 그러나 상기 미생물에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 활성물질에는 효소 전구물질, 미생물 대사물질, 유기산, 탄수화물, 효소 및/또는 미량원소 등이 포함될 수 있다. 예를 들면, 미생물 활성물질에는 효모 자가용해질과 같은 가공된 효소 산물, 부식질(지표 및 땅 속에 존재하는 생물 이외의 유기물) 재료들, 해초 추출물, 전분, 아미노산, 그리고 아연, 철, 구리, 망간, 브롬, 몰리브덴과 같은 미량원소 등이 포함될 수 있다. 그러나 상기 미량원소에 한정되는 것은 아니다.
유익한 다른 미생물들, 미생물 활성물질 그리고 유기 비료는 상기에서 설명된 것과 동일할 수 있다. 화학비료에는 식물 생육을 지원하기 위하여 질소, 인, 및 칼륨 영양소를 제공할 수 있는 다양한 화학물질이 포함될 수 있다. 예를 들면, 화학비료에는 요소, 인산칼슘, 인산칼륨 및 혼합형 질소-인산-칼륨(N-P-K) 비료가 포함될 수도 있다. 화학비료에는 해당분야에 공지된 다른 재료들도 포함될 수 있다.
본 발명은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식물에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원성 진균의 방제 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 처리하는 단계는, 상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주, 상기 균주를 배양한 배양액 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주 또는 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 관주 또는 종자를 배양액 및 미생물 제제에 담가 접종할 수 있다. 상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 전라북도 정읍에서 분리된 것일 수 있다. 상기 식물은 취나물일 수 있다. 그러나 상기 접종 방법에 한정되는 것은 아니다.
또한, 식물 병원성 진균은 셉토리아 속(Septoria sp.), 알터나리아 속(Alternaria sp.), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 아쿠타튬(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 및 스템필리움 속 (Stemphylium sp.) 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 방법은 미생물 제제를 식물의 수명 주기 동안 임의의 시점에, 식물의 수명 주기의 하나 이상의 단계 동안, 또는 식물의 수명 주기에서 정기적인 간격으로, 또는 식물의 수명 전체에 걸쳐 계속적으로 적용하는 것을 포함한다. 따라서 미생물 제제는 필요에 따라 적용될 수 있다. 예를 들어 미생물 제제는 식물에게 성장 동안, 개화 전 및/또는 개화하는 동안, 및/또는 종자 발생 전 및/또는 종자가 발생하는 동안 적용될 수 있다. 일례로, 미생물 제제는 식물이 한 위치에서 또 다른 위치로, 예컨대 온실 또는 온상에서 필드로 이식되기 전, 동안 및/또는 직후에 적용될 수 있다. 또 다른 일례로, 각각의 미생물 제제는 식물에 원하는 간격 기간으로 다수 회 적용될 수 있다.
상기 식물체 주변의 토양과 관련하여, 본 발명이 적용되는 주변 영역이란, 본 발명의 미생물 제제가 효과를 발휘할 수 있는 범위를 의미하는 것으로, 지상 및 지하를 모두 포함한다. 예를 들어 식물, 식물 부분 또는 과실 주위의 약 2m 이내, 약 1m 이내, 약 70㎝이내, 약 50㎝ 이내, 약 25㎝ 이내, 약 10㎝ 이내 또는 약 5㎝ 이내의 영역일 수 있다. 그러나 상기 영역에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물 병원성 진균의 방제 방법은 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼, 녹조류, 외떡잎 식물, 및 쌍떡잎 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 식물의 가뭄 스트레스 저감시키는 식물의 가뭄 스트레스 저감 방법이다. 상기 식물은 일 실시예로서, 본 발명의 취나물에 적용될 수 있다.
본 발명이 적용되는 식물의 부위는 제한되지 않는다. 따라서, 식물 전체는 물론, 식물의 부분 예를 들어 씨앗, 새순, 줄기, 뿌리, 잎, 과실, 이들의 전체는 물론 이들의 일부를 모두 포함한다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 취나물 점무늬병균 방제 균주 선발
대치배양법을 통해 점무늬병균에 대해 항균활성을 나타내는 균주를 선발하기 위해 12개 지역 토양에서 미생물을 순수분리하여 실험에 사용하였다.
하기 표 1은 상기 12개 지역 토양에서 분리한 미생물의 정보를 나타낸 것이다.
지역(Region) 근원(Origin) 분리번호
(No. of isolates)
숙주(Host) 소스(Source)
담양 양배추(Cabbage) BS* 21
순창 고추(Pepper) BS 32
장승 밭(Follow field) BS 23
정읍 양배추(Cabbage) RS, BS 48
광주 밭(Follow field) BS 28
논산 밭(Follow field) RS, BS 12
부여 취나물(Chwinamul) RS, BS 35
익산 밭(Follow field) BS 7
청양 고추(Pepper) BS 6
순천 취나물(Chwinamul) R, BS 17
보령 취나물(Chwinamul) BS 16
광양 취나물(Chwinamul) BS 11
계 256
상기 표의 소스(Source)에서 BS(Bulk soil)는 벌크 흙을 나타내고, RS(Rhizosphere soil)는 근권 토양을 나타내며, R(root)은 뿌리를 나타낸다.
도 3은 취나물 잎을 채취한 후 취나물 잎의 표면을 세척한 사진이고, 도 4는 고압멸균기(Autoclave)에서 멸균한 후에 페트리디쉬에 치상한 사진이다.
취나물 점무늬병균 셉토리아 속(Septoria sp.) BM2 의 포자를 생성하기 위해 다음과 같이 취나물 잎배지를 만든다. 먼저, 취나물 잎배지는 건전한 취나물 잎을 채취하여 흐르는 물로 표면을 약 3회 세척한 후, 가로 1 내지 10cm, 세로 1 내지 10cm로 잘랐다. 이후, 고압멸균기에서 121℃에서 15분 동안 살균하는 조건으로 멸균하였다. 상기 멸균과정을 통해 멸균된 취나무 잎을 페트리디쉬에 치상한 후 멸균한 물한천배지(Water agar)를 부어서 만들었다.
점무늬병균 셉토리아 속(Septoria sp.) BM2의 균체를 분쇄기로 갈아서 상기 취나물 잎배지에 도말하였다. 상기 셉토리아 속 BM2 균체는 3주~4주에 10mm~13mm 자랄 정도로 균사생장 속도가 느리다. 따라서, 본 실험예에서는 셉토리아 속 BM2 균체의 생장속도를 촉진시키기 위해 상기 셉토리아 속 BM2 균체를 분쇄기로 갈아서 도말하였다. 상기 BM2 균체를 도말한 상기 취나물 잎배지를 25℃조건에서 7일간 배양하여 상기 취나물 잎배지 표면에 형성된 분생자각과 분생포자를 육안으로 확인하고, 멸균수를 이용하여 포자를 수거하여 실험에 사용하였다.
이후, 수거된 상기 포자를 1 x 105conidia/ml 농도로 희석하여 PDA(Potato dextrose agar) 배지에 500㎕씩 고르게 도말하고, 그 위에 순수분리한 미생물 배양액을 50㎕ 접종한 페이퍼 디스크(paper disc)를 3개씩 치상한 다음 25℃로 세팅된 배양기에 7일간 배양한 다음, 균사생장이 억제되는 저지대를 육안으로 확인하였다.
상기 12개 지역 토양에서 순수분리한 미생물을 이용하여 상기 점무늬병균 셉토리아 속(Septoria sp.) BM2 에 대해 대치배양을 진행하고 저지대를 확인한 결과, 전라북도 정읍에서 분리된, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주가 가장 큰 저지대를 형성하였다.
도 5는 상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 셉토리아 속(Septoria sp.) 균주의 포자를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다.
실험예 2: 선발 균주(페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주)의 특성분석
도 6은 배양 배지의 종류에 따른 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주의 생육 결과를 나타낸 것이다.
페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 배지에 따른 생장속도를 관찰한 결과 TSB(Typticase soy broth) 배지에서 흡광도(OD600)값이 가장 높게 측정되었으며, 이에 따라, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생성량이 가장 높다고 판단할 수 있었다. 또한, 흡광도값의 기울기도 가장 가파르므로 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생장속도도 가장 빨랐다.
도 7는 배지의 pH에 따른 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생육을 나타낸 것이다.
페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 pH에 따른 생장변화를 조사한 결과 최적 pH는 7.0이었지만, pH 9.0까지의 범위에서도 왕성한 생육을 보였다. 도 7에 나타난 바와 같이 pH가 9.0인 조건에서 배양한 경우가, pH가 7.0인 조건에서 배양한 경우보다 균주의 생장은 우수하였다. 그러나, 항균활성능력의 경우, pH가 7.0인 조건에서 배양한 경우보다 pH가 9.0인 조건에서 배양한 경우가 항균활성능력이 떨어져서 최적 pH를 7.0으로 표기하였다.
도 8은 배양 온도에 따른 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 생육을 나타낸 것이며, 도 9는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 취나물 잎배지에 획선으로 도말한 사진이다.
배양 온도에 따른 균주 생장을 검정하는 방법으로, 획선평판법을 사용하였다. 상기 방법으로 도말한 배지를 온도별로 생장시키고, 균주의 생장 폭을 측정하였다. 상기 생장 폭이 큰 경우, 최적온도로 판단하였다.
그 결과, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 최적 생육온도는 28℃이였으며, 25℃℃조건에서 생육이 왕성하였으나, 50℃이상에서는 전혀 생육하지 못하였다.
JE201 균주의 경우 배양 시작 후, 18h~30h 경 최대로 증식하였으며, 배양 시작 후 36h~40h 경과 시 정체기를 거쳐 사멸기로 들어가는 것으로 확인되어 최적 배양시간은 40h~48h 으로 결정하였다.
실험예 3: 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 프로테아제(Protease) 및 셀룰라아제(Cellulase) 활성 조사.
도 10a는 탈지유한천(Skim Milk Agar)에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 프로테아제(Protease)활성을 나타낸 것이다.
페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 프로테아제 활성을 조사한 결과 클린 존(Clean zone)이 11.8mm~13.5mm로 나타났고, 상기 클린 존의 길이를 통해, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 강한 프로테아제 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
도 10b는 CMC(carboxymethylcellulose)배지에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 셀룰라아제(Cellulase)활성을 나타낸 것이다.
페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 셀룰라아제 활성을 조사한 결과 클린 존(Clean zone)이 13.2mm~15.4mm로 나타났고, 상기 클린 존의 길이를 통해, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 강한 셀룰라아제 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
실험예 4: 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주 배양액의 점무늬병균 포자발아억제 효과
도 11은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 배양한 배양액의 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아억제 효과를 나타낸 것이다.
보다 상세하게는, 상기 도 11은 취나물 잎배지에 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 대조구(무처리구), 배양액, 배양여액 및 필터여액을 각각 투여하고, 점무늬병균(Septoria sp.)를 접종한 후, 24시간 및 72시간 후의 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아율을 나타낸 것이다.
상기 도 11에서 '컨트롤(control)'로 표시되는 대조구는 아무 처리도 하지 않은 것을 나타내고, 상기 도 11에서 '배양액'은 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 배양한 것을 나타내며, 상기 도 11에서 '배양여액'은 배양 과정을 거친 상기 배양액에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 제거한 것을 나타내고, 상기 도 11에서 '필터여액'은 상기 배양여액을 0.25㎛ 필터에 통과시킨 것을 나타낸다. 상기 필터여액은 0.25㎛의 필터를 이용하여 상기 배양여액을 걸러냈기 때문에, 배양여액 내에 남아있는 미생물 파편이나 잔재물 등이 제거된다.
페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 배양액과 배양여액 및 필터여액의 점무늬병 포자의 발아율을 조사한 결과, 24시간 경과 시 대조구(무처리구)는 약 87%의 포자 발아율을 나타냈고, 필터여액의 경우 약 34%의 포자 발아율을 나타냈으며, 배양액과 배양여액의 경우 포자가 발아를 하지 못하였다.
실험시작 후 72시간 경과 시, 대조구(무처리구)는 100%의 포자 발아율을 보이는 것과 달리, 필터여액의 경우 82%의 포자 발아율을 나타냈으며, 배양액과 배양여액의 경우, 약 23%의 포자 발아율을 나타냈다.
도 12a는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 처리한 배양액에서 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아상태를 관찰하여 나타낸 것이고, 도 12b는 무처리(control)한 배양액에서 취나물 점무늬병균(Septoria sp.)의 포자발아상태를 관찰하여 나타낸 것이다.
실험예 5: 기타 식물병원성 진균에 대한 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주의 항진균활성
도 13a는 알터나리아 속(Alternaria sp.) KACC 42698 균주를 5mm의 코르크보어(corkborer)를 이용하여 배양한 것으로, 도 13a 와 비교를 하는 것으로, 대조구(control)이다.
하기 실험에서는, 균체의 포자를 수확하여 배지에 처리하였다. 이 때, 균체를 직접 처리하지 않고 포자를 처리하였는데, 균체를 갈아서 처리할 경우 배지에 골고루 도말되지 않는다는 단점이 존재하여, 균체를 직접 처리하지 않고 포자를 처리하였다. 다만 도 13g의 경우, 5mm의 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내어 처리하였다.
상기 처리시에는 PDA(Potato dextrose agar) 배지 중앙에 식물병원성 진균을 5mm의 코르크보어(corkborer)를 이용하여 치상하고, TSB(Trypticase soy broth) 배지에 배양한 페니바실러스 폴리믹사 JE201균주를 50㎕씩 접종한 페이퍼 디스크(paper disc)를 배지당 3개씩 치상하고, 5~7일 후에 생성된 저지대를 조사하였다. 조사결과는 도 13b 내지 도 13j에서 후술한다.
도 13b는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 점무늬병을 일으키는 알터나리아 속(Alternaria sp.) KACC 42698 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주를 알터나리아 속 균주에 처리한 경우, 대조구 대비 균사생장 억제력이 있는 것으로 나타났다.
도 13c는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 ?F빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea KACC 40574 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13c에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주 주위로 저지대가 명확히 형성되었는 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 보트리티스 시네레아 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13d는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 아쿠타튬(Colletotrichum acutatum) KACC 40042 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13d에서, 콜레토트리쿰 아쿠타튬 균주는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 이격되어 포자를 형성한 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 콜레토트리쿰 아쿠타튬 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13e는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 풋마름병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) KACC 40032 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13e에서, 푸사리움 옥시스포럼 균주는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 이격되어 포자를 형성한 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 푸사리움 옥시스포럼 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13f는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 고추 역병을 일으키는 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici) KACC 40157 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13f에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주 주위로 저지대가 명확히 형성되었는 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 파이토프토라 캡사이시 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13g는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 곰취 역병을 일으키는 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri) KACC 40196 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13g에서, 파이토프토라 드레취슬레리 균주는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 이격되어 균사를 형성한 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 파이토프토라 드레취슬레리 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13h는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 뿌리썩음병을 일으키는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonai solani) KACC 40101 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13h에서 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주 주위로 저지대가 명확히 형성되었는 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 리족토니아 솔라니 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13i는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 잎마름병을 일으키는 스템필리움 속(Stemphylium sp.) KACC 42222 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13i에서, 스템필리움 속 균주는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 이격되어 포자를 형성한 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 스템필리움 속 균주에 대해 항진균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
도 13j는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주와 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) KACC 40582 균사를 코르크보어(corkborer)를 이용하여 일정크기로 떼어내고, 이를 대치배양한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 13j에서는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주가 저지대를 형성하지도 않고, 스크레로티움 롤프시 균주는 원형을 그대로 유지하며 자란 바, 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 스크레로티움 롤프시 균주에 항균활성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
농업생명공학연구원 KACC81114 20191212
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Claims (10)

  1. 식물 병원성 진균인 셉토리아 속(Septoria sp.), 알터나리아 속(Alternaria sp.), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri), 및 스템필리움 속(Stemphylium sp.) 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 방제하는 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) JE201 균주(KACC 81114BP).
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주(KACC 81114BP).
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주는 전라북도 정읍에서 분리된 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주(KACC 81114BP).
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 식물은 취나물인 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주(KACC 81114BP).
  5. 삭제
  6. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
  7. 페니바실러스 폴리믹사 JE201 균주(KACC 81114BP), 상기 균주의 배양액, 상기 균주를 포함하는 미생물 제제, 및 상기 균주의 배양액을 포함하는 미생물 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하고, 식물 병원성 진균인 셉토리아 속(Septoria sp.), 알터나리아 속(Alternaria sp.), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 드레취슬레리(Phytophthora drechsleri), 및 스템필리움 속(Stemphylium sp.) 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 방제하는 방제 방법.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 식물은 취나물인 식물 병원성 진균의 방제 방법.
  9. 삭제
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 처리하는 단계는 상기 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 미생물 제제 중 어느 하나 이상을 침지, 관주 또는 분무하는 방식으로 처리하는 단계인 식물 병원성 진균의 방제 방법.

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